Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:43:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2003 / Resumo: A expressão precoce dos genes de expressão imediata constitui uma característica fundamental do miocárdio durante o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca. O gene de expressão imediata c-jun codifica um fator de transcrição que tem sido apontado como um importante regulador da resposta hipertrófica em miócitos cardíacos. Neste estudo, investigamos se a sobrecarga pressora aguda ou o tratamento com fenileftina estimulou a transcrição de c-jun em miócitos cardíacos e avaliamos a importância dos fatores de transcrição da família MEF2 neste processo. Experimentos de immunoblotting e imunohistoquímica demonstraram que MEF2 é bastante expresso no miocárdio de ratos e é localizado predominantemente no núcleo de miócitos cardíacos. Ensaios de "gel shift" de extratos nucleares revelaram um aumento significativo na afinidade de MEF2 pelo DNA após 1 e 2 horas de sobrecarga pressora. Demonstramos também que a sobrecarga pressora induziu a uma translocação nuclear progressiva e ativação de ERK5. Experimentos de co-imunoprecipitação e de atividade quinase in vitro indicaram que a atividade da ERK5 foi paralela a uma maior associação entre ERK5/MEF2 e a uma maior capacidade da ERK5 fosforilar MEF2 in vitro. Ensaios de gene repórter utilizando transfecção in vivo de plasmídeos contendo o promotor do c-jun demonstraram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento consistente na transcrição de c-jun no miocárdio de ratos. Ao se utilizar plasmídeos contendo o promotor do c-jun mutado no sítio MEF2, observamos que não houve ativação da transcrição do c-jun em resposta à sobrecarga hemodinâmica. A mutação do sítio MEF2 também aboliu a ativação do promotor do c-jun em reposta ao tratamento com fenileftina em miócitos cardíacos ventriculares de ratos neonatos. Além disto, demonstramos que a transfecção dos miócitos ventriculares de ratos neonatos com um oligodeoxinucleotídeo ERK5-antisenso inibiu a ativação do promotor do c-jun em resposta à fenileftina. Estes achados identificam MEF2 como um regulador potencial da transcrição do c-jun e sugerem que ERK5 pode ser um importante mediador da ativação do promotor do c-jun e de MEF2 em resposta a estímulos hipertróficos em miócitos cardíacos. Além de estudar a regulação da expressão de c-Jun, também investigamos a sua ativação no miocárdio submetido à sobrecarga pressora aguda. Experimentos de immunoblotting utilizando subfrações celulares e estudos de imunohistoquímica demonstraram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento concomitante na expressão de c-Jun e na fosforilação na serina-63 no núcleo de miócitos cardíacos. Observamos que a fosforilação de c-Jun foi paralela à fosforilação e translocação de JNKl para o núcleo de miócitos cardíacos. Além disto, ensaios de "gel shift" revelaram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento na atividade de ligação de c-Jun com o DNA, que se correlacionou com o aumento de sua expressão. Estes dados demonstram que c-Jun é regulado por uma combinação de expressão e fosforilação e indicam que este sinergismo amplifica a ativação de c-Jun no miocárdio de ratos submetido à sobrecarga pressora / Abstract: The early expression of immediate early genes is a fundamental feature of myocardial hypertrophy. The immediate early gene c-jun codifies a transcription factor that has been assigned to be an important regulator of the hypertrophic response in cardiac myocytes. In the present study we investigated whether pressure overload or phenylephrine treatment stimulated MEF2-dependent transcriptional activation of c-jun in cardiac myocytes. Westem blotting and immunohistochemistry analysis of rat myocardium demonstrated that MEF2 is high1y expressed in the rat heart and is predominantly located at nuc1ei of cardiac myocytes. Gel shift assays of myocardial nuclear extracts revealed a consistent DNA binding activation of MEF2 after 1 and 2 hours of pressure overload. We further show that pressure overload induced a progressive nuclear translocation and activation of ERK.5. Co-immunoprecipitation and in vitro kinase assays indicated that the activation of ERK.5 was paralleled by increased association ERK.5/MEF2 and by enhanced ability of ERK.5 to phosphorylate MEF2. Experiments with in vivo transfection of left ventric1e with c-jun promoter reporter gene showed that pressure overload induced a consistent increase of c-jun transcriptional activity in the rat myocardium. Rendering the MEF2 site of the c-jun plasmid inactive by mutation abolished the load-induced activation of c-jun promoter reporter gene. Mutation of MEF2 site also abolished the phenylephrine- induced c-jun promoter activation in neonatal rat ventricular myocytes (NRVM). In addition, we demonstrated that NRVM transfection with ERK.5 antisense oligodeoxynuc1eotide inhibited the phenylephrine-induced c-jun promoter activation. These findings identify MEF2 as a potential regulator of c-jun transactivation and suggest that ERK5 might be an important mediator of MEF2 and c-jun promoter activation in response to hypertrophic stimuli in cardiac myocytes. In addition to studying the regulation of c-Jun expression, we also investigated the activation of this transcription factor in the overloaded myocardium. Immunoblotting of subcellular ftactions and immunohistochemistry assays demonstrated that pressure overload induced a parallel increase in c-Jun expression and in serine-63-phosphorylation in nuc1ei cardiac myocytes nuc1ei. We also observed that load-induced c-Jun phosphorylation was concomitant to JNKl phosphorylation and translocation to cardiac myocytes nuclei. M;)reover, gel shift assays revealed that pressure overload promoted an increase in c-Jun DNA-binding activity, which correlated with the increase in c-Jun expression. These results show that c-Jun is regulated by a combination of increased expression and phosphorylation and indicate that the synergism of these effects might act as a mechanism to amplify c-Jun activity in the overloaded myocardium / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/312788 |
| Date | 16 April 2003 |
| Creators | Nadruz Junior, Wilson, 1973- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Franchini, Kleber Gomes, 1961-, Laurindo, Francisco Rafael Martins, Neto, Edecio Cunha, Costa, Fernando Ferreira, Coelho, Otavio Rizzi |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 172p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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