La familia de proteínas TMBIM (del inglés TransMembrane Bax-Inhibitor 1 Motive) es altamente conservada y ha sido pobremente caracterizada. Los genes de la familia TMBIM están presente en mamíferos, insectos, plantas y virus y no presentan homología aparente con los miembros de la familia BCL-2, los cuales clásicamente han sido reconocidos como los reguladores maestros de la muerte celular programada. Al igual que para los miembros de la familia BCL-2, para algunos miembros de la familia TMBIM ha sido descrito que presentan actividad antiapoptótica y la capacidad de modificar la homeostasis del Ca2+. El miembro más estudiado de la familia TMBIM es TMBIM6/BI-1. Esta proteína puede inhibir la muerte celular bajo condiciones de estrés de RE, el cual es una condición inducida por la acumulación de proteínas mal plegadas en el interior del RE. El miembro de la familia TMBIM menos estudiado es TMBIM3/GRINA y existen antecedentes de que se expresa principalmente en el sistema nervioso central. Sin embargo, se desconoce si comparte alguna de las actividades descritas para los miembros de la familia TMBIM. En esta tesis, se propuso estudiar el papel de TMBIM3/GRINA en la muerte inducida por estrés de RE. La hipótesis propuesta fue determinar si TMBIM3/GRINA puede inhibir la muerte celular inducida por estrés de RE mediante un mecanismo dependiente del control de la homeostasis del Ca2+. Los resultados obtenidos muestran que TMBIM3 inhibe la muerte celular inducida por estrés de RE y la apoptosis mediada por sobrecarga de Ca2+, sin afectar la muerte celular inducida por estímulos intrínsecos de apoptosis. La disminución de la expresión de TMBIM3 en células deficientes en TMBIM6 indujo apoptosis espontánea, lo cual podría sugerir actividades antiapoptóticas complementarias. Los niveles del ARNm de tmbim3 son altamente incrementados bajo condiciones de estrés de RE, tanto en modelos celulares, como en modelos animales. Esta regulación de los niveles del ARNm de tmbim3 son controlados por la vía de PERK/ATF4, la cual es activada bajo condiciones de estrés de RE. Además, TMBIM3 controla la homeostasis del Ca2 e interactúa físicamente con el receptor de IP3, lo cual podría explicar su actividad antiapoptótica bajo condiciones de estrés de RE. Estudios de pérdida de función en D. melanogaster revelaron que TMBIM3 y TMBIM6 tienen actividades sinérgicas respecto a la protección frente a estrés de RE. De manera similar, la deficiencia de TMBIM3 en embriones de pez zebra generó apoptosis espontánea durante el desarrollo y drásticas alteraciones en la morfología del cerebro y la viabilidad neuronal. Además, la sobreexpresión de TMBIM3 protegió a los embriones de pez zebra en condiciones experimentales de estrés de RE. Todos estos resultados permiten establecer un rol crítico de TMBIM3 en el control de la apoptosis inducida por estrés de RE, lo cual sugiere la existencia de un grupo conservado de reguladores funcionales de la muerte celular, más allá de la familia de proteínas BCL-2

Doctor en Bioquímica / El retículo endoplásmico (RE) y la mitocondria son organelos celulares que entablan una continua y dinámica conversación que permite a la célula responder coordinadamente a diversas situaciones fisiopatológicas. Datos previos de nuestro Laboratorio mostraron que ambos organelos incrementan los puntos de contacto físico durante la fase temprana del estrés de RE, permitiendo una mayor transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria y estimulando así el metabolismo de este último organelo y favoreciendo la sobrevida celular. El presente proyecto estudió la participación de proteína quinasa A (PKA) y caveolina-1 (Cav1) como agentes reguladores de esta interacción física y funcional entre el RE y la mitocondria. Como modelo de estudio se utilizaron células HeLa tratadas con tunicamicina como agente inductor de estrés de RE por 4 h. Primero, se investigó la participación de PKA en la fase temprana del estrés de RE. Esta quinasa se activó ante condiciones de estrés, medido por la fosforilación de DRP1 en Ser637 por Western blot y concomitante elongación mitocondrial (microscopía confocal). El inhibidor específico de PKA H89 previno estos cambios, comprobando que ambos son dependientes de PKA. Posteriormente, se estudió la participación de PKA en el acoplamiento RE-mitocondria a través de la medición de proximidad (microscopía confocal), contactos físicos (microscopía electrónica), transferencia de Ca2+ (microscopía de fluorescencia) y bioenergética mitocondrial (tasa de consumo de oxígeno). El papel de PKA en estos procesos se evaluó por modulación farmacológica con H89. Los resultados mostraron que la activación de PKA es necesaria para inducir la formación de contactos RE-mitocondria, y de esta forma, gatillar la respuesta adaptativa frente a estrés de RE. Luego se investigó el papel de Cav1 sobre la interface RE-mitocondria. La expresión de Cav1 abolió completamente la respuesta adaptativa frente a estrés de RE temprano, evidenciado mediante proximidad entre organelos, transferencia de Ca2+ y respiración mitocondrial. Además de alterar esta plasticidad organelar frente a condiciones de estrés, la expresión de Cav1 disminuyó significativamente la bioenergética mitocondrial basal, junto con inducir un remodelado basal de la interface RE-mitocondria medido por purificación de las membranas del RE asociadas a mitocondria (MAM). Finalmente, se determinó que la expresión de Cav1 antagonizó la señalización de PKA, impidiendo que ella fosforile a DRP1 y promueva la elongación mitocondrial en respuesta a estrés de RE. Más aún, mediante fraccionamiento subcelular, se estableció que Cav1 afectó la localización subcelular de PKA, evitando que se relocalice a las membranas microsomales en respuesta al estrés de RE. De este modo, Cav1 actúa como un regulador negativo de PKA, previniendo su activación frente a estrés de RE, evitando así la respuesta adaptativa celular / The endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria are two organelles that continuously communicate between one another. This organelle crosstalk allows mitochondria and ER to coordinate responses to a variety of physiological and pathophysiological situations. Data from a previous work show that during the early phase of ER stress, both organelles increase their contact sites, augmenting thereby calcium transfer from ER to mitochondria. This response boosts mitochondrial bioenergetics and ultimately promotes cell survival. Here, we sought to study the role of Protein Kinase A (PKA) and Caveolin-1 (Cav1) as regulators of such organelle crosstalk. As an experimental model, HeLa cells were treated with tunicamycin to induce ER stress. First, we observed that PKA was activated during early stages of ER stress, as assessed by increased phosphorylation of DRP1 at the inhibitory site Ser637 (Western blot), and that this event was followed by mitochondrial elongation (confocal microscopy). The specific PKA inhibitor H89 prevented these changes, thus confirming that they were due to PKA and not another kinase. Subsequently, we studied ER-mitochondria coupling by evaluating organelle proximity (confocal microscopy), physical contact sites (electron microscopy), Ca2+ transfer (fluorescence microscopy) and mitochondrial bioenergetics (oxygen consumption rate). PKA was again involved in these processes by pharmacological modulation using the inhibitor H89. Our results show that PKA activation is necessary to induce the formation of ERmitochondria contacts and to trigger the adaptive metabolic responses to ER stress. Next, we investigated the role of Cav1 as a modulator of the ER-mitochondria interface. Cav1 overexpression completely abolished the early adaptive response to ER stress, as assessed by evaluating the proximity between organelles, calcium transfer and mitochondrial respiration. In addition to altering organelle plasticity in response to stress conditions, Cav1 overexpression severely decreased baseline mitochondrial bioenergetics and induced basal remodelling of the ER-mitochondria interface, as determined by purification and analysis of mitochondria-associated ER membranes. Finally, we determined that Cav1 overexpression antagonizes PKA signalling, preventing PKA-dependent DRP1 phosphorylation and mitochondrial elongation in response to ER stress. Moreover, subcellular fractionation revealed that Cav1 affected PKA localization, prevented redistribution to microsomal membranes in response to ER stress, and altered the pattern of DRP1 phosphorylation. Thus, Cav1 functions as a negative regulator of PKA that precludes PKA activation during early ER stress and thereby prevents the adaptive cellular response / Fondecyt; Fondap;

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas Recombinantes / Memoria de Título de Bioquímico / La hormona GLP-1 es una reguladora importante de la homeostasis de la glucosa, favoreciendo su metabolismo en varios tejidos a través de la activación de la vía del AMP cíclico-proteína kinasa A. En las células de músculo liso vascular (VSMC), el control del metabolismo de la glucosa es esencial para la mantención de la función y el fenotipo celular, ya que al favorecer su oxidación en las mitocondrias, se previene la aparición de un fenotipo desdiferenciado, característico de patologías cardiovasculares. Un mecanismo que promueve la actividad mitocondrial es su acoplamiento con el retículo endoplásmico (RE), pues se favorece el traspaso de metabolitos y Ca2+ desde el RE a la mitocondria. Estructuralmente, el acoplamiento entre ambos organelos depende de Mitofusina-2 (Mfn-2). Existe evidencia de que una disminución en el acoplamiento entre RE y mitocondrias en VSMC conduce a la aparición de un fenotipo proliferativo, mientras que el uso de GLP-1 previene el desarrollo de este fenotipo. Además, datos de nuestro grupo de trabajo sugieren que esta hormona potencia la actividad mitocondrial. Basados en estos antecedentes, quisimos estudiar si GLP-1 era capaz de promover el acoplamiento entre RE y mitocondrias en la línea celular vascular A7r5, y evaluar el posible rol de PKA y de Mfn-2 en el fenómeno. A través de inmunofluorescencia indirecta con marcación de RE y mitocondrias, se observó un aumento en la colocalización entre ambos organelos en células estimuladas con GLP-1 (100 nM, 3 h). Además, mediante el uso de la sonda fluorescente Rhod-FF, sensible a Ca2+ mitocondrial, se determinó que la pre-incubación de estas células con GLP-1 favorecía la entrada de Ca2+ reticular a la mitocondria. En forma paralela, se determinó que el tratamiento por 3 h con GLP-1 aumentó los niveles de Mfn-2, efecto que se perdió cuando las células se pre-incubaron con el inhibidor de PKA, H-89. Finalmente, se determinó que el incremento en la colocalización entre RE y mitocondrias y el aumento en la entrada de Ca2+ reticular a las mitocondrias en respuesta al tratamiento con GLP-1, se inhibían en células pre-tratadas con H-89. Así, concluimos que la incretina GLP-1 promueve el acoplamiento funcional entre RE y mitocondrias en células de la musculatura lisa vascular, a través de un mecanismo que requiere de la activación de PKA, y presumiblemente, del aumento de la proteína Mfn-2. / The hormone GLP-1 is an important regulator of glucose homeostasis that promotes its metabolism on several tissues through a cyclic AMP-protein kinase A pathway. In vascular smooth muscle cells (VSMC) glucose metabolism is involved in the control of both cellular function and phenotype, given that promoting its oxidation in the mitochondria prevents the appearance of VSMC undifferentiated phenotype, a hallmark of cardiovascular pathologies. Mitochondrial activity is activated by their coupling with the endoplasmic reticulum (ER), which enhances metabolite and Ca2+ transfer from the ER to the mitochondria. Structurally, the coupling between these organelles depends on Mitofusin-2 (Mfn-2). A decrease on ER-mitochondria coupling in VSMC leads to a proliferative phenotype, while GLP-1 treatment prevents its appearance. Besides, data from our work group suggests that this hormone enhances mitochondrial activity. Based on this background, we evaluated whether GLP-1 modulated functional coupling between ER and mitochondria in the vascular cell line A7r5, and the involvement of PKA and Mfn-2 on this phenomenon. Inmunofluorescence analysis of ER and mitochondria stained cells revealed that GLP-1 (3 h, 100 nM) treatment increased colocalization of these two organelles. Furthermore, by using the mitochondrial Ca2+ sensitive fluorescence probe, Rhod-FF, we determined that pre-incubation of these cells with GLP-1 enhanced reticular Ca2+ entry into the mitochondria. Moreover, the treatment with GLP-1 by 3 h increased Mfn-2 levels, an effect that was prevented by the pre-incubation with the PKA inhibitor, H-89. Finally, the increment of ER and mitochondria colocalization and the increase on reticular Ca2+ entry into the mitochondria in response to GLP-1 stimulation were both abolished in H-89 pre-treated cells. Therefore, we concluded that the hormone GLP-1 promotes ER and mitochondria coupling in VSMC, through a mechanism that requires PKA activation, and presumably, an increment of Mfn-2 levels. / Fondecyt

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés en el retículo endoplásmico (RE) genera señales hacia el núcleo y citoplasma, reorganizando la homeostasis proteica e interviniendo en la decisión de vida o muerte celular. A pesar de ser ampliamente estudiada, aún se desconocen los mecanismos adaptativos iniciados en la mitocondria ante esta condición. En este trabajo se evaluó si el estrés de RE modula el acoplamiento entre la red mitocondrial y el RE, y si el cambio en esta interacción tiene repercusiones sobre el estado metabólico energético celular. Para inducir estrés de RE, células HeLa se trataron con tunicamicina (inhibidor de la glicosilación en el RE) por 1, 4 y 20 h. El contenido de ATP intracelular, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno se midieron para determinar el estado metabólico celular. La red mitocondrial y el RE se marcaron fluorescentemente y a las imágenes de microscopía confocal se les analizó la colocalización mediante los coeficientes de Manders. Para analizar la participación del citoesqueleto se utilizaron los agentes despolimerizadores nocodazol (microtúbulos) y citocalasina B (microfilamentos de actina). Tras 4 h, el estrés de RE aumentó los niveles intracelulares de ATP, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno en las células HeLa. Esta estimulación metabólica resultó transitoria, dado que el ATP, poder reductor y potencial mitocondrial disminuyeron después de 20 h de estrés. A las 4 h se observó también una redistribución mitocondrial y reticular hacia la región perinuclear, que llevó a un aumento en el acoplamiento entre ambos organelos. Esta mayor cercanía, así como la estimulación metabólica no se previnieron por citocalasina, pero sí por nocodazol. Se puede concluir entonces que el estrés de RE, en sus etapas tempranas indujo una mayor capacidad funcional de la mitocondria, asociada a su mayor cercanía con el RE. Estos cambios se llevan a cabo a través del movimiento de los organelos a lo largo de la red de microtúbulos / Endoplasmic reticulum (ER) stress triggers signals to the nucleus and cytoplasm, reorganizing protein homeostasis and intervening in the decision of life or death. Despite being highly studied nowadays, the adaptative mechanisms initiated by mitochondria upon this condition remain unknown. This work studies whether ER stress modulates the spatial coupling between the mitochondrial network and the ER, and the consequences of this interaction on the energetic cell state. To induce ER stress in HeLa cells, they were treated with tunicamycin (inhibitor of protein glycosylation at the ER) for 1, 4 and 20 h. Intracellular ATP content, intracellular reducing level, mitochondrial potential and oxygen consumption were measured to determine the metabolic cell state. The mitochondrial network and the ER were stained with fluorescent markers. Images were taken with a confocal microscope, and colocalization was analyzed with Manders’ coefficients. To determine cytoskeleton participation, two depolymerizing agents were used: nocodazole (for microtubules) and cytochalasin B (for actin microfilaments). Upon 4 h of ER stress, ATP, reducing power, mitochondrial potential and oxygen consumption increased in HeLa cells. This metabolic stimulation was transient due to ATP, reducing power and mitochondrial potential diminished upon 20 h of stress. At 4 h there was a mitochondrial and reticular redistribution towards the perinuclear region, which lead to an increase in organelle coupling. Both enhanced interaction and metabolic stimulation were prevented by nocodazole, but not by cytochalasin. In conclusion, mitochondrial function is enhanced in early states of ER stress, which is associated with enhanced spatial coupling with the ER. These changes take place by the movement of organelles along the microtubule network

Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica Área de Especialización: Proteínas y Biotecnología y Memoria para Optar al Título de Bioquímica / Para mantener la integridad, la célula debe controlar la cantidad y calidad de las proteínas. El Retículo Endoplásmico (RE) es el organelo en donde se sintetizan todas las proteínas transmembrana y la mayoría de las proteínas secretadas. Cuando se altera la homeostasis del Retículo Endoplásmico se produce una acumulación de proteínas mal plegadas en su lumen. Como respuesta a este estrés se activa una vía de señalización RE-núcleo, en la que se bloquea la expresión general, aumenta la expresión de chaperonas y se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. Un método para producir Estrés en el Retículo Endoplásmico (ERE) es la eliminación del calcio reticular, necesario para el correcto plegamiento proteico. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un sistema proteolítico que requiere la acción de chaperonas citosólicas para seleccionar, desplegar y dirigir proteínas mal plegadas al interior del lisosoma. Sus actores principales son el receptor lisosomal Lamp2A y la chaperona Hsc70. Se ha descrito la activación de AMC durante la privación prolongada de suero y durante el estrés oxidativo, pero no existen antecedentes de la activación durante el ERE, lo cual constituye el objetivo de esta tesis. Se usó como modelo de estudio células NIH3T3. En estas células se indujo ERE con Tapsigargina (TG), eliminando el calcio en el RE. Mediante western blot se comprobó la aparición de Chop, un factor transcripcional usado clásicamente como marcador de ERE. TG no aumentó la muerte celular, pero produjo un bloqueo en la división celular, deteniendo el ciclo en la etapa G1. Lo anterior se observó mediante citometría de flujo, usando yoduro de propidio como trazador. Mediante inmunocitoquímica y western blot se observó un aumento en los niveles totales de Lamp2A. Esto se relaciona al aumento de Lamp2A en la fracción lisosomal. Además la chaperona Hsc70 se relocaliza hacia la fracción lisosomal en respuesta al estímulo con TG. Estos eventos, el aumento del receptor Lamp2A y relocalización de la chaperona Hcs 70, se han relacionado anteriormente con aumento en la actividad de AMC. Células que expresan constitutivamente un iRNA contra Lamp2A, lo que las hace deficientes en AMC, aumentan la macroautofagia basal. La compensación de macroautofagia es mayor durante un evento de ERE. La mayor actividad de la macroautofagia se refleja en una menor expresión de Chop, que pudiese estar siendo degradado por macroautofagia. Células carentes de ATG5, que no activan macroautofagia, aumentan los niveles totales de Lamp2A. Este es un mecanismo compensatorio, que activa la AMC cuando la macroautofagia no está presente. Sin embargo, la TG disminuyó los niveles totales de Lamp2A. Este inesperado comportamiento puede estar ligado a la activación del proteasoma. En síntesis, esta tesis muestra el primer indicio de la activación de AMC durante un evento de ERE. Esta activación esta dada principalmente por un aumento en los niveles de Lamp2A, que solo se ha visto durante estrés oxidativo. Además muestra que las vías degradativas se comunican para eliminar las proteínas mal plegadas durante el ERE / To maintain the integrity, cells must control the quantity and quality of the proteins. Endoplasmic Reticulum (ER) is the organelle where all transmembrane protein and the most secretory protein are synthesized. Disturbances in the ER homeostasis lead to the accumulation of disfolding proteins in its lumen. In response to this stress a reticulum-nucleus signaling pathway is activated, inducing the selective expression of some genes (i.e. those related to chaperones) and the stimulation of proteolytic systems, including proteasome and macroautophagy. The removal of the calcium reticulum, necessary for the correct protein folding, produces ER stress. Chaperone-mediated autophagy (CMA) is another proteolytic system that requires the action of cytosolic chaperones to select, unfold and pull the unfolded substrate into the lysosomes. Its principal actors are the lysosomal receptor Lamp2A and the chaperone Hsc70. CMA is activated by long serum deprivation and oxidative stress. However it remains unknown whether CMA is stimulated during the ER stress, which it is the main aim of this thesis. The NIH3T3 cells were the study model used. In these cells, Thapsigargin (TG) induces ER stress through the removal ER calcium. Western blot showed an increase in the Chop level, a classic ER stress transcriptional factor. TG didn’t stimulate cell death but arrested cell cycle at G1 stage. This was showed through FACS, using propidium iodide dye. Immunocytochemistry and western blot studies showed that TG increases the Lamp2A total levels. Another observation is the increase of Lamp2A level in the lysosomal fraction. Also, we have seen increases in the hsc70 localization in to the lysosomal fraction. These events, the rise in Lamp2A levels and Hsc70 lysosomal localization, previously have being related with an increase in the CMA activity. Constitutive Lamp2A-siRNA cells, CMA deficient cells, increased basal macroautophagy. Also this macroautophagy compensation is most important during ER stress. The higher macroautophagy activity was associated with low expression of Chop, showing a probable degradation the Chop by macroautophagy. ATG5 knock out cells, macroautophagy deficient cells, showed an increase in the Lamp2A total levels. This cells revealing a compensatory effect of the CMA when the macroautophagy is inactive. However, TG produces a decrease of the levels of Lamp2A.This unexpected behavior is probably related to the proteasome activation. In synthesis, this tesis show by the first time the CMA activation during ER stress. This activation is related to the total Lamp2A increase, only before seen in oxidative stress. Also we show the connection between the proteolytic pathways in the unfolding protein degradation, during ER stress

Memoria para optar el título de Bioquímico / La mitocondria y el retículo endoplasmático (ER) se encuentran física y funcionalmente acoplados. Los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son los principales canales de Ca2+ responsables de la liberación de este ión desde el ER y de la comunicación con la mitocondria. En la mitocondria, el encargado de permitir la entrada de Ca2+ es el unitransportador de Ca2+mitocondrial (MCU), que regula el paso del ion desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial, permitiendo el funcionamiento de varias enzimas y transportadores fundamentales para mantener la bioenergética celular. La disrupción de la comunicación ERmitocondria genera una crisis bioenergética que activa una respuesta autofágica dependiente de la kinasa activada por AMP (AMPK). En cáncer se ha asumido que la glicólisis es capaz de suministrar toda la energía que las células requieren. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la mitocondria juega un papel fundamental en tumorigénesis. La migración e invasión son dos propiedades de las células tumorales que son parte de la cascada invasión-metástasis, que le permitirán a las células dejar el tumor primario para colonizar otros tejidos. Estas propiedades requieren altos niveles de energía. Sin embargo, el papel del metabolismo mitocondrial en estos fenómenos se ha estudiado muy poco. De acuerdo a esto, nosotros hipotetizamos que una interrupción en la comunicación vía Ca2+ entre el ER y la mitocondria producirá una desregulación bioenergética que disminuirá la capacidad de migración e invasión de las células tumorales. Utilizando un inhibidor competitivo especifico del receptor de IP3 y el silenciamiento de este a través de siRNA interrumpimos la comunicación ER-mitocondria y encontramos una disminución de la función mitocondrial, que se correlaciona con una disminución en la migración e invasión in vitro de líneas celulares tumorales altamente metastásicas. Los resultados de este trabajo abren nuevas oportunidades terapéuticas para tratar la generación de metástasis las que hasta el día de hoy son consideradas intratables / Mitochondria and the Endoplasmatic Reticulum (ER) are physically and functionally coupled. Inositol 1,4,5-triphosphate Receptors (IP3R) are responsible for the Ca2+ release from the ER to the cytoplasm and command mitochondria-ER communication. Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU) is responsible for allowing Ca2+ entry from the intermembrane space to the mitochondrial lumen. Ca2+ in the mitochondria activates several Kreb’s cycle’s enzymes helping to maintain cell bioenergetics. Disruptions in ER-Mitochondrial communication generate a bioenergetic crisis characterized by an AMPK-dependent autophagic response. Migration and invasion of tumor cells are high energy demanding process. Glycolysis has been assumed to being able to supply as much energy cancer cells need. However, it has been recently proven that mitochondria play a crucial role in tumorigenesis. Accordingly we hypothesize that a disrupted Ca2+ communication between the ER and mitochondria will lead to a bioenergetic crisis that will decrease migration and invasive capacity of tumor cells. Thus, we interrupted the ERmitochondrial communication by inhibiting the IP3R pharmacologically with Xestospongin B and molecularly by silencing isoforms 1 and 3 of IP3R with siRNA. We found a decrease in mitochondrial function that correlates with a decrease in vitro migration and invasion of highly metastatic tumor cell lines. The results obtained in this work open new therapeutic opportunities to treat metastasis which are currently considered untreatable / Fondecyt

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Diversas condiciones pueden producir estrés en el retículo endoplásmico, tales como la acción de compuestos, como la tapsigargina (TG) y la tunicamicina (TU) o distintas situaciones patológicas como la hipoxia, daño oxidativo o reductor, infecciones virales e hipoglicemia. Todas ellas generan una acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE), que conduce a la activación de una respuesta celular al estrés altamente conservada, evolutivamente conocida como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), la cual puede ser adaptativa, de alarma o muerte dependiendo de la intensidad y cronicidad del estímulo. La respuesta adaptativa está diseñada especialmente para restablecer la homeostasis de RE y su normal funcionamiento por medio de la inducción de genes que codifican a chaperonas, a la vía de degradación de proteínas asociada al RE (ERAD) y la degradación proteoasomal de proteínas, así como también a proteínas que aumentan la capacidad plegadora del RE. Si estas respuestas adaptativas no logran recobrar el equilibrio en el RE, se activa el programa de muerte celular de tipo apoptótico, necrótico o autofágico. Las respuestas adaptativas mencionadas operan principalmente por medio de tres vías transduccionales: IRE1, PERK y ATF6, siendo las vías IRE1 y ATF6 las involucradas en las etapas iniciales de la UPR, para restablecer la homeostasis del RE. Sin embargo al mantenerse el estímulo de estrés las tres vías se activan en conjunto para inducir genes de muerte celular como lo es GADD153/CHOP. La insulina participa en la regulación de diversos procesos celulares, entre los que se encuentran el metabolismo de la glucosa en el tejido muscular y adiposo, el de los ácidos grasos en el hígado y células grasas. Estas acciones están mediadas por medio de la activación de su receptor de membrana, el receptor de insulina (IR), el El modelo experimental utilizado fue cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos tipos de estresores, TG y TU, por 24 hrs., e insulina por 15 minutos y 24 hrs. Los resultados obtenidos mostraron que, tanto TG como TU, indujeron estrés de RE en los cardiomiocitos y que activaron el programa de muerte celular de manera dosis-dependiente, esto determinado por la expresión de la proteína GADD153/CHOP. Sin embargo no se observaron cambios en los niveles de la chaperona Grp78/BIP. La inducción de estrés de RE afectó la viabilidad celular de manera dependiente de la concentración, esto determinado por los ensayos de exclusión de yoduro de propidio (IP) y azul de tripán. Además se observó que la muerte celular posee un componente importante de apoptosis. La insulina por sí sola no indujo estrés de RE en los cardiomiocitos, sin embargo disminuyó la expresión de GADD153/CHOP de los cardiomiocitos estimulados con TG y TU. Este efecto es parcial ya que la insulina no recuperó los niveles basales de GADD153/CHOP. La inducción del estrés de RE con TU o TG en los cardiomiocitos afectó la vía transduccional de la insulina, disminuyendo la activación del receptor de insulina y de PKB/Akt, sin afectar los niveles totales de Akt. Finalmente, los resultados permiten concluir que la insulina es un regulador negativo del estrés de RE en cardiomiocitos inducida por TG y TU / Conditions like thapsigargin (TG) and tunicamycin (TU), hypoxia, reductive and oxidative damage, viral infections and hypoglycemia may produce endoplasmic reticulum stress, leading to an accumulation of misfolded proteins in the ER, and the subsequent activation of a cell stress response knows as UPR. This response can leads to cell adaptation, alarm or cell death. The adaptive response is especially designed to reestablish ER homeostasis by the induction of genes that encode chaperones, the ERAD pathway and the proteoasomal proteins degradation, as well as proteins increasing the folding capacity of the ER. However, depending of the strength or exposure time, the cell death program can be activated leading to that apoptosis, necrosis and autophagy. The adaptive response above described, can signal three independent transductional pathways: IRE1, PERK and ATF6, being IRE1 and ATF6 pathway involved in the early stages of UPR, to reestablish ER homeostasis. However a chronic stress activates cell death signaling pathway, inducing genes like GADD153/CHOP. Insulin participates in different cell processes including the regulation of glucose metabolism in muscle and adipose tissue, fatty acids metabolism in the liver and adipocytes. These actions are mediated by the activation of its membrane receptor, insulin receptor (IR), wich has an intrinsic tyrosine kinase activity and allows the activation of the following signaling cascades PI3K/PKB/Akt and MAPK/ERK. Severeal evidences have shown that TG and TU induce ER stress. However the research made on the insulin activity in the regulation of the ER stress are only in neurons, in which the inhibition of PKB/Akt is capable of induce the GADD153/CHOP expression, but the mechanism involved in this process is not fully understood. Our working hypothesis state that “Insulin attenuates the endoplasmic reticulum stress in cultured cardiomyocytes”. The experimental model was primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes exposed to the stressors, TG and TU, for 24 h and insulin for 15 minutes and 24 h. Our results showed that both, TG and TU, induced ER stress in cardiomyocytes activating the cell death program in concentration-dependent manner. This event was characterized by the expression of GADD153/CHOP. However any effect was observed in Grp78/BIP levels. ER stress induction affected the cell viability in concentration-dependent manner, was assessed by IP and tripán blue exclusion tests. We also observed that apoptosis was the type of cell death activated in our model of ER stress. Insulin itself did not induce ER strees in cultured cardiomyocytes, however decreased GADD153/CHOP expression triggered by TG and TU. This effect is partial because the insulin did not recover GADD153/CHOP basal levels. ER stress induction in cultured cardiomyocytes affected insulin signaling pathway characterized by decreased insulin receptor activation and phosphorylated PKB/Akt levels without any effect in total PKB/Akt levels. This effect was seen both with TG and TU. In summary, these results suggest that insulin receptor signaling pathway is negatively regulated by ER stressors in cultured cardiomyocytes

Doctor en Bioquímica / Herp es una proteína residente de la membrana del retículo endoplásmico que regula la degradación de proteínas a través del proteosoma. Este efecto lo ejerce principalmente regulando la formación del complejo de degradación de proteínas asociado al retículo endoplásmico (ERAD). Además, Herp se ha vinculado con la regulación del Ca2+ intracelular y citoprotección frente al estrés de retículo. Se desconoce si Herp tiene un efecto citoprotector frente al estrés oxidativo y los mecanismos por los cuales podría ejercer esta función. En esta tesis se planteó como hipótesis de trabajo que “Herp es una proteína inducida por H2O2 que regula la sobrevida celular, modulando la degradación del receptor de IP3 y la transferencia de Ca2+ a la mitocondria”. Para probar esta hipótesis se establecieron los siguientes objetivos específicos: -Establecer si el H2O2 estimula la expresión de Herp en células Hela. -Determinar si Herp regula los niveles intracelulares de Ca2+ dependientes de H2O2 -Determinar si Herp regula el traspaso de Ca+2 del retículo endoplásmico a la mitocondria por modulación del IP3R, en células Hela expuestas a H2O2. -Establecer si Herp tiene un papel citoprotector frente al H2O2 por regulación del Ca2+ intracelular. Los resultados mostraron que Herp aumenta sus niveles frente a el tratamiento con H2O2 en forma rápida, antes de los 30 min post estimulo, por un mecanismo transcripcional y traduccional. Esta respuesta es importante para la sobrevida celular frente a agentes que producen estrés oxidativo. Las células que poseen bajos niveles de la proteína Herp son más sensibles a la muerte producida por H2O2 que las células controles. También las células con menores niveles de Herp presentaron cinéticas de Ca2+ intracelular y mitocondrial diferentes en respuesta al H2O2, comparado con los controles. Estos cambios se debieron a una desregulación en los niveles del IP3R dado que Herp reguló su degradación a través de la vía proteosomal. Nuestros resultados sugieren que Herp mantiene los niveles normales de IP3R, regulando así la entrada de Ca2+ a la mitocondria. De este modo, Herp evita la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial, apertura del poro de transición mitocondrial y posterior apoptosis en respuesta a estímulos nocivos como el H2O2. Junto con lo anterior, nuestros estudios mostraron que Herp regula el metabolismo mitocondrial, lo cual tienen repercusiones en la proliferación celular y la sensibilidad de las células a antineoplásicos. Las células HeLa con bajos niveles de Herp mostraron un metabolismo mitocondrial aumentado por un mayor influjo de Ca2+ mitocondrial vía IP3R. Estas células basalmente presentaron mayores niveles del IP3R. Tanto células Hela como células U2OS con bajos niveles de la proteína Herp presentaron una mayor sensibilidad a la muerte frente a una batería de antineoplásicos, probablemente producto de los cambios metabólicos anteriormente mencionados. Estos resultados sugieren que la proteína Herp podría ser un posible blanco terapéutico contra el cáncer. En resumen, Herp regula los niveles del IP3R de forma basal en las células Hela, de esta manera mantiene la homeostasis del Ca2+ mitocondrial, regulando la apertura del poro de transición mitocondrial y la función mitocondrial. En ausencia de la proteína ocurre una desregulación en la homeostasis del Ca2+ intracelular y mitocondrial, lo que produce aumentos de la actividad mitocondrial y mayor sensibilidad de las células a agentes nocivos como el H2O2 y quimioterapéuticos / Herp is a resident membrane protein of the endoplasmic reticulum (ER) that regulates protein degradation via proteasome. This effect is primarily done by regulating the formation of the ER-associated protein degradation (ERAD) complex. In addition, Herp regulates intracellular Ca2+ levels and stimulates cytoprotection against ER stress. It is unknown whether Herp protects against oxidative stress and the molecular mechanisms involved in this action. Our working hypothesis was "Herp is a H2O2-inducible protein that regulates cell survival by modulating IP3 receptor degradation and transfer of Ca2+ into mitochondria". To test this, the following specific objectives were established: -To assess whether H2O2 stimulates Herp expression in Hela cells. -To determine if Herp regulates H2O2-dependent intracellular Ca2+ levels. -To evaluate whether Herp regulates Ca2+ transfer from the ER to mitochondria by modulating IP3R in Hela cells exposed to H2O2. -To assess if Herp has a cytoprotective role against H2O2 by regulating intracellular Ca2+ levels. The results showed that the Herp levels rapidly increase in response to exogenous H2O2 by a mechanism involving transcriptional and translational regulation. This response was important for cell survival against agents producing oxidative stress. Cells with low levels of protein Herp exposed to H2O2 were more sensitive to die than controls, showing a different intracellular and mitochondrial Ca2+ kinetics and desregulation of IP3 receptor levels. Our results suggest that Herp maintains normal levels of IP3R, thus regulating Ca2+ entry to the mitochondria. Thus Herp seems to prevent mitochondrial Ca2+ overload, mitochondrial transition pore opening and apoptosis in response to H2O2. HeLa cells with low mitochondrial metabolism Herp depicted increased mitochondrial Ca2+ influx via IP3 receptors. These cells had higher baseline levels of IP3R. Both Hela and U2OS cells with low Herp levels depicted a higher sensitivity to antineoplasic drugs due to the aforementioned metabolic changes. These results suggest that the Herp protein could be a potential therapeutic target for cancer. In summary, Herp regulates IP3 receptor basal levels in HeLa cells maintaining mitochondrial Ca2+ homeostasis and thereby regulating mitochondrial transition pore opening and cell survival / Conicyt; Fondap

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que componen alrededor del 70% del total de células del corazón. Estás células son responsables de la mantención de la matriz extracelular del corazón dando soporte mecánico a los cardiomiocitos. Cuando el corazón es dañado, se inicia un proceso de remodelamiento del tejido cardiaco que puede progresar a una insuficiencia cardiaca. Uno de los factores importantes del remodelamiento es la secreción de colágeno a cargo de los fibroblastos. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas éstas, deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (ER). Cuando aumenta la demanda de proteínas que se deben plegar, el ER entra en un estrés que gatilla una respuesta que se llama Respuesta a Proteínas Mal Plegadas (UPR). Si esta respuesta no es capaz de devolver la homeostasis a la célula, se ejecuta un proceso de apoptosis. En este estudio se determinó que el fármaco Tapsigargina es capaz de disminuir la viabilidad de cultivos de fibroblastos cardiacos de manera concentración y tiempo –dependiente a una concentración de 10 nM, además induce proteínas que son parte de la vía UPR como BiP, eIF2α, PDI, ATF4 y CHOP ésta última está muy ligada a los procesos de muerte en las células. En la literatura se ha reportado que el ácido 4-fenilbutirico (4-PBA) se comporta como una chaperona química. Demostramos que al preincubar los cultivos con 4-PBA los efectos antes mostrados por Tapsigargina quedan anulados. También se estudió la implicancia de la UPR provocada por Tapsigargina sobre la secreción de colágeno soluble y también se vieron los efectos del 4-PBA sobre la secreción de colágeno soluble los cultivos, demostrándose la capacidad del 4-PBA de modular la secreción de colágeno.

[EN] Heart failure is a multifactorial syndrome characterized by alterations in ventricular function and cardiac chambers dilation, being a cause of increase of morbidity, mortality and health costs. Dilated and ischemic cardiomyopathies are frequent causes of this syndrome. Despite the progress in treatment of heart failure, the prognosis has not improved significantly in the last years, because of that, we need a development of novel treatment strategies, given the limited efficacy of current therapies. This syndrome can be associated to alterations in heart contraction. Endoplasmic reticulum is the major intracellular calcium storage necessary for heart contraction onset. On the other hand, ion channels regulate heart contraction and are responsible for the ion currents that determine and influence the action potential of heart muscle. In this Thesis we aimed to study, in a group of patients with heart failure, the changes existing in the structural and stress response proteins of the endoplasmic reticulum, as well as the gene expression of cardiac ion channels, relating these alterations with ventricular dysfunction of these patients. Our results showed the presence of alterations in the majority of structural and stress proteins of the endoplasmic reticulum, being the structural protein RRBP1 related to ventricular dysfunction and also to the stress protein XBP1. This evidences a specific dependency between stress and structure in this organelle and an influence of structural changes in ventricular function of patients. Additionally, we showed different expression changes of a large number of cardiac ion channels through microarrays and RNA sequencing techniques. Of these channels, down-regulation of CACNG8 related to ventricular function improvement and increased levels of KCNJ2 and KCNN3 with ventricular dysfunction in dilated cardiomyopathy. In ischemic cardiomyopathy, reduced levels of TRPM7 channel were related to a better ventricular function. Differential gene expression of this category in both cardiomyopathies, could explain the changes in the different ion currents that affect the myocardial contraction process in heart failure. In conclusion, we show alterations in the expression of two key components of cardiac muscle contraction that could provide novel basis for their study and regulation as possible therapeutic targets for the improvement of cardiac contractility in patients with heart failure. / [ES] La insuficiencia cardíaca es un síndrome multifactorial que se acompaña de alteraciones en la función ventricular y dilatación de las cámaras cardíacas, siendo causa de aumento de morbilidad, mortalidad y gasto sanitario. Las miocardiopatías dilatada e isquémica son causas muy frecuentes de este síndrome. A pesar de los avances que se han producido en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, el pronóstico no ha mejorado significativamente en los últimos años. Es por ello, que existe una necesidad de desarrollar nuevas estrategias para su tratamiento, dada la eficacia limitada de las terapias actuales. Este síndrome puede estar asociado a alteraciones en la contracción del corazón. El retículo endoplásmico es el principal almacén de calcio intracelular necesario para el inicio del proceso de contracción del corazón. Por otro lado, los canales iónicos regulan la contracción del músculo cardíaco y son responsables de las corrientes de iones que determinan e influyen sobre el potencial de acción cardíaco. En esta Tesis nos planteamos estudiar, en un grupo de pacientes con insuficiencia cardíaca, los cambios existentes en las proteínas que conforman la estructura y participan en la respuesta a estrés del retículo endoplásmico, así como analizar la expresión génica de canales iónicos cardíacos y relacionar estas alteraciones con la disfunción ventricular de estos pacientes. Nuestros resultados muestran la presencia de alteraciones en la mayoría de proteínas estructurales y de respuesta a estrés del retículo endoplásmico, siendo RRBP1 la que presenta relaciones significativas con la disfunción cardíaca de los pacientes y también con la proteína de estrés XBP1. Ello evidencia una dependencia específica entre estructura y estrés de este orgánulo y una influencia de estas alteraciones estructurales sobre la función ventricular de los pacientes. Además, mostramos diferentes cambios de expresión en un gran número de canales iónicos cardíacos mediante microarrays y secuenciación de ARN. De estos canales, en la miocardiopatía dilatada encontramos que los niveles reducidos de CACNG8 se relacionan con una mejora en la función y los niveles aumentados de KCNJ2 y KCNN3 se relacionan con una mayor disfunción ventricular. En el caso de estas alteraciones en la miocardiopatía isquémica, los niveles reducidos del canal TRPM7 favorecen una mejora de la función del ventrículo izquierdo. La expresión génica diferencial de esta categoría en ambas miocardiopatías, podría explicar las alteraciones en las diferentes corrientes iónicas que afectan al proceso de contracción del miocardio en la insuficiencia cardíaca. En conclusión, demostramos la presencia de alteraciones en dos componentes clave para la contracción del miocardio que pueden proporcionar nuevas bases para su estudio y regulación como diana de posibles tratamientos para la mejora de la alteración en la contractilidad del corazón en pacientes con insuficiencia cardíaca. / [CA] La insuficiència cardíaca és una síndrome multifactorial que s'acompanya d'alteracions en la funció ventricular i dilatació de les cambres cardíaques, a més de ser causa d'augment de morbiditat, mortalitat i cost sanitari. Les miocardiopatíes dilatada i isquèmica són causes molt freqüents d'esta síndrome. A pesar dels avanços que s'han produït en el tractament de la insuficiència cardíaca, el pronòstic no ha millorat significativament en els últims anys. És per això que hi ha una necessitat de desenvolupar noves estratègies per al seu tractament, donada l'eficàcia limitada de les teràpies actuals. Esta síndrome s'associa amb alteracions en la contracció del cor. El reticle endoplàsmic és el principal magatzem de calci intracel·lular necessari per a l'inici del procés de contracció del cor. D'altra banda, els canals iònics regulen la contracció del múscul cardíac i són responsables dels corrents d'ions que determinen i influïxen sobre el potencial d'acció cardíac. En esta Tesi ens plantegarem estudiar, en un grup de pacients amb insuficiència cardíaca, els canvis existents en les proteïnes que conformen l'estructura i participen en la resposta a estrés del reticle endoplàsmic, així com analitzar l'expressió gènica de canals iònics cardíacs i relacionar estes alteracions amb la disfunció ventricular dels pacients. Els nostres resultats mostren la presència d'alteracions en la majoria de proteïnes estructurals i de resposta a estrés del reticle endoplàsmic, sent la proteína estructural RRBP1 la que presenta relacions significatives amb la disfunció cardíaca dels pacients i també amb la proteïna d'estrés XBP1. Aixó evidencia una dependència específica entre estructura i estrés d'este orgànul i una influència d'estes alteracions estructurals sobre la funció ventricular dels pacients. A més, mostrem diferents canvis d'expressió en un gran nombre de canals iònics cardíacs per mitjà de microarrays i sequenciació d'ARN. D'estos canals, trobem que els nivells reduïts de CACNG8 es relacionen amb una millora en la funció i els nivells augmentats de KCNJ2 i KCNN3 es relacionen amb una major disfunció ventricular en la miocardiopatía dilatada. En el cas d'estes alteracions en la miocardiopatía isquèmica, els nivells reduïts del canal TRPM7 afavorixen una millora de la funció del ventricle esquerre. L'expressió gènica diferencial d'esta categoria en ambdós miocardiopatíes, podria explicar les alteracions en els diferents corrents iònics que afecten el procés de contracció del miocardi en la insuficiència cardíaca. En conclusió, demostrem la presència d'alteracions en dos components clau per a la contracció del miocardi que poden proporcionar noves bases per al seu estudi i regulació com a diana de possibles tractaments per a la millora de l'alteració en la contractilitat del cor en pacients amb insuficiència cardíaca. / Ortega Gutiérrez, A. (2016). Bases genómicas y celulares de la contracción ventricular. Papel del retículo endoplásmico y los canales iónicos en la insuficiencia cardiaca humana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/68491 / TESIS