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Estudio de Dinámica Molecular con Solvente Implícito de la Influencia de la Interfase de Interacción entre los Dominios de la Proteína FtsZ en la Estabilidad y PlegamientoSepúlveda Durán, Leonardo Andrés January 2007 (has links)
FtsZ es una proteína bacteriana esencial en el proceso de división celular. Se
localiza en la membrana interna de la célula generando un anillo en la mitad de su eje
longitudinal, donde actúa como una proteína de andamiaje reclutando a las demás
proteínas del mecanismo de división. Esta estructura denominada “anillo Z” esta
compuesta de polímeros de FtsZ, los cuales son capaces de interactuar lateralmente
generando sabanas o dobles filamentos. La polimerización se produce por la unión de
GTP al monómero de FtsZ. Dentro del filamento, FtsZ adquiere actividad GTPásica, y
tras la hidrólisis del GTP el filamento de FtsZ se desestabiliza y desensambla.
Los cambios estructurales producidos tras la hidrólisis del GTP pueden
explicarse al analizar la estructura de FtsZ, que esta compuesta por dos dominios, el
amino que contiene el sitio de unión a nucleótido del tipo Rossman y el carboxilo que
presenta un plegamiento de tipo α/β. Ambos interactúan estrechamente por medio de
una interfase hidrofóbica generada entre las sabanas plisadas de ambos dominios y la
helice H7, la que se encuentra entre ambos dominios. Esta interfase no solo tiene
relevancia funcional en el mecanismo de polimerización, sino que también juega un rol
estabilizador entre los dominios de FtsZ. Mientras que dominios de una FtsZ de
Thermotoga maritima son estables en forma independiente, los dominios de FtsZ de
Escherichia coli solo muestran estructura secundaria en presencia de agentes
estabilizantes.
Con el fin de estudiar la influencia de esta interfase de interacción en la
estabilidad de los dominios de FtsZ, se llevaron a cabo simulaciones de dinámica
molecular con un método de solvatación implícita. La utilización de este método nos
permitió efectuar simulaciones en condiciones nativas y desnaturantes (alta
temperatura) de una proteína FtsZ termófila (Methanococcus jannaschii) y una
mesófila (Pseudomonas aeruginosa) para las cuales existen estructuras cristalinas
disponibles.
Las simulaciones mostraron que en condiciones nativas ambas proteínas son
estables, sin embargo el dominio de unión a nucleótido de la proteína mesófila muestra
una menor estabilidad que el dominio de la proteína termófila. Las diferencias se
localizan en las zonas aledañas al lazo T3, involucrado en la unión del nucleótido. La forma general del desplegamiento de la proteína mesófila y termófila es muy similar,
observándose solo diferencias en la rapidez con la cual se pierde estructura
secundaria, siendo más estable la proteína termófila. Sin embargo, cálculos de
estabilidad de los núcleos hidrófobos de la interfase y los dominios, no mostraron
diferencias significativas entre los dominios aislados y las proteínas nativas. Los únicos
cambios significativos se logran al comparar las estabilidades del dominio carboxilo con
el dominio amino, donde este último muestra una mayor estabilidad. En conjunto, los
resultados sugieren una relación entre la estabilización de los dominios por medio de la
interfase de interacción y la unión del nucleótido con el mecanismo de cambio
conformacional de FtsZ.
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Estudio de la Interacción entre la Proteína Asociada a Microtúbulos 1B y la Enzima Tirosina Tubulina Ligasa en NeuronasContreras Vallejos, Erick Alejandro January 2008 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / Las modificaciones post-traduccionales de la α-tubulina contribuyen a determinar
las propiedades dinámicas de ciertas poblaciones de microtúbulos. Esto es particularmente
importante para procesos que requieren cambios rápidos en la estabilidad del citoesqueleto
que permitan la modificación de las propiedades morfológicas o motiles de las neuronas.
Estas modificaciones deberían regularse localmente durante los procesos de elongación
axonal, migración neuronal y guía axonal. La proteína asociada a microtúbulos 1 B
(MAP1B) es una proteína que participa y regula los tres procesos antes mencionados. Se ha
descrito que la presencia de una variante fosforilada de MAP1B está enriquecida en el
extremo distal de axones, esencialmente la zona más dinámica del axón. Se ha descrito que
conjuntamente con el gradiente de MAP1B fosforilada, se produce un gradiente de
microtúbulos alfa-tirosinados. Esta modificación post-traduccional es efectuada por acción
de la enzima tubulina tirosina ligasa (TTL) .
La hipótesis planteada en nuestro trabajo es: hipótesis: La proteína asociada a
microtúbulos 1B (MAP1B) interactúa con la enzima Tubulina Tirosina Ligasa (TTL)
aumentando de esta forma la tirosinación de los microtúbulos neuronales .
Nuestros resultados indican que MAP1B y TTL interaccionan, evidenciado
mediante ensayos de inmunoprecipitación y pull-down. Adicionalmente se muestra que la
sobre-expresión regulada de la enzima glicógeno sintasa quinasa 3 beta (Gsk3ß) en
neuroblastomas murinos (N2a), induce cambios en el patrón de fosforilación de MAP1B y
que esta modificación no produce cambios en la interacción entre ambas proteínas. La
interacción de ambas proteínas es independiente de un entrecruzamiento originado por los
microtúbulos y se produce con la cadena pesada de la MAP1B.
En base a estos resultados se espera comprender de mejor forma como la
modificación post-traduccional de los microtúbulos, particularmente la adición de un
residuo de tirosina en el extremos carboxilo terminal de la α-tubulina, juega un papel
importante en procesos como migración, guía y/o elongación axonal de las neuronas / Post-translational modifications of α-tubulin contribute to determine the dynamic
properties of certain microtubule populations. This is particularly important in processes
that require fast changes in the cytoskeleton stability to allow the modifications of the
motility and morphologic properties of neurons. These modifications must be regulated
locally during axonal elongation, neuronal migration and axonal guidance process. The
Microtubule Associated Protein 1B (MAP1B) participates and regulates the three processes
mentioned above. It has been described that the presence of a variant phosphorylated form
of MAP1B is enriched in the distal end of axons, essentially in the most dynamic regions of
the axon. Interestingly, it has been described that together with the gradient of
phosphorilated MAP1B, a gradient of tyrosinated microtubules takes place. This posttranslational
modification is carried out by the action of the tubulin tyrosin ligase (TTL)
enzyme.
The hypothesis proposed in our work is: The Microtubule Associated Protein 1B
(MAP1B) interact with the tubulin tyrosin ligase (TTL) enzyme regulating the tyrosination
of neural microtubules .
Our results indicate that MAP1B and TTL interact; this was studied by
inmmunoprecipitation and pull-down experiments. Additionally we showed that the
regulated over expression of the glycogen synthase kinase 3 beta (Gsk3ß) enzyme in
murine neuroblastoma (N2a), induces changes in the phosphorilation patterns of MAP1B
and that this modification do not produces changes in the interaction between these
proteins. The interaction of both proteins is independent of a crosslinking originated by
the microtubules and it ocurrs with the heavy chain of MP1B.
Based on these results we expect to understand better how the post-translational
modifications of microtubules, particularly the addition of a tyrosine residue in the Cterminal
domain of the α-tubulin, play a important role in processes like neuronal
migration, axonal elongation and axonal guidance
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La interrupción de la comunicación vía Ca2+ entre el retículo endoplasmático y la mitocondria reduce la migración e invasión celularSmith Cortínez, Natalia Francisca January 2015 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / La mitocondria y el retículo endoplasmático (ER) se encuentran física y
funcionalmente acoplados. Los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son los
principales canales de Ca2+ responsables de la liberación de este ión desde el ER
y de la comunicación con la mitocondria. En la mitocondria, el encargado de permitir
la entrada de Ca2+ es el unitransportador de Ca2+mitocondrial (MCU), que regula el
paso del ion desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial,
permitiendo el funcionamiento de varias enzimas y transportadores fundamentales
para mantener la bioenergética celular. La disrupción de la comunicación ERmitocondria
genera una crisis bioenergética que activa una respuesta autofágica
dependiente de la kinasa activada por AMP (AMPK).
En cáncer se ha asumido que la glicólisis es capaz de suministrar toda la
energía que las células requieren. Sin embargo, recientemente se ha demostrado
que la mitocondria juega un papel fundamental en tumorigénesis. La migración e
invasión son dos propiedades de las células tumorales que son parte de la cascada
invasión-metástasis, que le permitirán a las células dejar el tumor primario para
colonizar otros tejidos. Estas propiedades requieren altos niveles de energía. Sin
embargo, el papel del metabolismo mitocondrial en estos fenómenos se ha
estudiado muy poco. De acuerdo a esto, nosotros hipotetizamos que una
interrupción en la comunicación vía Ca2+ entre el ER y la mitocondria producirá una
desregulación bioenergética que disminuirá la capacidad de migración e invasión
de las células tumorales. Utilizando un inhibidor competitivo especifico del receptor
de IP3 y el silenciamiento de este a través de siRNA interrumpimos la comunicación ER-mitocondria y encontramos una disminución de la función mitocondrial, que se
correlaciona con una disminución en la migración e invasión in vitro de líneas
celulares tumorales altamente metastásicas. Los resultados de este trabajo abren
nuevas oportunidades terapéuticas para tratar la generación de metástasis las que
hasta el día de hoy son consideradas intratables / Mitochondria and the Endoplasmatic Reticulum (ER) are physically and
functionally coupled. Inositol 1,4,5-triphosphate Receptors (IP3R) are responsible for
the Ca2+ release from the ER to the cytoplasm and command mitochondria-ER
communication. Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU) is responsible for allowing
Ca2+ entry from the intermembrane space to the mitochondrial lumen. Ca2+ in the
mitochondria activates several Kreb’s cycle’s enzymes helping to maintain cell
bioenergetics. Disruptions in ER-Mitochondrial communication generate a
bioenergetic crisis characterized by an AMPK-dependent autophagic response.
Migration and invasion of tumor cells are high energy demanding process.
Glycolysis has been assumed to being able to supply as much energy cancer cells
need. However, it has been recently proven that mitochondria play a crucial role in
tumorigenesis. Accordingly we hypothesize that a disrupted Ca2+ communication
between the ER and mitochondria will lead to a bioenergetic crisis that will decrease
migration and invasive capacity of tumor cells. Thus, we interrupted the ERmitochondrial
communication by inhibiting the IP3R pharmacologically with
Xestospongin B and molecularly by silencing isoforms 1 and 3 of IP3R with siRNA.
We found a decrease in mitochondrial function that correlates with a decrease in
vitro migration and invasion of highly metastatic tumor cell lines. The results obtained
in this work open new therapeutic opportunities to treat metastasis which are
currently considered untreatable / Fondecyt
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Dominis estructurals i noves interaccions proteiques de l'enzim deubiquitinant USP25Denuc Isern, Amanda 13 April 2011 (has links)
La present Tesi Doctoral es presenta com una agrupació de quatre publicacions que resumeixen el treball realitzat al Departament de Genètica de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona. El principal objectiu és la
caracterització funcional de les regions estructurals de la isoforma muscular de l’enzim deubiquitinat USP25, inicialment definides amb eines bioinformàtiques. A més a més, es pretén fer un estudi de noves interaccions moleculars tipus proteïna-proteïna per la cerca de nous substrats o reguladors enzimàtics.
La cèl•lula eucariota posseeix, entre altres, un sistema senyalitzador intracel•lular basat en una família de pèptids, el representant dels quals és la ubiquitina. Aquest sistema presenta diferents categories funcionals, entre elles, els enzims deubiquitinants, un centenar a l’espècie humana. Aquests enzims hidrolitzen l’enllaç que uneix la ubiquitina als seus precursors o substrats, mantenint així l’homeostasi d’aquest pèptid dins la cèl•lula. Una alteració de la seva funció pot portar diferents conseqüències depenent de la via metabòlica que es vegi afectada, doncs suposa una desregulació estequiomètrica dels substrats ubiquitinants respecte els no ubiquitinats. L’enzim deubiquitinant USP25 es va descriure en el grup d’investigació d’aquesta tesi durant la cerca de nous gens relacionats amb la síndrome de Down. Un cop caracteritzat funcionalment com una proteasa específica d’ubiquitina, els estudis d’expressió van mostrar l’existència de tres isoformes proteiques, una d’elles, USP25m, restringida al teixit muscular i cardíac.
Tenint en compte que en el fenotip dels pacients amb síndrome de Down, entre altres trets, hi ha deficiència cardiovascular i atonia muscular, els esforços del grup es van centrar en la descripció i anàlisi d’aquesta isoforma. Els primers estudis van mostrar la seva situació citosòlica, l’expressió correlativa amb la diferenciació de cèl•lules musculars i la relació específica amb diverses proteines del sarcòmer. En el treball realitzat per la present Tesi Doctoral, s’han caracteritzat funcionalment diferents regions reguladores descrites a nivell bioinformàtic, així com també s’ha analitzat la seva implicació fisiológica a la funció d’USP25m. A més a més, mitjançant un estudi de cerca de nous interactors proteics, s’ha trobat una nova molècula que pertany a la mateixa via senyalitzadora i que es relaciona de manera específica amb USP25m, la lligasa d’ubiquititna MKRN1 (makorin 1)
Mitjançant l’ús de diferents construccions amb delecions i mutacions puntuals de la proteïna que afecten a les regions d’interès, s’ha arribat a diferents conclusions, entre elles, que USP25m és monoubiquitinat i té la capacitat d’autodeubiquitinar-se. La monoubiquitinació en regula la seva activitat enzimàtica i es proposa un mecanisme de regulació basat en la conjugació alternativa de SUMO (una altra molècula de la família de la ubiquitina) i ubiquitina, en el mateix residu aminoacídic, la lisina 99 (Lys99). Els dominis d’unió a ubiquitina regulen el reconeixement de substrat i afavoreixen la monoubiquitinació. USP25m oligomeritza dins la cèl•lula i es troba present en diferents formacions proteiques d’elevat pes molecular. S’ha comprovat la relació específica amb la nova lligasa MKRN1 i es suggereixen diferents escenaris moleculars on poden trobar-se inclosos els dos pèptids / The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions.
The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins.
Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact. / The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions.
The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins.
Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.
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