El síndrome de Sjögren es una enfermedad autoinmune que causa alteraciones en la estructura y función de las glándulas exocrinas debido a la destrucción de la lámina basal de acinos y ductos, y a la degradación de las principales proteínas de matriz extracelular. El progresivo reemplazo de componentes exocrinos por tejido adiposo y fibroso, conduce a la sequedad de mucosas, principalmente oral (xerostomía) y ocular (xeroftalmia), que son los principales síntomas de esta enfermedad. En las glándulas de estos pacientes, también se pueden encontrar focos de infiltrado linfocitario, los que se correlacionan con el progreso de la enfermedad. Sin embargo, cambios importantes en las células epiteliales y la matriz extracelular, darían cuenta del desarrollo de esta enfermedad de manera independiente a la presencia de infiltrado de células mononucleares. A nivel molecular, la degradación de la matriz extracelular es inducida por un desequilibrio entre metaloproteinasas de matriz y sus inhibidores tisulares, favoreciendo la actividad proteolítica. La degradación de componentes de la lámina basal desorganiza la estructura y conduce a la pérdida de anclaje celular a la matriz extracelular. La señalización dependiente de anclaje mantiene la polaridad celular principalmente a través de complejos de adhesión llamados hemidesmosomas. El receptor involucrado en formar estas estructuras es la integrina α6β4, cuyo ligando de mayor afinidad es la laminina-5. Recientemente se ha demostrado que la laminina-5 está sobreexpresada (a nivel de proteínas y mRNA) en glándulas salivales labiales de pacientes con síndrome de Sjögren. Además, análisis de microarreglos de cDNA obtenidos de glándulas salivales labiales de pacientes con síndrome de Sjögren, y comparados con los obtenidos de individuos control, han demostrado que varias proteínas citoplasmáticas normalmente asociadas a la integrina α6β4, por ejemplo BP230 y citoqueratina 8/18, están sobreexpresadas. Las integrinas, además de su papel como mediadores de la interacción célulamatriz, participan en la señalización hacia y desde la célula (señalización bidireccional), la que es importante para regular procesos como proliferación, diferenciación y muerte celular. Por lo tanto, la degradación no regulada de lámina basal, no sólo modifica las propiedades de adhesión de la célula, sino también las señales que estos receptores xiii llevan al interior de la célula, conduciendo a importantes cambios que pueden llevar a la muerte celular. De esta manera, se decidió analizar los niveles de expresión y localización subcelular de la integrina α6β4 en células acinares de pacientes con síndrome de Sjögren e individuos control, y así estudiar si estos se relacionan con los cambios que ocurren en estas glándulas. Se propuso la siguiente hipótesis: “En glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren la pérdida de adhesión de células acinares a su lámina basal y la sobreexpresión de laminina-5, se acompañan de una sobreexpresión y/o redistribución de la integrina α6β4” Para evaluar esta hipótesis, se determinaron los niveles de mRNA y de proteínas de las subunidades α6 y β4 en glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren y se compararon con los resultados obtenidos de individuos controles. Además, mediante inmunohistoquímica, usando anticuerpos específicos para cada subunidad, se analizó la localización de la integrina α6β4 en la membrana plasmática de células acinares y la de laminina en láminas basales de acinos de glándulas salivales. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias significativas en los niveles relativos de mRNA entre pacientes y controles, tanto para la integrina α6 (p = 0,49) como para la integrina β4 (p = 0,71). Al analizar los niveles relativos de proteínas, en el caso de α6, no se encontraron diferencias significativas entre el grupo total de pacientes y el grupo control (p = 0,2), sin embargo, al separar el grupo de pacientes en dos subgrupos de acuerdo a su nivel de expresión, se encontró que el que presentaba niveles menores no tenía diferencias significativas respecto al grupo control (p = 0,296), mientras que el otro, que presentaba niveles relativos mucho más altos, sí mostró diferencias significativas (p = 0,014). En cuanto a la proteína β4, ésta se encontró de manera intacta (200 kDa) y proteolizada (172 y 145 kDa) tanto en pacientes como en controles. De ambas formas, los niveles fueron significativamente menores en pacientes respecto a controles (p = 0,02). En cuanto a la localización subcelular de la integrina, en pacientes se encontró una importante redistribución hacia la superficie lateral de la célula, encontrándose xiv incluso a nivel citoplasmático en los casos de mayor desorganización de la lámina basal. Estos y otros resultados confirman de manera parcial la hipótesis, donde el mecanismo de rescate al desanclaje podría llevarse a cabo a través de la redistribución de la integrina α6β4 a nivel subcelular. Existirían otros mecanismos por los cuales se mantendrían activas algunas de las señales dependientes de anclaje, para completar el sistema de rescate a la muerte celular, y que no pasarían necesariamente por una mayor cantidad de integrina α6β4.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La localización precisa de los componentes sinápticos durante el desarrollo requiere del ordenamiento de una red de proteínas entre las cuales participan proteínas andamio de la familia MAGUK (membrane-associated guanylate kinases). Los miembros de esta familia reclutan receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas del citoesqueleto en complejos macromoleculares a través de sus dominios de interacción proteína-proteína. La sinapsis neuromuscular de la larva de Drosophila melanogaster es un excelente modelo de sinapsis centrales de mamíferos. En esta sinapsis glutamatérgica, la proteína andamio Discs large (Dlg), un miembro de la familia MAGUK, cumple un papel importante en la formación de la sinapsis y en la localización de proteínas involucradas en la transducción de señales. Se ha demostrado que Dlg determina la localización sináptica del canal de K+ tipo Shaker, Fasciclina II (FasII), una molécula de adhesión celular involucrada en el crecimiento y plasticidad de la sinapsis neuromuscular y Scribble (Scrib), una proteína involucrada en el mantenimiento de la concentración de vesículas sinápticas en los sitios de liberación durante la estimulación de alta frecuencia. Dlg, además participa en otros procesos, incluyendo el mantenimiento de la polaridad apicobasal de los epitelios, el control de la proliferación y la neurogénesis embrionaria. Todas estas funciones han sido atribuidas a una sola isoforma, DlgA. Sin embargo, en nuestro laboratorio se aislaron una serie de transcritos que corresponden a variantes de procesamiento alternativo del gen dlg que presentan en su extremo 5’ una región que codifica un segmento de 65 aminoácidos llamado S97N y que está ausente en DlgA. Las variantes de dlg que contienen S97N como la proteína denominada DlgS97, sólo se expresan en sistema nervioso y músculo, a diferencia de DlgA que también se expresa en células epiteliales. En este trabajo se estudió el papel de las variantes del gen dlg con dominio S97N en la estructura y formación de la sinapsis de la unión neuromuscular de la larva. Mediante análisis de “western blot” se determinó la proteína DlgS97 de ∼116 kDa y al menos una variante de DlgA de ∼97 kDa. Experimentos de ganancia y pérdida de función específicas para las variantes epitelial y neuronal muestran que las variantes que contienen el dominio S97N participan en el desarrollo de la sinapsis, afectando la morfología y el número de botones sinápticos, además de la expresión de la proteína Scrib y parcialmente la localización de FasII en la sinapsis. Esto difiere de lo observado para la pérdida de función de DlgA que no parece afectar la morfología o expresión de Scrib, aunque sí afecta el número de botones y la expresión de FasII. Mediante ensayos en matriz sólida e inmunoprecipitación se logró determinar que el dominio S97N es capaz de formar homodímeros, sin interactuar con dominios de DlgA. Estos resultados sugieren que ambas isoformas participan en la sinapsis pero con funciones diferentes, formando complejos macromoleculares de manera independiente / The precise location of the synaptic components during development requires the arrangement of a protein network which includes scaffold proteins of the MAGUK family. The members of this family of proteins recruit receptors, ionic channels, signal transduction components and proteins of the cytoskeleton to macromolecular complexes through protein-protein interaction domains. The neuromuscular synapse of the Drosophila melanogaster larva has been used as a model of mammalian central synapses. In this glutamatergic synapse, the scaffold protein Discs large (Dlg), a member of the MAGUK (membrane-associated guanylate kinases) family of proteins, has an important role in the formation of the synapse and in the localization of proteins involved in signal transduction. It has been demonstrated that Dlg determines the synaptic localization of the Shaker K+ channel, of Fasciclin II (FasII), an adhesion molecule involved in the growth and plasticity of the neuromuscular synapse and of Scribble (Scrib), a protein involved in the maintenance of the synaptic vesicle pool in the release sites during high frequency stimulation. Dlg also participates in other processes, including the maintenance of the epithelial apico-basal polarity, the control of proliferation and embrionic neurogenesis. All these functions have been attributed to a single isoform, DlgA. In our laboratory, however, a number of transcripts has been isolated that represent alternatively processed products of the gene dlg, these present a 5' region that encodes a segment of 65 amino acids called S97N that is absent in DlgA. The variants S97N-containig as protein denominated DlgS97 are only expressed in nervous system and muscle, unlike DlgA that is also expressed in epithelial cells. In this work, the role of Dlg variants with S97N domain in the structure and development of the neuromuscular junction was studied. Western blot analysis indicates the presence of the protein DlgS97 of 116 kDa and at least one variant of DlgA of 97 kDa. Loss of function and gain of function experiments specific for the epithelial and neuronal variants show that variants containing the S97N domain participate in the development of the synapse, affecting the morphology and number of synaptic boutons, together with the expression of Scrib and the partial localization of FasII at the synapse. This is different from the DlgA loss of function where the morphology or the expression of Scrib does not change, although the number of boutons and the expression of FasII is affected. By pulldown and inmunoprecipitation assays it was possible to determine that the S97N domain is able to undergo homodimerization, but does not interact with domains of DlgA. These results suggest that both isoforms participate in the synapse but with different functions, forming macromolecular complexes in an independent way

Una de las formas de disposición de biosólidos generados en las plantas de tratamiento de aguas servidas es su aplicación en suelos agrícolas. Sin embargo, esto involucra algunos problemas, como la acumulación de los metales pesados, el incremento de la materia orgánica y de otros componentes del biosólido, pudiendo cambiar la distribución y movilidad de los metales pesados, modificando su disponibilidad, que dependerá del tipo de suelo, de las propiedades físicas y químicas tanto del biosólido como del suelo y del tipo de cultivo. Si bien existe una vasta experiencia extranjera en el tema, es conveniente como país productor de una amplia gama de productos agrícolas de exportación, realizar estudios preliminares con suelos locales. El propósito de este estudio fue determinar el efecto de la aplicación de biosólidos en la distribución y disponibilidad de los siguientes metales pesados: Cr, Cu, Ni, Pb y Zn en suelos agrícolas de la Región Metropolitana. Se muestrearon cuatro suelos de orden Mollisol diferentes (CB, EM, LP y M). Estos fueron tratados con 15 y 30 Mg·ha-1 de biosólido, además de utilizar suelo sin tratar, como control, e incubados a 25ºC en condiciones de humedad de campo por 60 días. Los biosólidos utilizados (BET2004 y BET2005) fueron obtenidos de una de las plantas de tratamiento de aguas servidas de Santiago. Fueron muestreados en el monorrelleno en épocas diferentes del año. Los suelos, biosólidos y mezclas suelo-biosólido fueron caracterizados a través del pH, contenido de materia orgánica, capacidad de intercambio catiónico (CIC) y contenido total de metales pesados. Los metales traza de los suelos control y tratados con las respectivas dosis de biosólido, fueron extraídos secuencialmente antes y después de la incubación. Se utilizó la metodología propuesta por “The European Community Bureau of Reference” (BCR) de cuatro etapas de manera de obtener las fracciones soluble en ácidos (metal unido a carbonatos), reducible (metal asociado a óxidos de manganeso y hierro), oxidable (metal asociado a materia orgánica) y residual. La determinación de los metales se realizó por Espectroscopía de Absorción Atómica (EAA) con llama. La aplicación de biosólido generalmente incrementó el contenido total de los metales, principalmente significativo para Zn y Cu. La dosis de biosólido y el tiempo de incubación sólo afectaron la distribución de Zn y Cu, principalmente de Zn. Un diseño factorial a dos niveles fue usado para evaluar los efectos: dosis del biosólido aplicado y tiempo de incubación en la disponibilidad de estos metales. Las variables consideradas son influenciadas dependiendo del metal y tipo de suelo. Se encontró, principalmente en el caso del Zn, un incremento de las formas solubles en ácidos, y reducibles debido a la aplicación de biosólidos y tiempo de incubación, en el caso del tratamiento con BET2004, y sólo debido al tiempo de incubación, en los suelos tratados con BET2005.

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