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Expresión de un inhibidor endógeno de CaMKII luego de la inducción de potenciación a largo plazo en el hipocampo de rata

Astudillo Maya, Daniela Andrea 10 1900 (has links)
Ingeniera en Biotecnología Molecular / La proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina II (CaMKII) es una molécula de señalización sináptica que se expresa abundantemente en el cerebro y que juega un rol crítico en la formación de memorias y la inducción de eventos de plasticidad sináptica. La activación y autofosforilación en el sitio T286 de CaMKII son requeridas para inducir potenciación a largo plazo (LTP), fenómeno de plasticidad sináptica considerado modelo celular que subyace el aprendizaje. Las sinapsis glutamatérgicas de la región CA1 del hipocampo expresan un tipo de LTP que es dependiente del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR). Luego de inducir LTP, CaMKII autofosforilada es enriquecida en la densidad postsináptica (PSD), en donde (i) gatilla una cascada de señalización que finaliza con el aumento a largo plazo de la corriente mediada por lo receptores de tipo AMPA (AMPARs) y (ii) forma un complejo con la subunidad GluN2B del NMDAR. Mutaciones que previenen la autofosforilación de CaMKII o que interrumpen la asociación del complejo GluN2B-CaMKII causan un déficit en la inducción de la LTP y severos defectos en el aprendizaje. Debido a que CaMKII adquiere una actividad independiente de Ca2+ mediante su autofosforilación o su unión a la subunidad GluN2B, es esperable que su actividad quinasa sea adecuadamente regulada. Esta regulación podría llevarse a cabo a través de cambios en la expresión de dos inhibidores endógenos y específicos de CaMKII: CaMK2N1 y CaMK2N2 (también denominados CaMKIINα y CaMKIINβ, respectivamente). Estudios han revelado que CaMK2N1 aumenta transitoriamente su expresión en el hipocampo y en la amígdala luego del condicionamiento al miedo en ratones, sugiriendo un rol en controlar la actividad de CaMKII desde estadios tempranos de la consolidación de la memoria. Adicionalmente, estudios recientes han mostrado que la aplicación transitoria de péptidos inhibitorios 2 derivados de CaMK2N a rebanadas agudas de hipocampo interrumpe la interacción basal entre CaMKII y GluN2B y causa una depresión sináptica tanto en sinapsis naïve como en sinapsis previamente potenciadas, lo cual revierte la saturación de la LTP. Sin embargo, hasta el momento no existe evidencia que la expresión de CaMK2N sea regulada luego de inducir LTP en el hipocampo, así como ocurre luego del aprendizaje. En este estudio, se investigó si la expresión a nivel de mRNA de CaMK2N1 y CaMK2N2 es regulada luego de la inducción de LTP por estimulación a alta frecuencia (HFS) en la región CA1 de rebanadas agudas de hipocampo de rata. Experimentos de PCR cuantitativo (del inglés Polymerase Chain Reaction) revelaron que Camk2n1 aumenta su expresión 60 minutos después de inducir LTP. En contraste, la expresión de Camk2n2 no cambió. Además, se encontró una correlación positiva entre la magnitud de la potenciación y el cambio en la expresión de Camk2n1. Estos resultados, en conjunto con los hallazgos anteriores, sugieren que el aumento en la expresión de Camk2n1 luego de la inducción de LTP podría ser parte de un mecanismo de regulación que facilite la subsecuente inducción de eventos de plasticidad sináptica, una vez que los niveles basales de expresión del inhibidor se reestablecen. / Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) is an abundant synaptic signaling molecule that plays a critical role in memory formation and induction of synaptic potentiation. CaMKII activation and autophosphorylation at T286 are required to induce long-term potentiation (LTP), a form of synaptic plasticity considered a cellular model underlying learning. CA1 hippocampal synapses expresses a type of LTP dependent on the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR). After LTP induction, autophosphorylated CaMKII becomes enriched at postsynaptic densities, where it (i) triggers a biochemical cascade that produces a long-lasting increase of AMPA receptor (AMPAR) mediated currents and (ii) binds to the NMDAR GluN2B subunits. Mutations that prevent CaMKII autophosphorylation or disrupt the CaMKII-GluN2B complex cause a deficit in LTP induction and severe learning defects. Since CaMKII can be autonomously active by autophosphorylation or NMDAR binding, and considering its role in LTP induction and memory formation, it is expected that the kinase activity should be tightly regulated. This regulation may involve changes in the expression of two endogenous CaMKII-specific inhibitors: CaMK2N1 and CaMK2N2 (also named CaMKIINα and CaMKIINβ, respectively). Studies have revealed that CaMK2N1 transiently increases its expression in the rodent hippocampus and amygdala after fear conditioning, suggesting a role in controlling CaMKII activity in early stages of memory consolidation. Additionally, previous studies showed that transient application of CaMK2N-derived peptides to acute hippocampal slices disrupts the basal interaction between CaMKII-GluN2B and causes long-lasting synaptic depression in both naïve synapses and in previously potentiated synapses in which it reverses LTP saturation. However, it is not clear if CaMK2N expression is regulated after induction of LTP, as same as after fear conditioning. Here, 4 we investigated whether CaMK2N1 and CaMK2N2 gene expression is regulated after the induction of LTP in CA1 region of acute rat hippocampal slices. Real-time PCR experiments revealed that CaMK2N1 mRNA expression was up-regulated 60 min after LTP induction. In contrast, CaMK2N2 mRNA expression did not change. Additionally, correlation analysis showed a positive correlation between the LTP magnitude and Camk2n1 expression increase. These results, overall with the previous findings, suggest that the up-regulation of CaMK2N1 after LTP induction could be part of a regulation mechanism that facilitates the induction of subsequent synaptic plasticity events once basal expression levels are re-established. / Abril del 2018
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Exo70 regula la eficiente fusión de lisosomas en la sinapsis inmune

Sáez Pons, Juan José Tomás. 06 1900 (has links)
Doctor en Ciencias con Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias / Los linfocitos B (LB) son las únicas células del sistema inmune capaces de producir anticuerpos. La activación de LB comienza con el reconocimiento de un antígeno específico en la superficie de una célula presentadora, promoviendo la formación de una región especializada en la membrana plasmática conocida como sinapsis inmunológica. Esta estructura permite la extracción, procesamiento y presentación de antígenos a linfocitos T, etapas necesarias para la activación del LB. Durante la extracción la célula adquiere un fenotipo polarizado. El centrosoma, o centro organizador de microtúbulos, se reposiciona hacia la sinapsis inmunológica y actúa como guía para el reclutamiento y posterior fusión de lisosomas a la membrana sináptica, liberando proteasas e hidrolasas que facilitan la extracción del antígeno. La secreción del contenido lisosomal es un proceso esencial para la extracción antigénica, sin embargo, aún se desconocen los mecanismos involucrados en el reclutamiento y fusión de lisosomas. Para indagar en las proteínas involucradas en el mecanismo de regulación de la fusión de lisosomas a la membrana sináptica se utilizó un estudio de proteómica asociado a la sinapsis inmunológica. Tomando en consideración que el centrosoma se polariza y recluta muy cercanamente hacia la sinapsis inmune en LB, se aislaron centrosomas de células activadas y no activadas para detectar cambios en la composición de la sinapsis. Usando esta aproximación se observó un aumento en las células activadas de 4 proteínas del complejo Exocisto. El Exocisto es un complejo proteico encargado del anclaje de vesículas secretorias a la membrana plasmática. Está involucrado en múltiples procesos de secreción polarizada, aunque su rol en LB X se desconoce. En este trabajo se muestra que Exo70, una proteína del complejo Exocisto, se encuentra asociada al centrosoma y se recluta a la sinapsis inmune. La localización y el reclutamiento a la sinapsis de Exo70 se encuentran regulados por la dinámica de microtúbulos y por la proteína de polaridad Par3. Más aun, el silenciamiento de Exo70 inhibe la fusión de los lisosomas a la membrana sináptica, disminuyendo la capacidad de extraer antígeno y presentarlos a linfocitos T. De esta forma, Exo70 surge como un regulador de la extracción de antígenos mediada por la secreción de lisosomas, esencial para el procesamiento y presentación de antígenos. / B lymphocytes are the only cells of the immune system able to produce antibodies. B cells activation starts with a specific antigen recognition presented on the surface of an antigen presenting cell, promoting the formation of a specialized membrane region known as the immune synapse. This structure allows the extraction, processing and presentation of antigens to T lymphocytes, necessary stages for the LB activation. During antigen extraction, B cells adopt a polarized phenotype. The centrosome, or microtubule-organizing center, is repositioned towards the immune synapse and guides the recruitment and posterior fusion of lysosomes to the immune synapse, releasing proteases and hydrolases that facilitate the antigen extraction. The secretion of lysosomal content at the synaptic membrane is an essential process for antigen extraction; however, the mechanisms involved in the recruitment and fusion of the lysosomes remain unknown. To inquire on the proteins involved in the regulation mechanism of lysosome fusion at the synaptic membrane we used a proteomic study associated to the immune synapse. Considering that the centrosome polarizes and is recruited closely to the synaptic membrane, centrosomes from activated and resting cells were isolated to detect protein changes associated to the immune synapse. Using this approach, we observed an increase in 4 proteins belonging to the exocyst complex in the centrosome obtained from activated B cells. The Exocyst is a protein complex involved in the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. It has been associated in multiple processes of polarized secretion, however, its role on the B cells is unknown. In this work we show that Exo70, an exocyst complex subunit, is XII concentrated in the centrosome and is recruited to the immune synapse. Exo70 localization and recruitment depends on the microtubule dynamics and the polarity protein Par3. Moreover, Exo70 silencing inhibits lysosome fusion to the synaptic membrane, impairing efficient antigen extraction and presentation to T lymphocytes. Thus, Exo70 emerges as a regulator of the lysosome-dependent antigen extraction, essential for the processing and presentation of antigens. / Beca de doctorado nacional 2013 CONICYT. - Proyectos FONDECYT 1141182 y 1180900. - Ayuda para estadías cortas de investigación, convocatoria 2015-2016. Vicerrectoría de asuntos académicos, Universidad de Chile. - Proyecto ECOS-CONICYT 111329, convocatoria 2014.
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Caracterización de la proteína Marlin-2

Koenig-Robert Leiva, Alexis Roger January 2006 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En el sistema nervioso, la transmisión del impulso nervioso entre neuronas se efectúa a través de la sinapsis. Éstas pueden ser de dos tipo, eléctricas y químicas. En estas últimas existen diversas proteínas que se asocian a los receptores de neurotransmisores, las que intervienen en su biosíntesis, transporte, anclaje y modulación de su actividad. Este trabajo se centró en el estudio de una nueva proteína llama Marlin-2, identificada a través de análisis comparativos entre la estructura primaria de la proteína Marlin-1 y las secuencias depositadas en las bases de datos. Marlin-1 (multiplt alpahelices and RNA linker protein), es una proteína que se asocia directamente a la subunidad R1 del receptor de neurotransmisores GABAB e intervendría en su expresión y función. La hipótesis planteada en este trabajo es la siguiente: la homología entre Marli-1 y Marlin-2 define la relación de esta última con compartimientos subcelulares, dominios neuronales y su interacción con el receptor de GABAB. Para verificar esta hipótesis elegimos una combinación de técnicas bioquímicas y microscópicas en modelos de líneas celulares mamíferas y neuronas de cultivo primario de ratas. Nuestros resultados indican que Marlin-2 y Marlin-1 poseen un alto porcentaje de identidad en sus estructuras primarias y que sus dominios estructurales se encuentran altamente conservados, especialmente los involucrados en interacciones proteicas. Además demostramos que en líneas celulares Marlin-2 se distribuye en núcleo y citoplasma y que presentan un patrón granular, predominantemente citoplasmático. Por otra parte, en neuronas transfectadas con Marlin-2, esta proteína se distribuye en el soma y dendritas proximales, presentado un patrón granular, similar al de Marlin-1 endógena. También hemos demostrado la interacción entre Marlin-1 y Marlin-2 mediante análisis de bioimagen y co-inmunoprecipitación en líneas celulares. En base a estos resultados y a las herramientas desarrolladas en este trabajo, en el futuro se logrará conocer en mayor profundidad el rol de esta proteína en el sistema nervioso
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Papel de las isoformas de Disc Large (DLG) en la fisiología sinaptica de la unión neuromuscular de larva de drosophila

Astorga Ahumada, Cesar Andrés January 2015 (has links)
Grado de doctor en ciencias biomédicas. / La familia de proteínas de andamio MAGUK-DLG participa en la formación de complejos proteicos en uniones intercelulares y juega un importante papel en la fisiología sináptica particularmente en la plasticidad. En vertebrados se conocen 4 miembros de esta familia: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. El papel in vivo de estas proteínas ha sido difícil de estudiar debido al alto grado de redundancia que poseen. En Drosophila melanogaster solo existe un gen MAGUK-DLG, dlg. Este gen codifica 2 proteínas: DLGS97 y DLGA. Ambas se encuentran presentes en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila (UNMDL) modelo de estudio de sinapsis glutamatérgicas que comparte componentes moleculares básicos con las sinapsis centrales de vertebrados. En este trabajo con el propósito de tener una mejor comprensión de la función de las MAGUK-DLGs, se hizo uso de mutantes específicos para cada isoforma (dlgS975 y dlgA40.2) y se combinó estudios electrofisiológicos e inmunohistoquímicos con herramientas genéticas. De esta manera se demostró que solo la ausencia postsináptica de DLGS97 se asocia con un incremento en las corrientes excitatorias de juntura en miniatura (mEJCs)y a un mayor tamaño de los campos de receptores de glutamato. La ausencia presináptica de ambas isoformas presenta alteraciones en las corrientes excitatorias de juntura evocadas (eEJCs) y en distintos procesos de plasticidad sináptica, sugiriendo una menor probabilidad de liberación, la que, se pudo demostrar que correlaciona con una pérdida de la distribución normal del canal de Ca+2 dependiente de voltaje “Cacophony”. / The DLG-MAGUK family of scaffolding proteins participates in the formation of multiprotein complexes in cell-cell interaction domains and plays an important role in the synaptic physiology, particularly in synaptic plasticity. In vertebrates this family has four members: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. The in vivo role of these proteins has been difficult to study due to their high degree of redundancy. In Drosophila melanogaster there is only one DLG-MAGUK, dlg. This gene encodes two proteins: DLGS97 and DLGA. Both are at the Drosophila larvae neuromuscular junction (UNMDL) a glutamatergic synapse that shares the basic molecular components with the synapses of the central nervous system of vertebrates. In order to get a better understanding of the role of the DLG-MAGUKs using specific isoform mutants (dlgS975 y dlgA40.2) we combined the use of electrophysiology, immunohistochemistry and genetic tools to show that only the postsynaptic absence of DLGS97 can be associated with an increase in the miniature excitatory junction currents (mEJCs), due to a bigger size in the glutamate receptor fields; moreover, the lack of both dlg isoforms affects the evoked excitatory junction currents (eEJCs) and synaptic plasticity, suggesting a smaller probability of release, which can be attributed to an abnormal distribution of the voltage dependant Ca+2 channel cacophony.
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Participación del dominio S97N de la proteína DLG en el desarrollo de la sinapsis neuromuscular de larvas de Drosophila melanogaster

Barría Maturana, Romina January 2006 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / La localización precisa de los componentes sinápticos durante el desarrollo requiere del ordenamiento de una red de proteínas entre las cuales participan proteínas andamio de la familia MAGUK (membrane-associated guanylate kinases). Los miembros de esta familia reclutan receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas del citoesqueleto en complejos macromoleculares a través de sus dominios de interacción proteína-proteína. La sinapsis neuromuscular de la larva de Drosophila melanogaster es un excelente modelo de sinapsis centrales de mamíferos. En esta sinapsis glutamatérgica, la proteína andamio Discs large (Dlg), un miembro de la familia MAGUK, cumple un papel importante en la formación de la sinapsis y en la localización de proteínas involucradas en la transducción de señales. Se ha demostrado que Dlg determina la localización sináptica del canal de K+ tipo Shaker, Fasciclina II (FasII), una molécula de adhesión celular involucrada en el crecimiento y plasticidad de la sinapsis neuromuscular y Scribble (Scrib), una proteína involucrada en el mantenimiento de la concentración de vesículas sinápticas en los sitios de liberación durante la estimulación de alta frecuencia. Dlg, además participa en otros procesos, incluyendo el mantenimiento de la polaridad apicobasal de los epitelios, el control de la proliferación y la neurogénesis embrionaria. Todas estas funciones han sido atribuidas a una sola isoforma, DlgA. Sin embargo, en nuestro laboratorio se aislaron una serie de transcritos que corresponden a variantes de procesamiento alternativo del gen dlg que presentan en su extremo 5’ una región que codifica un segmento de 65 aminoácidos llamado S97N y que está ausente en DlgA. Las variantes de dlg que contienen S97N como la proteína denominada DlgS97, sólo se expresan en sistema nervioso y músculo, a diferencia de DlgA que también se expresa en células epiteliales. En este trabajo se estudió el papel de las variantes del gen dlg con dominio S97N en la estructura y formación de la sinapsis de la unión neuromuscular de la larva. Mediante análisis de “western blot” se determinó la proteína DlgS97 de ∼116 kDa y al menos una variante de DlgA de ∼97 kDa. Experimentos de ganancia y pérdida de función específicas para las variantes epitelial y neuronal muestran que las variantes que contienen el dominio S97N participan en el desarrollo de la sinapsis, afectando la morfología y el número de botones sinápticos, además de la expresión de la proteína Scrib y parcialmente la localización de FasII en la sinapsis. Esto difiere de lo observado para la pérdida de función de DlgA que no parece afectar la morfología o expresión de Scrib, aunque sí afecta el número de botones y la expresión de FasII. Mediante ensayos en matriz sólida e inmunoprecipitación se logró determinar que el dominio S97N es capaz de formar homodímeros, sin interactuar con dominios de DlgA. Estos resultados sugieren que ambas isoformas participan en la sinapsis pero con funciones diferentes, formando complejos macromoleculares de manera independiente / The precise location of the synaptic components during development requires the arrangement of a protein network which includes scaffold proteins of the MAGUK family. The members of this family of proteins recruit receptors, ionic channels, signal transduction components and proteins of the cytoskeleton to macromolecular complexes through protein-protein interaction domains. The neuromuscular synapse of the Drosophila melanogaster larva has been used as a model of mammalian central synapses. In this glutamatergic synapse, the scaffold protein Discs large (Dlg), a member of the MAGUK (membrane-associated guanylate kinases) family of proteins, has an important role in the formation of the synapse and in the localization of proteins involved in signal transduction. It has been demonstrated that Dlg determines the synaptic localization of the Shaker K+ channel, of Fasciclin II (FasII), an adhesion molecule involved in the growth and plasticity of the neuromuscular synapse and of Scribble (Scrib), a protein involved in the maintenance of the synaptic vesicle pool in the release sites during high frequency stimulation. Dlg also participates in other processes, including the maintenance of the epithelial apico-basal polarity, the control of proliferation and embrionic neurogenesis. All these functions have been attributed to a single isoform, DlgA. In our laboratory, however, a number of transcripts has been isolated that represent alternatively processed products of the gene dlg, these present a 5' region that encodes a segment of 65 amino acids called S97N that is absent in DlgA. The variants S97N-containig as protein denominated DlgS97 are only expressed in nervous system and muscle, unlike DlgA that is also expressed in epithelial cells. In this work, the role of Dlg variants with S97N domain in the structure and development of the neuromuscular junction was studied. Western blot analysis indicates the presence of the protein DlgS97 of 116 kDa and at least one variant of DlgA of 97 kDa. Loss of function and gain of function experiments specific for the epithelial and neuronal variants show that variants containing the S97N domain participate in the development of the synapse, affecting the morphology and number of synaptic boutons, together with the expression of Scrib and the partial localization of FasII at the synapse. This is different from the DlgA loss of function where the morphology or the expression of Scrib does not change, although the number of boutons and the expression of FasII is affected. By pulldown and inmunoprecipitation assays it was possible to determine that the S97N domain is able to undergo homodimerization, but does not interact with domains of DlgA. These results suggest that both isoforms participate in the synapse but with different functions, forming macromolecular complexes in an independent way
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Estudio del rol de conexina 43 en la sinapsis inmunológica citolítica entre linfocitos t citotóxicos y células de melanoma

Hoffmann Vega, Francisca Alejandra 08 1900 (has links)
Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers (NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC), una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ) formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43 en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10, durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10 utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43 en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB). Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the “Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity. Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10 during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process. Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B (GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition, when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL
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Efectos de la proteína SPARC sobre la maduración de las sinapsis autápticas colinérgicas

Albrecht, David 17 December 2012 (has links)
Las sinapsis son un elemento clave para el funcionamiento del sistema nervioso y la formación de las sinapsis es un proceso decisivo a lo largo de la vida. El establecimiento de los contactos sinápticos ocurre tanto en el sistema nervioso en desarrollo como en el cerebro adulto. Durante todo este proceso las neuronas y las células gliales se encuentran íntimamente acopladas por todo el sistema nervioso. Las investigaciones de las últimas décadas han evidenciado que las células gliales poseen un rol que va más allá del clásicamente atribuido, demostrando que la glía posee una función relevante en la formación y en el funcionamiento de las sinapsis mediante la secreción de diversas moléculas, las cuales han sido caracterizadas principalmente desde un punto de vista postsináptico. Para el estudio de la interacción neurona-glía, el laboratorio de Neurobiología ha implementado microcultivos de neuronas aisladas del ganglio cervical superior, sistema en el cual una neurona individual crece sobre una gota de colágeno haciendo contacto consigo misma. Los microcultivos establecidos rutinariamente en el laboratorio, consisten en una sola neurona que crece en ausencia de otros tipos celulares, denominados SCM; y una sola neurona que crece en presencia de células gliales o GM. Con este sistema, estudios previos realizados en el laboratorio demostraron que las células gliales incrementan la frecuencia de la neurotransmisión espontánea y modifica la plasticidad a corto plazo. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral, se estableció que la glía periférica inmadura in vitro e in vivo secretan la proteína matricelular SPARC, proteína que se expresa ampliamente en el sistema nervioso en desarrollo y en áreas sinaptogénicas, a pesar de lo cual se desconoce la función que tiene en el desarrollo y en la plasticidad. En este trabajo se caracterizan las funciones de SPARC sobre la neurotransmisión y la maduración de las sinapsis colinérgicas autápticas, observándose que concentraciones nanomolares de SPARC durante el desarrollo sináptico aumentan la frecuencia de la neurotransmisión espontánea e incrementan la depresión a corto plazo. La secreción local de SPARC sobre neuronas maduras durante 24-36 horas, incrementa solamente la depresión a corto plazo. Finalmente, mediante electrofisiológica y microscopía electrónica correlativa, demostramos que los terminales presinápticos desarrollados en presencia de concentraciones nanomolares de SPARC, presentan dos a tres veces menos vesículas sinápticas totales y vesículas sinápticas ancladas a las zonas activas. Las evidencias experimentales obtenidas en este trabajo señalan que la proteína matricelular SPARC retiene las sinapsis autápticas colinérgicas en un estado inmaduro. / The synapses are a key element for the Nervous system functions. They are established mainly during the nervous system development, but they can be formed in the adult nervous system as well. Neurons and glial cells are intimately coupled during all these processes. During the last decade it has been described that glial cells participate in the synapses establishment and information processing, they do so secreting factors. To study the neuron-glía interaction, our laboratory has set up neuronal microcultures, where a single neuron grows in a drop of collagen, a permissive substracte, surrounded by agarose, a non permissive substrate, forcing the neuron to develop inside the collagen drop, forcing it to have contact only with itself. These kind of synapses are called autapses. During this PhD thesis, we found that immature glial cells secrete SPARC in vitro and in vivo. We proved that SPARC has an effect over the neurotransmission and the presynaptic terminal maturations in cholinergic autapses; nanomolar concentration of SPARC applied during the neuronal development enhances the spontaneous neurotransmission and the short-term plasticity. We have also characterized that nanomolar concentration of SPARC decreases the total vesicular number and the docked vesicles number in presynaptic terminal. These experimental results obtained during the thesis lead us to propose that SPARC arrest the synapses in an immature stage.
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Cambios plásticos de adaptación ultra estructural de las conexiones nerviosas motoras en el adulto en respuesta a un incremento fisiológico de la actividad

Santafé i Martínez, Manel 09 July 1993 (has links)
Es conocido que las sinapsis cambian en condiciones de normalidad durante el desarrollo que culmina en la maduración. Sin embargo, se han identificado cambios funcionales de corta duración actividad-dependientes en adultos normales. Así en el decremento de uso aparecen fenómenos de crecimiento axonal por elongación de algunos segmentos axonales. Y en el incremento de uso, dominan los fenómenos de retracción de algunas ramas axonales. En este contexto, el presente trabajo tiene como pretensión final conocer de forma clara la capacidad de adaptación plástica de las conexiones neuromusculares en el adulto normal.MATERIAL Y METODOS: Se utilizó el músculo Extensor digitorum longus (EDL) de ratas Sprague-Dawley macho, de 12 semanas de edad. Los animales fueron sometidos a un moderado incremento de actividad locomotora mediante una cinta sin fin. Las bandas de inervación de los músculos EDL fueron procesadas para microscopia electrónica de transmisión convencional. Con las imágenes obtenidas (a 5000x y 10000x) se realizo un estudio morfométrico con el programa semiautomático de análisis de imágenes MOP VIDEOPLAN.CONCLUSIONES MÁS RELEVANTES:1- La retracción axonal en músculos control es compensado por los siguientes cambios en estructuras relacionadas con la neurotransmisión: mas y mayores vesículas sinápticas y también incrementa el numero de vesículas que están en contacto con el axolema sináptico; mas zonas activas axonales; las membranas densificadas de las crestas postsinápticas decrecen en longitud pero esto es compensado por un mayor número.2- Los resultados morfométricos indican claramente que pequeños cambios en el nivel de actividad locomotora inducen a precisas adaptaciones morfológicas de una forma rápida. El incremento en las densificaciones postsinápticas sugiere un mecanismo compensatorio postsináptico a la retracción axonal. / The activity pattern of neuromuscular junctions can influence the structure, growth and remodeling responses and differentiation of the motor nerve terminals. Nerve terminal remodeling involving changes of growth and retraction in the normal adult are affected by the level of the animal's activity. In fact, nerve terminal retraction in the adult can be induced by the level of increased synaptic activity. In the present work we tried to analyze if a small physiologic increase in the locomotor's activity of the normal adult rats during a brief period of time can induce pre- and postsynaptic ultrastructural adaptations.MATERIAL AND METHODS: The Extensor Digitorum Longus (E.D.L.) muscles of 24 three-month-old male Sprague-Dawley rats were studied. The experimental animals spontaneously adapted to the moderately exercise by training a treadmill. Normally housed rats were used as controls. The neural zones from the right and left E.D.L. muscles were fixed in glutaraldehyde and conventionally processed for T.E.M. Cross-sectioned different end plates were directly recorded in magnetic support with a high definition video system. Morphometric analysis of pre- and postsynaptic structural parametres was performed with a semiautomatic image analysis system (MOP VIDEOPLAN).MAIN CONCLUSIONS: 1- Axonal retraction in normal muscles can be compensated by the following changes in the neurotransmission-related structures: Synaptic vesicles increase in diameter and also increase the number of synaptic vesicles in contact with the synaptic axolemma; active zones increase in number; postsynaptic membrane densifications decrease in length and that is compensated by an increase in number of these.2- The morphometric data clearly indicate that small and early physiological changes in the locomotor's activity in the normal adult are followed by precise morphologic adaptations. The increased differentiation of postsynaptic membrane densifications would suggest the existence of the postsynaptic compensatory mechanism for the presynaptic retraction.
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Actividad neuronal en el cerebro humano / The neural activity in the human brain

Boza Pérez, Andrea Alessandra 08 July 2021 (has links)
La presente investigación tiene como objetivo diseñar una colección de indumentaria a partir del estudio teórico y visual de la actividad neuronal en el cerebro humano. El cerebro es el órgano principal que rige el organismo del cuerpo humano y está compuesto por dos subsistemas principales, el Sistema Nervioso Central y el Sistema Nervioso Periférico. La neurona, conocida como la unidad básica del Sistema Nervioso, es aquella que contiene toda la carga eléctrica y se encarga de almacenar y transmitir información; dando como resultado los movimientos voluntarios e involuntarios del cuerpo. Por ello, para este estudio, se realizó un riguroso análisis visual de la neurona, de la forma de sus partes principales: cuerpo, axón y dendritas; de su comportamiento en el cerebro y de su proceso de comunicación: la sinapsis. Se buscó interpretar la complejidad estructural y conductual de la neurona para lograr obtener una base creativa y sustentada para el desarrollo de la colección. En este proyecto, para el ámbito teórico, se recopiló información de artículos científicos, libros de ciencia y medicina, revistas académicas y; para el visual, de trabajos de laboratorio, videos, estudios oficiales y libros digitales relacionados al Sistema Nervioso, la neurona y la sinapsis neuronal. Asimismo, se realizó una entrevista a la neurocirujana Astrid Wicht, quien aportó significativamente y otorgó un punto de vista profesional y académico a la investigación. / The following research has the objective of creating a fashion collection, that comes from the theoretical and visual investigation of neural activity in the human brain. The brain is the main organ that controls the body. It is built upon two mayor main systems, the Central Nervous System, and the Peripheral Nervous System. The neuron is known as the basic unit of th nervous system, it oversees controlling electrical impulses, store energy and transmit information, as a result they control of voluntary and involuntary impulses. For this study, an intensive visual analysis of the neuron and its parts was made. The body, the axon, and the dendrite, how they behave in the brain and their process of communication: the synapsis. The structural and behavioral complexity of the neuron were our main goal as a creative base for the development of the collection. In this research regarding the theory, information from scientific articles, science and medicine books, academic magazines were gathered. For the visual; laboratories research, videos, official studies and digital books about the Nervous System, the neuron, and the synapsis. In addition, an interview to neurosurgeon Astrid Wicht was performed, who gave a professional and academic point of view to the investigation. / Trabajo de investigación
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Estudio de las vías de señalización intracelular asociadas a las proteínas inhibitorias de la mielina

Seira Oriach, Oscar 10 July 2012 (has links)
Lesioned axons do not regenerate in the adult mammalian central nervous system, owing to the overexpression of inhibitory molecules such as myelin-derived proteins or chondroitin sulphate proteoglycans. In order to overcome axon inhibition, strategies based on extrinsic and intrinsic treatments have been developed. For myelin-associated inhibition, blockage with NEP1-40, receptor bodies or IN-1 antibodies has been used. In addition, endogenous blockage of cell signalling mechanisms induced by myelin-associated proteins is a potential tool for overcoming axon inhibitory signals. We examined the participation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3beta) and ERK1/2 in axon regeneration failure in lesioned cortical neurons. We also investigated whether pharmacological blockage of GSK3beta and ERK1/2 activities facilitates regeneration after myelin-directed inhibition in two models: i) cerebellar granule cells and ii) lesioned entorhino-hippocampal pathway in slice cultures, and whether the regenerative effects are mediated by Nogo Receptor 1 (NgR1). We demonstrate that, in contrast to ERK1/2 inhibition, the pharmacological treatment of GSK3beta inhibition strongly facilitated regrowth of cerebellar granule neurons over myelin independently of NgR1. Lastly these regenerative effects were corroborated in the lesioned EHP in NgR1 -/- mutant mice. These results provide new findings for the development of new assays and strategies to enhance axon regeneration in injured cortical connections. On the other hand, and focused in the OMgp, by using recording electrophysiological nano-devices we found that, OMgp has a role in synaptic transmission, since it can induce excitatory postsynaptic potentials (EPSPs) in cultured hippocampal neurons.

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