Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética que possui uma cápsula polissacarídica robusta e é um dos agentes etiológicos da criptococose. A linhagem R265 de C. gattii foi responsável pelo surto de criptococose na Ilha de Vancouver e há vários estudos indicando sua dispersão e ocupação de novos nichos ecológicos. Fatores de virulência bem caracterizados deste patógeno incluem: a capacidade de sintetizar o pigmento antioxidante melanina, a produção de uma cápsula polissacarídica antifagocíticas e a capacidade de sobreviver e proliferar a 37°C. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi identificar proteínas envolvidas na resposta da linhagem R265 de C. gattii à variação de temperatura experimentada quando o fungo deixa o ambiente para sobreviver no hospedeiro, usando análise in vitro e proteômica comparativa. Nossos dados demonstram que as proteínas com expressão aumentada a 25°C atuam principalmente em processos metabólicos de proteínas, carboidratos, lípidios, ácidos orgânicos e aminoácidos e que as proteínas com expressão aumentada a 37°C, em sua maior parte, participam de processos que incluem fosforilação, metilação, processos catabólicos de corpos cetônicos, GTP e ATP e processos metabólicos de nucleosidios. A diferença mais notável entre as condições testadas é a predominância, no desenvolvimento de C. gattii a 25°C, de proteínas envolvidas em processos de oxirredução e a presença de um número considerável de proteínas envolvidas na resposta ao stress e em processos catabólicos no desenvolvimento a 37°C. Em suma, o presente estudo é a primeira análise proteômica a fornecer informação sobre proteínas reguladas pela variação de temperatura e a primeira descrição da resposta da linhagem hipervirulenta R265 de C. gattii à esta condição. As proteínas identificadas podem ser alvos para novos estudos na identificação de proteínas-chave para o desenvolvimento do fungo a 37°C e para a pesquisa de biomarcadores que podem contribuir para o tratamento e prevenção da criptococose causada por este patógeno. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast which has a robust polysaccharide capsule and is one of the etiological agents of cryptococcosis. The R265 strain of C. gattii was responsible for the Vancouver Island outbreak and there are various studies including their dispersal and occupation of new ecological niches. Well-characterized virulence factors of this pathogen include: the ability to synthesize the antioxidant pigment melanin; the production of an antiphagocytic polysaccharide capsule; and the ability to survive and proliferate at 37°C. In this sense, the objective of this study was identified proteins involved in the response of C. gattii strain R265 to the temperature variation experimented when the fungi leaves the environment to survive in the host, using in vitro analysis and comparative proteomics. Our data demonstrated that the proteins up-regulated at 25°C act mainly in protein, carbohydrate, lipid, organic acid and amino acid metabolic processes and proteins up-regulated at 37°C participate mostly in processes that include phosphorylation, methylation, ketone body, GTP and ATP catabolic process and nucleoside metabolic process. The most striking difference between the conditions tested is the prevalence of proteins involved in oxidation-reduction in C. gattii growth at 25°C and the presence of a relevant number of proteins involved in stress response and catabolic process in C. gattii growth at 37°C. In brief, this study is the first proteomic analysis to provided information about proteins regulated by the infection temperature and the first description of the response of C. gattii high virulent strain R265 to this condition. The proteins identified could be targets to further studies for the identification of key proteins for the development at 37°C and to the search for biomarkers that can contribute to the treatment and prevention of cryptococcosis caused by this pathogen.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio expressa e secretada por astrócitos, e possui efeito parácrino sobre os neurônios, atuando como fator neurotrófico. Estudos clínicos sugerem que níveis plasmáticos elevados de S100B estão correlacionados positivamente com a resposta à terapia antidepressiva, particularmente quando se utilizam inibidores seletivos da recaptação de serotonina, mas este mecanismo ainda é desconhecido. Neste trabalho foi avaliada a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos e fatias hipocampais de ratos expostos à fluoxetina e serotonina. Foi observado um significativo aumento da secreção de S100B frente à fluoxetina, e este efeito foi aparentemente dependente de PKA. Estes dados reforçam a importância da fluoxetina, independentemente da serotonina e receptores serotoninérgicos, no tratamento antidepressivo, bem como o papel da S100B nos distúrbio depressivos. / S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes, which has a putative paracrine neurotrophic activity. Clinical studies have suggested that peripheral elevation of this protein is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs); however, the mechanism remains unclear. Here, we measured S100B secretion directly in hippocampal astrocyte cultures and hippocampal slices exposed to fluoxetine and observed a significant increment of S100B release in the presence of this SSRI, apparently dependent on PKA. Moreover, we found that serotonin (possibly 5HT1A receptor) reduces S100B secretion and antagonizes the effect of fluoxetine on S100B secretion. These data reinforce the effect of fluoxetine, independently of serotonin and serotonin receptors, suggesting a putative role for S100B in depressive disorders and that other molecular targets may be relevant for antidepressant activity.

S100B é uma citocina produzida e secretada por astrócitos, que está envolvida no ciclo de citocinas desencadeado pela IL-1β na doença de Alzheimer. Entretanto, a secreção de S100B seguida de estímulo pela IL-1β não tem sido demonstrado diretamente. Nós investigamos a secreção de S100B em culturas gliais e fatias hipocampais expostas a IL-1β. Culturas corticais primárias de astrócitos, células de glioma C6 e fatias hipocampais agudas de ratos Wistar expostas a IL-1β (de 1 pg a 10ng/mL) foram utilizadas.S100B extracelular foi medida por ELISA. Migração nuclear de NF-κB foi investigada por imunocitoquímica e immunoblotting. A secreção de S100B também foi avaliada na presença de inibidores de NF-κB e MAPK. A análise estatística foi realizada utilizando teste t de Student ou ANOVA de uma via, assumindo p< 0.05. A secreção de S100B foi estimulada por IL-1β em todas as preparações. Migração nuclear de NF-κB também foi observada nessas condições experimentais. PDTC (inibidor de NF-κB) e PD98059 (inibidor da via ERK) foram hábeis em inibir o aumento da secreção do S100B. Níveis micromolares de S100B, assim como IL-1β, induziram a produção de óxido nítrico. Nossos dados demonstram que a IL-1β induz um aumento da secreção basal de S100B nos três diferentes modelos in vitro utilizados: astrócitos corticais primários, células C6 e fatias hipocampais de ratos, e que esse aumento na secreção foi mediado pela via de sinalização MAPK-ERK/NFκB. Astrócitos primários e glioma C6 exibiram diferente sensibilidade a IL-1β na modulação tanto da secreção, quanto da expressão de S100B. Esses resultados sugerem que S100B extracelular pode contribuir para respostas reparativas em lesões cerebrais agudas, bem como para desordens neurodegenerativas em lesões crônicas. O mecanismo de indução de secreção de S100B por IL-1β suporta a hipótese de um "ciclo de citocinas", proposto na gênese da doença de Alzheimer. / S100B is an astrocyte-derived cytokine, which has been implicated in the IL-1β- triggered cytokine cycle in Alzheimer’s disease. However, the secretion of S100B following stimulation by IL-1β has not been directly demonstrated. We investigated S100B secretion in glial preparations and hippocampal slices exposed to IL-1β. Cortical primary astrocyte cultures, C6 glioma cells and acute hippocampal slices from the brain of Wistar rats exposed to IL-1β (from 1pg to 10ng/mL) were utilized. Extracellular S100B was measured by ELISA. Nuclear migration of NF-κB was investigated by immunocytochemistry and immunoblotting. S100B secretion was also evaluated in the presence of specific inhibitors for NF-κB and MAPK. Statistical analyses were carried out by Student t test or one-way ANOVA, assuming p < 0.05. IL-1β-stimulated S100B secretion was observed in all preparations. Nuclear migration NF-κB was also observed under these experimental conditions. PDTC (an inhibitor of NF-κB) and PD 98059 (an inhibitor of ERK) inhibited S100B secretion stimulated by IL-1β. S100B, at micromolar levels, like IL-1β, was able to induce NO production. Our data demonstrate IL-1β-induced S100B secretion in three different in vitro preparations: cortical primary astrocytes, C6 glioma cells and hippocampal slices of rats; this secretion was mediated by MAPK-ERK/NF-κB signalling. Primary astrocytes and C6 cells exhibited different sensitivities to IL-1β concerning S100B expression and secretion. These results suggest that extracellular S100B could contribute to a reparative response in acute brain injury, as well as in neurodegenerative disorders due to chronic injury. The mechanism of IL-1β-induced S100B secretion supports the hypothesis for a “cytokine cycle”, proposed in the genesis of Alzheimer disease.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-17T18:40:37Z No. of bitstreams: 1 Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T18:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados, quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo, os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi- Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram utilizados soros de cães com outras patologias: leishmaniose tegumentar (n = 10), tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12 obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose, tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com leishmaniose visceral canina testados. Foram identificadas duas combinações compostas por cinco antígenos, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 e Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5. Quando comparado o reconhecimento desses conjuntos com a combinação de Lci1A e Lci2B foi observado um aumento de 77% para 87%, no entanto não foi observada diferença estatística (p= 0,098) apesar desse incremento. Esse achado aponta para possibilidade de avaliar os dois conjuntos em um teste imunocromatográfico no formato do teste final (DPP). Em resumo, utilizando o teste de triagem MAPIA foi possível selecionar dois conjuntos de cinco proteínas recombinantes de L. infantum que mostraram potencial para compor um teste imunodiagnóstico no formato DPP multi-antígenos. / Leishmaniasis is an antropozoonosis caused by different protozoa of the genus Leishmania. It is estimated that approximately 350 million of people are at risk areas, with annual incidence of approximately two million new cases worldwide. The dog is the main reservoir in urban centers and the sandfly is the vector responsible for transmission. In Brazil, according to the recommendations of the Ministry of Health, seropositive dogs for leishmaniasis should be euthanized. The diagnosis is made by the DPP-LVC® as screening and ELISA as confirmatory. Studies have shown that DPP-LVC® is not able to detect a portion of the dog population, which may contribute to the perpetuation of the disease in these areas. Twelve recombinant proteins (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) were cloned and sequenced in a previous study, but were not fully characterized for antigenicity. Our hypothesis is that a set of selected recombinant antigens of L. infantum may increase the identification of infected animals in endemic areas. The aim of this study was identify a set of recombinant antigens of L. infantum from 12 previously selected for recognition by sera from infected dogs to compose an immunodiagnostic test for canine visceral leishmaniasis. The 12 recombinant antigens were produced in our laboratory and purified in Bio-Manguinhos. MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), which consists in a screening platform for antigen in nitrocellulose paper, was used to assess the recognition of recombinant antigens for 12 sera of dogs infected. MAPIA is closer to rapid test DPP-CVL® than other screening tests. We used this screening method with sera positive for canine visceral leishmaniasis (n = 39) obtained in a cross-sectional epidemiological study in endemic area. For evaluation of cross-reactivity, sera from dogs with other diseases: cutaneous leishmaniasis (n = 10), canine trypanosomiasis (n = 10) babesiosis (n = 10) and ehrlichiosis (n = 11), and animal sera negative (n = 40) were used. Initially, was decided that the best protocol to be used in the assays. Subsequently, screening of antigens was performed with sera and to evaluate the reliability of the results, the tests were read by two observers independently. The agreement between visual readings of the two observers was assessed using the kappa index. The Fisher exact test was used to evaluate statistical differences between the positivity rate of the proteins studied. The proteins Lci1A and Lci2B were recognized by 74% and 69%, respectively. Lci4 (33%), Lci5 (31%) and Lci12 (33%) achieved a good degree of recognition by antibodies present in serum. We observed low reactivity of sera from dogs with babesiosis, ehrlichiosis, and canine trypanosomiasis with the 12 recombinant proteins. Sera from dogs with cutaneous leishmaniasis were most likely reacted with the recombinant proteins. Combinatorial analyzes were performed to identify a set of antigens from the 12 previously selected, that can identify the larger number of sera from dogs with canine visceral leishmaniasis. We identified two combinations composed of five antigens, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 and Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5 that were most recognized by serums. When compared recognition of combination of Lci1A + Lci2B and two sets of 5 proteins, sensitivity increased from 77% to 87%, however this increase was not statistically different (p = 0.098). Despite this finding did not reach statistical significance, points us to evaluate the possibility of two sets in an immunoassay format of the final test (DPP). In summary, using MAPIA, two sets of five recombinant proteins of L. infantum showed potential to be used in immunodiagnostic test in multi-antigens DPP.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:37:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247981.pdf: 1781469 bytes, checksum: a099ea9e628cb5c63de8bfd3d28635a1 (MD5) / O uso de caudas de afinidade tem facilitado a purificação de proteínas recombinantes para aplicações bioquímicas, terapêuticas e estudos estruturais. A cauda mais comum é a cauda contendo seis-histidinas (His-tag) porque permite a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Em alguns casos, as caudas de tamanhos maiores podem aumentar a solubilidade da proteína de interesse. Em outros, a presença da cauda pode alterar a conformação estrutural da proteína, a atividade, interações proteína-proteína e a formação de cristais com um bom padrão de difração, necessário para elucidar a estrutura tridimensional. Todos esses efeitos negativos reforçam a importância de realizar uma caracterização funcional das proteínas expressas com caudas e que a clivagem das mesmas é de grande utilidade antes de realizar estudos funcionais e estruturais. A protease TEV é uma das mais utilizadas para clivar a cauda de proteínas recombinantes porque ela reconhece uma seqüência de aminoácidos muito específica (EXXYXQ*S/G) (onde X pode ser qualquer resíduo) e é ativa a baixas temperaturas e na presença de inibidores de protease adicionados durante o processo de purificação. A protease TEV é disponível comercialmente na forma solúvel, porém é muito cara. Quando a TEV é utilizada na forma solúvel, ela deve ser separada da proteína de interesse. Esta separação é normalmente realizada por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular, que permite a separação da cauda, da proteína clivada e não clivada. Nos casos em que a proteína de interesse possua uma massa molecular semelhante a protease TEV, são necessárias etapas adicionais de purificação diferentes da gel filtração. Quando um grande número de proteínas é estudada, como nos projetos de genômica estrutural para a cristalização de proteínas, a produção da TEV deve ser contínua nos laboratórios, aumentando o custo do processo de purificação. Neste trabalho, a protease TEV foi produzida e imobilizada em diferentes suportes visando obter um biocatalisador ativo, estável e que possa ser reutilizado em vários processos de clivagem de caudas de histidina de proteínas recombinantes. Para isso, foram utilizadas três estratégias: a primeira pela imobilização no suporte glutaraldeído-agarose (G-agarose) que permite a ligação da TEV pelos grupos e-amino das lisinas. A segunda pela imobilização em tiolsulfinato-agarose (TSI-agarose) pela união da proteína pelos grupos tiol das cisteínas e a última pela imobilização pelos grupos tiol e por outros nucleófilos da superfíce da TEV. O rendimento da purificação das proteínas a partir de 1 litro de cultivo foi de 20 mg para a TEV e 5 mg para o substrato da TEV. A protease TEV imobilizada em TSI-agarose clivou 100% do substrato em 24 h a temperatura ambiente e a imobilizada em G-agarose clivou 50% do substrato nas mesmas condições. A TEV imobilizada em TSI-agarose foi mais estável que a enzima solúvel durante um período de armazenamento de 16 dias a 4°C e pode ser reutilizada em pelo menos cinco ciclos de clivagem.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-02-02T16:28:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1522665 bytes, checksum: 58e369104aa4e0c485fa0b5e6d290b0a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-02T16:28:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1522665 bytes, checksum: 58e369104aa4e0c485fa0b5e6d290b0a (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A PhaP é uma pequena molécula proteica com característica anfifílica, localizada na superfície de grânulos de polihidroxialcanoatos (PHA) e a sua habilidade em interagir com superfícies hidrofóbicas despertou interesse pela sua atividade como biosurfactante. Durante experimentos de expressão heteróloga da proteína PhaP em Escherichia coli, fora observado a “solubilização” atípica dos componentes celulares após a lise pelo processo de sonicação; entretanto, os métodos de ruptura de célula para liberação das moléculas produzidas por E. coli recombinante levam a liberação de grandes quantidades de LPS. Dessa forma, os produtos provenientes dessa bactéria, precisam passar por processos de purificação. Neste trabalho foi avaliado a toxicidade do biossurfactante PhaP de Azotobacter sp. FA8, expresso em E. coli, e três diferentes metodologias de purificação, sendo, aquecimento (AQ), precipitação fracionada (S.A) e cromatografia de afinidade (C.A) e, ao final, as proteínas foram liofilizadas, diluídas na quantidade de 50 mg/kg e utilizadas para o teste de toxicidade in vivo. Não ocorreu a morte de nenhum animal durante os 14 dias de tratamento diário, entretanto, a partir do 4o dia de tratamento alguns animais apresentaram diarreia. Tanto a série vermelha (RBC, HGB e HCT) quanto a série branca (WBC, LYM, MID e GRA) se mantiveram inalteradas em relação à quantidade e morfologia nos diferentes tratamentos. Não foi observada diferença nos níveis de creatinina, ureia e no perfil lipídico dos animais (colesterol total, triglicerídeos, HDL, VLDL e LDL). A quantidade de albumina foi maior no grupo C.A em relação ao grupo S.A, a quantidade de ALT e AST foi maior em relação aos grupos C.A e S.A e C.A, S.A e controle, respectivamente. Não foram observadas diferenças na morfologia nos órgãos dos animais tratados durante 14 dias consecutivos com a PhaP. Dessa forma concluí-se que através da associação da análises histológica, ausência na alteração dos valores do hemograma, da creatinina e da ureia que o biossurfactante PhaP, assim como possíveis vestígios de LPS presentes na amostra, não foram capazes de alterar a estrutura morfológica das células, o funcionamento dos órgãos associados ao metabolismo e digestão de substâncias ingeridas pelo trato gastro-intestinal, nem provocaram intoxicação nos animais. / PhaP is a small amphiphilic protein molecule located on the surface of polyhydroxyalkanoate (PHA) granules and its ability to interact with hydrophobic surfaces has aroused interest in its activity as biosurfactants. During experiments of heterologous expression of the PhaP protein in Escherichia coli, our research group observed atypical "solubilization" of the cellular components after lysis by the sonication process, however, the cell rupture methods for release of the molecules produced by E. coli recombinant cells lead to the release of large amounts of LPS. In this way, the products derived from this bacterium must undergo purification processes. The low toxicity of Azotobacter sp. Biosurfactant PhaP was tested. (AQ), fractional precipitation (SA) and affinity chromatography (CA), and, finally, the proteins were lyophilized, diluted in the amount of 50 mg / kg and used for the in vivo toxicity test. No animals died during the 14 days of daily treatment, however, from the 4th day of treatment, some animals presented diarrhea. Both the red series (RBC, HGB and HCT) and the white series (WBC, LYM, MID and GRA) remained unchanged in relation to the quantity and morphology in the different treatments. No difference was observed in creatinine, urea and lipid profile of the animals (total cholesterol, triglycerides, HDL, VLDL and LDL). The amount of albumin was higher in group C.A compared to group S.A, the ALT and AST was higher in groups C.A and S.A or C.A, S.A and control, respectively. No difference was observed in the morphology of the organs of the animals treated for 14 consecutive days with PhaP. In this way, was concluded by associating histological analysis, absence of changes in hemogram, creatinine and urea values, that the PhaP biosurfactant, as well as possible traces of LPS present in the sample, were not able to alter the morphological structure of the cells. functioning of the organs associated with the metabolism and digestion of substances ingested by the gastro-intestinal tract and did not provoke intoxication in the animals.

CRUZ, F. D. A. M. Caracterização físico-química de proteínas presentes na membrana de hemácias de pacientes com anemia falciforme. 2013. 80f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:33:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_fdamcruz.pdf: 2045057 bytes, checksum: a0cb1ea43ac3bc0105250682d5ce4ec5 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:47:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_fdamcruz.pdf: 2045057 bytes, checksum: a0cb1ea43ac3bc0105250682d5ce4ec5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:47:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_fdamcruz.pdf: 2045057 bytes, checksum: a0cb1ea43ac3bc0105250682d5ce4ec5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Sickle cell anemia (SCA) is the most common hereditary disease in Brazil and is present in about 0.1 to 0.3% of the population of African origin. This disease is caused by homozygous mutation of a single nucleotide (Glu6Val gene Hb S) that modify the function of the red cell in the body, which implies changes in membrane components and, consequently, the event sickling of red blood cells, causing vaso-occlusion. In this work we aim to identify, quantify and correlate changes in erythrocyte membrane glycoproteins associated with the framework and clinical evolution of the disease, using ion exchange chromatography (IEC) and SDS-PAGE. Were performed ion exchange chromatography on membrane proteins extracted from peripheral blood erythrocytes of 31 patients with AF. The chromatograms showed significant differences in the concentration of protein present in the membranes of red blood cells when we relate absorbance / elution range between seizure freedom and volunteers without a diagnosis of AF, depending on the clinical manifestations, patients may show differences in protein concentration. 1D SDS-PAGE revealed the presence of distinct proteins, suggesting that there are differences in the type and concentration of membrane proteins in sickle erythrocytes (both in patients without crisis as a crisis), when related to those extracted from red cells not anemic. In SDS-PAGE 2D 254 spots were identified, of which 8 spots were not identified by the program TagIdent. Most spots were distributed in the pH range 7-10, with a predominance of proteins with molecular weight less than or equal to 20 kDa. Our results suggest that analysis of sickle cells by IEC, followed by SDS-PAGE (1D and 2D), allowed differentiation and partially characterize membrane proteins of erythrocytes of patients (symptomatic and asymptomatic) with AF when related to volunteers without a diagnosis of AF . Our data reinforce the variety of biomodulation related AF, suggesting that their identification is of paramount importance for the study of adhesion between these cells sickle and the endothelium, which triggers vaso-occlusion, resulting in various symptoms / A anemia falciforme (AF) é a doença hereditária mais comum no Brasil e está presente em cerca de 0,1 a 0,3% da população afrodescente. A doença é uma homozigotia causada pela mutação de um único nucleotídeo (Glu6Val no gene Hb S) que altera a função da célula vermelha no organismo, o que implica em alterações nos componentes da membrana e, em conseqüência, o evento de falcização das hemácias, desencadeando crises de vaso-oclusão. Nesse trabalho objetivamos identificar, quantificar e correlacionar alterações em glicoproteínas da membrana eritrocitária associados com o quadro e evolução clínica da enfermidade, utilizando cromatografia de troca iônica (IEC) e SDS-PAGE. Foram realizadas cromatografias de troca iônica em proteínas de membrana extraídas de hemácias de sangue periférico de 31 portadores de AF. Os cromatogramas revelaram diferenças significativas quanto à concentração de proteínas presentes nas membranas das hemácias quando relacionamos absorbância/faixa de eluição entre pacientes sem crises e voluntários sem diagnóstico de AF; dependendo das manifestações clínicas, pacientes podem apresentar diferenças nas concentrações protéicas. SDS-PAGE 1D revelou a presença de proteínas distintas, sugerindo que há diferenças no tipo e na concentração das proteínas de membrana de hemácias falcêmicas (tanto em pacientes sem crise, quanto em crise) quando relacionadas àquelas extraídas da membrana de hemácias não falcêmicas. Na SDS–PAGE 2D foram identificados 254 spots, dos quais 8 spots não foram identificados pelo programa TagIdent. A maioria dos spots estavam distribuídos na faixa de pH 7-10, com predomínio de proteínas com massa molecular menor ou igual a 20 KDa. Nossos resultados sugerem que análise das células falcêmicas por IEC, acompanhadas de SDS-PAGE (1D e 2D), permitiu diferenciar e caracterizar parcialmente proteínas de membrana de hemácias de pacientes (sintomáticos e assintomáticos) com AF quando relacionadas ao controle, sem diagnóstico de AF. Nossos dados reforçam a variedade de biomoduladores relacionados AF, sugerindo que sua identificação é de suma importância para o estudo da adesão entre células falcêmicas e destas ao endotélio, o que pode desencadear a vasoclusão, resultando em diversos sintomas.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T15:55:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T15:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) Previous issue date: 2010-01-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são expressos por muitos organismos e apresentam uma função multifacetada. Estudos os têm revelado como potenciais agentes antibacterianos, defensivos agrícolas, medicamentos cicatrizantes, imuno-moduladores, agentes quimiotáticos, entre outros. Defensinas, a maior família dos peptídeos antimicrobianos, são moléculas com prevalência catiônica, ricas em cisteínas, apresentando em geral três ou quatro pontes dissulfídicas. São constituídas de 45 a 54 resíduos de aminoácidos, encontradas em organismos vertebrados e invertebrados, apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e vírus encapsulados. Essas moléculas apresentam baixa toxicidade a animais e plantas, justificando assim seu uso como drogas ou defensivos agrícolas. As defensinas atuam por meio de atrações eletrostáticas com a face externa das membranas celulares alvo, gerando poros e ocasionando morte celular. Elas também atuam, segundo estudos recentes, como sinalizadores primários e secundários em vias apoptóticas e como agentes potencializadores das defesas imunológicas, sendo o mecanismo de atuação molecular ainda desconhecido. A busca por AMPs de plantas tem sido realizada no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB/UFV) visando à caracterização estrutural desses peptídeos. O isolamento de peptídeos antimicrobianos de extratos solúvel (ES) e de parede celular (EP) de folhas de pimentão da variedade Sunshine foi realizado por etapas pré-cromatográficas (centrifugações, fracionamento salino e por ultrafiltrações) e por cromatografia líquida multidimensional offline. As frações de interesse obtidas de ES e de EP foram testadas em relação à sua atividade antimicrobiana contra o fungo Alternaria solani e contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positiva, e Ralstonia solanacearum, Gram negativa, pela técnica de microplacas, evidenciando a inibição do crescimento desses microrganismos. Os resultados sugerem a ocorrência de aglomerações dos AMPs nos extratos, dadas as características de hidrofobicidade e cargas desses peptídeos, e que as etapas de separação por massas moleculares devem ser realizadas visando reduzir esses efeitos. O procedimento experimental proposto ao final do trabalho, que envolve o fracionamento por sal e por ultrafiltração, seguindo-se cromatografia de fase reversa em C4, permitiu a separação das amostras em frações com atividades antimicrobianas diferentes e potencialmente de interesse para a exploração comercial na defesa de plantas. A construção de um banco de dados que agrupe informações sobre defensinas, possibilitando evidenciar relações entre as moléculas já conhecidas e sequências não identificadas, apresenta-se de grande importância para a complementação dos estudos crescentes sobre esses peptídeos. As bases de dados do DefDB já estão disponíveis e podem ser utilizadas para identificação de sequências obtidas por métodos de sequenciamento, seja pelo alinhamento com a sequência obtida, ou pela identificação comparativa utilizando ferramentas computacionais específicas, como programas e pipelines utilizados para análises de dados de espectrometria de massa. Assim, as informações obtidas desse banco de dados, com a ajuda de ferramentas de análises já disponíveis na rede mundial de computadores, podem colaborar para a identificação de novas sequências, para a elucidação do mecanismo de atuação molecular, além de contribuir para direcionar estudos iniciais sobre esses peptídeos. Portanto, a obtenção de frações com alta atividade antimicrobiana, juntamente com o desenvolvimento de bases de dados específicas, que facilitem a identificação dos possíveis peptídeos antimicrobianos presentes nessas frações, pode ser o caminho para o estudo e o isolamento de novos compostos naturais, capazes de substituir defensivos agrícolas danosos ao ambiente, e/ou serem utilizados como base de medicamentos para combater infecções e doenças imunológicas. / Antimicrobial peptides (AMPs) are expressed by many organisms and have a multifaceted role. Studies have revealed the AMPs as potential antibacterial agents, pesticides, drugs, healing, immune modulators, chemotactic agents, among others. Defensins, the largest family of antimicrobial peptides, are cationic molecules, rich in cysteines, with four disulfide bridges. They consist of 45 to 54 amino acid residues, found in vertebrate and invertebrate organisms, presenting activity against Gram-positive and Gram- negative bacteria, fungi and encapsulated virus. These molecules have low animals and plants toxicity, thereby justifying their use as drugs or pesticides. The defensins act by means of electrostatic attractions with the external surface of the target cell membranes, creating pores and causing the cell death. They also operate, according to recent studies, such as primary and secondary signs in the apoptosis via and as enhancers of immune defenses, being the molecular mechanism of action still unknown. The search for AMPs in plants has been performed at the Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB / UFV) aiming to characterize the structure of these peptides. The process of separation of peptides was performed by pre-chromatographic step (centrifuging, saline precipitation and ultrafiltration) and offline multidimensional liquid chromatography. The fractions of interest obtained from ES and EP were tested about their antimicrobial activity against the fungus Alternaria solani and against the bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positive, and Ralstonia solanacearum, Gram negative, the microplate technique, showing the inhibition of growth of these microorganisms. The results indicated the occurrence of possible agglomeration of AMPs in the extracts, given the characteristics of hydrophobicity and charges of these peptides, and that the separation steps by molecular weight should be carried out to reduce these effects. The experimental procedure proposed by the latter, which involves the fractionation by salt and by ultrafiltration followed by reverse- phase chromatography on C4, allowed the separation of samples into fractions with different antimicrobial activities and potentially of interest to the commercial exploration to the plants defense. The construction of a data bank to collate information about defensins, allowing the construction of relations between the molecules that have been discovered and unidentified sequences, presented as a very important achievement for the complementation of studies about these peptides. The DefDB databases are available and can be used to identify the sequences obtained by sequencing methods, either by aligning the sequence obtained, or by the comparative identification using specific computational tools, such as programs and pipelines used for data analysis of MS. Thus, the information of this data bank, helped by analysis tools already available on the World Wide Web, may contribute to the identification of new sequences, to elucidate the molecular mechanism of action, and contributes to guide initial studies about these peptides. Therefore, the obtation of fractions with high antimicrobial activity, together with the development of specific databases, to facilitate the identification of potential antimicrobial peptides in these fractions, may be the way to the study and isolation of new natural compounds that can replace harmful pesticides to the environment, and/or be used as the basis for drugs to fight against infections and immune disorders. / Dissertação antiga, falta ficha catalog.

MELO, Révila Bianca Ferreira de. Estudo comparativo do perfil proteico do fluido intersticial testicular de espécies de valor zootécnico. 2017. 63 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)–Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Francisca Gomes (francisbeserra@yahoo.com.br) on 2017-09-13T18:37:20Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_ rbfmelo.pdf: 1100069 bytes, checksum: aaad6fa2df65b3120bad73c18b577398 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T21:51:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_ rbfmelo.pdf: 1100069 bytes, checksum: aaad6fa2df65b3120bad73c18b577398 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T21:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_ rbfmelo.pdf: 1100069 bytes, checksum: aaad6fa2df65b3120bad73c18b577398 (MD5) Previous issue date: 2017 / The testicular interstitial fluid (FIT) is located in the interstitial region of the testis, which is synthesized by Leydig cells, lymphatic and blood cells and connective tissue. FIT performs several functions, such as: transport of hormones and nutrients to the seminiferous epithelium, transport of spermatozoa and has influence on endocrine and gametogenic functions of the testis. In the constitution of FIT it is possible to find proteins synthesized by several cell types, such as Sertoli cells, Leydig cells and germ cells. The volume and concentration of certain FIT proteins are sensitive to changes in the endocrine hormones and changes in the local testicular environment, thus, the protein constitution of FIT may reflect the status of spermatogenesis. From the information above, the objective of the present work was to build the protein profile of FIT, in addition to performing a comparative analysis of the protein profile with different species that present zootechnical value (bovine, ovine, rabbit and quail). The FIT was collected by percolation and the proteins were precipitated with cold ethanol (4 ° C). Subsequently, the proteins were sepals by one-dimensional electrophoresis with a 4% mesh in the stacking gel and 10% in the running gel. Then, the protein bands obtained on the gel were analyzed through the QuantityOne® program and compared through the unpaired T-test (p <0.05) through Statview®. 263 bands were detected in the triplicate of bovines, 317 proteins in triplicate of TIF geis of sheep, 218 bands in rabbits and 217 bands in TIF of quail. It was observed that there are 9 bands in common with all species and while in the mammals adopted in the study it was observed that there are 10 bands in common, however, the statistical difference in relation to these bands. Comparing the pattern of the gels made with other studies it was observed that TIF proteins have several origins, such as: blood plasma, seminiferous tubules, seminal plasma and others, and that most TIF proteins are synthesized by the Sertoli cells. Leydig and germinating. From the construction of the protein profile, it was observed that the electrophoresis technique is effective for the detection of protein bands. However, it is necessary to identify mass spectrometry to amplify the information about TIF proteins: origin of these proteins and how they can act under the spermatogenesis. / O fluido intersticial testicular (FIT) é localizado na região intersticial do testículo, ao qual é sintetizado pelas células de Leydig, células linfáticas e sanguineas e tecido conectivo. O FIT desempenha diversas funções, como: transporte de hormônios e nutrientes para o epitélio seminífero, transporte de espermatozoides e apresenta influência em funções endócrinas e gametogênicas do testículo. Na constituição do FIT é possível encontrar proteínas sintetizadas por diversos tipos celulares, como as células de Sertoli, células de Leydig e as células germinativas. O volume e a concentração de determinadas proteínas do FIT são sensíveis a mudanças dos hormônios endócrinos e alterações do ambiente local testicular, dessa maneira, a constituição proteica do FIT pode refletir o status da espermatogênese. A partir das informações acima, o objetivo do presente trabalho foi construir o perfil proteico do FIT, além de realizar uma análise comparativa do perfil protéico com diferentes espécies que apresentam valor zootécnico (bovino, ovino, coelho e codorna). O FIT foi coletado por percolação e, as proteínas foram precipitadas com etanol frio (4°C). Posteriormente, as proteínas foram separdas por eletroforese unidimensional ao qual apresentava uma malha de 4% no gel de empilhamento e 10% no gel de corrida. Em seguida, as bandas proteicas obtidas no gel foram analisadas através do programa QuantityOne® e comparadas através do teste T não pareado (p< 0,05) através do Statview®. Foram detectadas na triplicata 263 bandas na triplicata de bovinos, 317 proteínas na triplicata de geis de TIF de ovinos, 218 bandas em coelhos e 217 bandas em TIF de codorna. Foram observados que existe 9 bandas em comum com todas as espécies e enquanto nos mamíferos adotados no estudo se observou que existe 10 bandas em comum, entretanto, a diferença estatística em relação a essas bandas. Comparando o padrão dos géis confeccionados com outros estudos notou-se que as proteínas do TIF apresentam diversas origens, como: plasma sanguíneo, túbulos seminíferos, plasma seminal e dentre outros e que grande maioria das proteínas do TIF são sintetizada pelas células de Sertoli, de Leydig e germinativas. A partir da construção do perfil protéico, foi observado que a técnica de eletroforese é eficaz para detecção das bandas protéicas. Entretanto, é necessária a identificação da espectrometria de massa para ampliar as informações sobre as proteínas do TIF: origem dessas proteínas e como elas podem atuar sob a espermtogênese.