Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-06-29T13:12:56Z No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / A crise energética que vem atualmente sendo estabelecida mundialmente deve-se principalmente à elevação de preços e escassez de fontes de petróleo. Em virtude disso, novas fontes para a produção de combustíveis tem sido exploradas, entre elas, o amido para a produção de bioetanol. Para fermentação alcoólica o amido deve ser clivado para liberação das moléculas de glicose presentes em sua estrutura. Uma das enzimas necessárias nesse processo é a α-amilase, responsável pela hidrólise das ligações α-1,4 do amido liberando maltose e oligossacarídeos. Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma α-amilase (Amy1), proteína da levedura Cryptococcus flavus, expressa em Saccharomyces cerevisiae. A Amy1 foi obtida a partir do crescimento da levedura recombinante por 72 horas em meio de cultura com extrato de levedura como fonte de nitrogênio e purificada por cromatografia de troca iônica e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima em pH 5,5. Estudos de dicroísmo circular (CD) da Amy1 recombinante em comparação com a proteína selvagem mostraram que a expressão em um organismo diferente não alterou significativamente a estrutura da α-amilase recombinante. A estrutura secundária da Amy1 recombinante em água a 25°C é constituída de 9,1% de α-hélice e 32,7% de folhas-β e da Amy1 selvagem de 8,2% de α-hélice e 34,7% de folhas-β. Nenhuma das proteínas apresentou padrão de desnaturação com a elevação da temperatura até 95°C, indicando a estabilidade estrutural dessas moléculas. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína recombinante apresenta uma população de triptofano predominantemente semi-enterrada. O microambiente desse aminoácido é parcialmente carregado positivamente, indicado pelos valores das constantes de Stern-Volmer (Ksv) obtidas para a partir da atenuação de fluorescência pela acrilamida, cloreto de césio e iodeto de potássio, nos pHs 5,5; 7,0 e 9,0. Mudanças conformacionais da proteína ocorrem em pHs neutro e alcalino levando a inativação da enzima. No entanto, as mudanças ocorridas em pH 5,5 são importantes para o aumento da atividade catalítica dessa enzima. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The energy crisis currently established worldwide has been the main motivation to explore new sources for fuel production, as starch used for bioethanol. In this process the α-amylase, responsible for the hydrolysis of the starch α-1-4 covalent bonds, is used to release maltose and oligosaccharides. Here, we present structural and biophysical studies of the α-amylase (Amy1) from yeast Cryptococcus flavus, expressed in Saccharomyces cerevisiae. The Amy1 was obtained from recombinant yeast in culture medium for 72 hours with yeast extract as nitrogen source. The enzyme was purified by ion exchange and molecular exclusion chromatography and presents optimal activity in pH 5.5. Structural studies using circular dichroism (CD) spectroscopy showed that recombinant and wild type amylases (Amy1) are structurally similar. The secondary structure content of recombinant and wild Amy1 in water at 25°C consists of 9.1% and 8.2% α-helix, 32.7% and 34.7% β-sheet, respectively. The amylases were characterized as thermal stable proteins, since none denaturation profile was observed under increasing temperature up to 95°C. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer approximation revealed that the recombinant protein has a population of tryptophan predominantly semi-buried. The tryptophan microenvironment is partially positively charged, indicated by the values of the Stern-Volmer constant (KSV) obtained from attenuation of fluorescence by acrylamide, cesium chloride and potassium iodide at pH 5.5, 7.0 and 9.0. Protein conformational changes occur in neutral and alkaline pH leading to inactivation of the enzyme. However, at pH 5.5 these conformational changes are important for increasing the catalytic activity of this enzyme.

Dissertação (mestrado)-Universidade Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T14:22:35Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1320639 bytes, checksum: d8a0c917dabc31eb56d6427c44f07a2d (MD5) / Rejected by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com), reason: Documento não está bloqueado on 2012-07-13T10:36:42Z (GMT) / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-13T11:54:18Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / O estudo do enovelamento de proteínas e a predição de suas estruturas nativas são de grande importância para a ciência. Uma das abordagens possíveis para tal predição tem base nos enterramentos atômicos, entendidos como a distância do átomo até o centro geométrico da proteína normalizada pelo raio de giro da proteína. Esses enterramentos podem ser discretizados em camadas concêntricas e equiprováveis e já foi mostrado que a informação sobre estas camadas é su_ciente para levar a proteína ao seu estado nativo (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo e Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), mas não se sabe como esta informação está codi_cada na sequência. O objetivo do presente trabalho é medir a transinformação, quantidade de informação compartilhada por duas ou mais variáveis aleatórias discretas, entre sequência e enterramentos atômicos a partir de quatro diferentes alfabetos de sequência e de diversos números de níveis de enterramento atômico visando entender as relações entre essas variáveis e, assim, fornecer um máximo teórico para a e_ciência dos algoritmos de predi- ção de enterramentos atômicos. Os resultados deste trabalho mostram que a sequência de aminoácidos possui densidade de entropia entre 0; 9969 _ 0; 0002 bit e 4; 176 _ 0; 004 bit, dependendo do número de símbolos do alfabeto considerado (dois, três, cinco ou vinte símbolos), e excesso de entropia sempre próximo a zero. Portanto, infere-se que não existe correlação local entre os elementos da sequência. Por outro lado, os enterramentos atômicos apresentam densidade de entropia variando de 0; 617_0; 002 bit a 2; 16_0; 04 bit para C_ e de 0; 735_0; 002 bit a 2; 54_0; 01 bit para C_, de acordo com a quantidade de níveis de enterramento considerados (de dois a dez níveis), e excesso de entropia compreendido entre 0; 53 _ 0; 01 bit e 1; 4 _ 0; 1 bit para C_ e entre 0; 48 _ 0; 02 bit e 0; 93 _ 0; 04 bit para C_. Estes resultados evidenciam que os enterramentos atômicos são correlacionados localmente entre si. Foi encontrada uma relação entre enterramento atômico e estrutura secundária, na qual as _-hélices são distribuídas por todo o espaço ocupado pela proteína, as folhas-_ tendem aos níveis mais internos e segmentos sem estrutura secundária regular tendem a ocupar os níveis mais externos. A densidade de entropia da sequência é maior que a dos enterramentos atômicos se considerados alfabetos de mesmo tamanho, ou seja, aquela é potencialmente capaz de armazenar a informação necessária para a determinação deste. Entretanto, a transinformação entre sequência e enterramento (calculada para C_ e para C_) não é maior que 20% da dúvida do mesmo. Essa porcentagem é aparentemente pequena, mas é possível que mesmo esta quantidade de informação seja su_ciente para a predição dos enterramentos nativos, uma vez que a dúvida em relação ao enterramento de um átomo deve diminuir quando o de seu vizinho é conhecido, o que também foi mostrado neste trabalho. A combinação dos resultados deste provê um máximo teórico para os algoritmos de predição e permite saber se eles estão próximos deste máximo. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Protein folding understanding and protein terciary structure prediction are two main areas in science nowadays. One approach to terciary structure prediction has its basis in atomic burials, understood as the distance from a speci_c atom to the molecular geometrical center divided by protein's radius of giration. Atomic burials can be discretized in concentric and equiprobable burial layers, and it has been shown that information about these layers cary an amount of information enough to lead protein to its native structure (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo and Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), althougth it is not elucidated how this information is held to the sequence. The intend of this work is to measure mutual information, de_ned as the amount of information shared between two or more discrete random variables, between sequence and atomic burials considering di_erent combinations of sequence alphabets and number of burial layers, with the aim of understanding the relations between them and, therefore, contribute protein terciary structure prediction algorithms. The obtained results show that aminoacids sequence has entropy density ranging from 0; 9969_0; 0002 bit to 4; 176_0; 004 bit, according to the number of symbols of the considered alphabet (two, three, _ve or twenty symbols), and excess entropy approximately equal to zero. Taken together, these results demonstrate that sequence elements are not locally correlated. On the other hand, C_ and C_ atomic burials have shown entropy density from 0; 617_0; 002 bit up to 2; 16_0; 04 bit, and from 0; 735_0; 002 bit up to 2; 54_0; 01 bit, respectively, according to the number of burial levels considered (from two to ten levels). Its excess entropy vary from 0; 53_0; 01 bit to 1; 4_0; 1 bit and from 0; 48_0; 02 bit to 0; 93_0; 04 bit, taking C_ and C_ respectively. These results point that atomic burials elements have local correlation. In addition, a relation between atomic burials and secondary structure was evidenced, taken that Loops tend to external levels, _-sheets tend to internal levels and _-helices are homogeneously distributed through the protein radius. Sequence entropy density is major than atomic burials entropy density, i.e. sequence is theoretically capable of holding the amount of information necessary to determine atomic burials. However, mutual information between sequence and burials (calculated considering C_ and C_) is not greater than 20% of burial uncertainty. This percentage is apparently small, but is it possible that even this few information is enough to a correct prediction of atomic burials once that the entropy with respect to one atom shall decrease once its neigbour's position is known, which has also been shown here. The results obtained here provide a theoretical maximum that can be achieved by prediction algorithms, and therefore permit measure their e_ciency.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-11T20:25:23Z No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Almost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-20T14:42:51Z No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / O pH ambiental é um sinal importante para fisiologia de fungos, intervindo na regulação da transcrição de vários genes. Em fungos filamentosos e leveduras, PacC é um importante fator transcricional que regula a expressão de genes tanto em pH ácido como alcalino. A produção de enzimas envolvidas na bioconversão de biomassa vegetal é regulada principalmente no nível da transcrição. No entanto, o envolvimento da via de regulação por pH na expressão de enzimas lignocelulolíticos não tem sido extensivamente estudado. Nosso grupo havia demonstrado anteriormente que o deuteromiceto termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um potente produtor de celulases, apresentando um considerável potencial biotecnológico para bioconversão de resíduos agrícolas. Nossos resultados sustentam a existência de uma via de regulação por pH para as glicosil hidrolases em H. grisea. Neste trabalho, foram realizadas análises quantitativas por RT-PCR em tempo real para vários transcritos de H. grisea. O perfil transcricional de oito genes codificadores de enzimas lignocelulolíticas (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 e xyn1) e de dois fatores de transcrição (pacC e creA) foi avaliado na presença de glicose ou de bagaço de cana-de-açúcar em condições de pH ácido e alcalino. A análise por qRT-PCR revelou uma indução forte e precoce de quase todos os genes de enzimas lignocelulolíticas, de uma maneira sinérgica quando o fungo foi cultivado com a fonte de carbono complexa e em condições alcalinas (pH 8,0). A única exceção foi egl4, que foi induzido por pH ácido. Um padrão oposto para a expressão dos dois fatores transcricionais foi observado. Enquanto pacC foi induzido em condições alcalinas e fortemente reprimido na presença de glicose, creA foi induzido por glicose e reprimido em condições alcalinas. Os dados de perfil de transcrição, combinados com a análise da ligação in vitro de PacC e CreA aos promotores dos genes analisados, apóiam a repressão por carbono, mediada por CreA, e a via de regulação por pH, mediada por PacC em H. grisea. Além disso, ensaios de mobilidade eletroforética (EMSAs) com o promotor de pacC mostraram que, in vitro, PacC e CreA competem pelo mesmo sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes dados corroboram as hipóteses de que PacC possa ser o mediador da regulação influenciada pelo pH e de que a repressão por glicose, possivelmente atribuída a CreA, é capaz de sobrepujar a ação indutória do pH alcalino. Temos ainda evidências de que CreA também esteja envolvido na repressão de PacC, estabelecendo uma interação entre os dois sistemas regulatórios. O foco do segundo capítulo desse trabalho foi a produção e caracterização de Xyr1 (regulador de xilanases 1), que é o principal fator transcricional que atua na regulação da expressão dos genes codificadores de xilanases em Trichoderma reesei. Os resultados apresentados mostraram a bem sucedida produção heteróloga da versão completa da proteína Xyr1, algo até então inédito entre reguladores de xilanases em fungos filamentosos. Nossas análises empregando técnicas de interação DNA-proteína e géis nativos indicaram que Xyr1 pode naturalmente formar homodímeros em solução. Contudo, a dimerização não é fundamental para a interação com o DNA, o que implica em uma dinâmica complexa de ligação ao promotor do gene xyn1. São possíveis as formas de monômero, dímero e interação com ambos os motivos do sítio palindrômico. A capacidade de dimerização do fator fortalece a proposição de modulação adicional da atividade de Xyr1 por meio de possíveis interações proteína-proteína com outros fatores transcricionais, sendo candidatas as proteínas Ace1 e Ace2. O papel de modificações pós-traducionais tem sido apontado como crucial na regulação mediada por Xyr1. Mostramos que a fosforilação possivelmente está envolvida na regulação da atividade de Xyr1, sendo necessária para a interação DNA-proteína in vitro, mas sem afetar a formação de dímeros. Apresentamos ainda indícios de modulação alostérica de Xyr1 que depende tanto da interação com o DNA quanto, possivelmente, com carboidratos, o que torna mais complexo este modelo de regulação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is an important signal in fungal physiology, acting at transcriptional regulation of several genes. In filamentous fungi and yeasts, the PacC zinc-finger transcription factor regulates gene expression in response to changes of external pH. The production of enzymes involved in plant cell wall breakdown is regulated mainly at the transcriptional level. Nonetheless, the involvement of the pH-related regulatory pathway in the lignocellulolytic enzymes expression has not been extensively studied. We have demonstrated that the thermophilic deuteromycete Humicola grisea var. thermoidea is a potent cellulases producer, presenting a considerable potential for agricultural wastes bioconversion processes. Previous results of our group support the existence of a pH regulatory pathway in H. grisea var. thermoidea. In this work, we have performed a time course transcription analysis of several H. grisea genes by quantitative real time RT-PCR. Eight enzyme genes (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 and xyn1), and two transcription factors genes (pacC and creA) were analyzed in the presence of simple (glucose) or complex (sugarcane bagasse) carbon source, in acid and alkaline medium conditions. The qRT-PCR analyses revealed an early and strong induction of almost all glycoside hydrolase genes transcription, in a synergistic way, when the mycelia were grown in the presence of the complex carbon source, under alkaline conditions (pH 8.0). The only exception was egl4, which was acid-induced. An opposite pattern was observed for the expression of the two transcription factors. While pacC was induced in alkaline conditions and strongly repressed in presence of glucose, creA was induced by glucose and repressed in alkaline conditions. The transcriptional profile data combined with the analysis of the in vitro binding of PacC and CreA transcription factors to the promoters support the CreA-mediated carbon repression and the PacC-related pH regulation of H. grisea cellulase and xylanase encoding genes. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) employing the upstream regulatory sequences of pacC showed that an in vitro interaction occurs between the proteins PacC and CreA on the pacC upstream regulatory sequence, with both factors competing for the same binding site. Taken together, this data corroborate our previous evidences, supporting the existence of a pH transcriptional regulatory pathway in H. grisea, mediated by PacC. Moreover, PacC is probably transcriptionally auto-regulated and may be subject to the carbon repression mechanism mediated by CreA. The second chapter of this work describes the production and characterization of Xyr1 (xylanase regulator 1), which is the main transcription factor that acts regulating the expression of xylanase encoding genes in Trichoderma reesei. The results showed the successful heterologous production of the full version of Xyr1, something never previously described for xylanases regulators in filamentous fungi. Our analyses employing techniques of DNA-protein xviii interactions and native gels indicated that Xyr1 can form homodimers in solution. Nevertheless, dimerization is not essential for the interaction with DNA, suggesting a complex binding dynamics to the xyn1 promoter region (as monomer, dimer and interacting with both palindromic binding sites). The dimerization capacity of Xyr1f strengthens the proposition of an additional modulation for this factor activity, probably by protein-protein interactions with other transcription factors, such as Ace1 and Ace2. A crucial role for post-translational modifications was proposed for gene regulation mediated by Xyr1. We initially showed that phosphorylation has a possible role in the regulation of Xyr1 activity, being necessary for the DNA-protein interactions in vitro, but not affecting the dimer formation. Additionally, we present evidence suggesting an allosteric modulation of Xyr1, dependent on interactions, both with DNA and carbohydrates, which adds an additional degree of complexity to this regulatory model.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-02-28T13:32:44Z No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / A imunidade inata é o primeiro sistema ativado contra a invasão de microorganismos e partícula ao organismo. Esse sistema compreende a resposta humoral e celular. Os neutrófilos, partícipes da resposta imune celular, são encontrados na circulação sanguínea e se movimentam para o tecido quando são estimulados ou ativados por quimioatraentres. A ativação e/ou estimulação provocam mudanças celulares em prol da movimentação, fagocitose e destruição dos microorganismo. Essa ativação pode ser exacerbada provocando até injúrias teciduais. O processo de ativação pode ser subdividido em três estados fenotípicos distintos: quiescentes, estimulados ou ativados e esses estados podem ser desencadeados por substâncias como PAF e fMLP respectivamente. No presente estudo, tais condições foram comparadas. Ensaios que comprovaram a estimulação e ativação dos neutrófilos por esses agentes foram utilizados, como: explosão respiratória, clivagem da L-selectina e a mobilização da CD11b. Após essa avaliação foram comparados géis bidimensionais entre os três fenótipos (quiescentes, estimulados e ativados), o que resultou em 166 spots apresentando abundância diferencial e dentre eles 87 identificações proteicas. A análise dos termos do gene ontology para essas proteínas detectou que a maioria delas encontra-se no citoplasma e núcleo, e o processo biológico com maior número de proteínas envolvidas foi a transcrição em neutrófilos estimulados e dobramento de proteínas em neutrófilos ativados. Na comparação entre os três fenótipos, 16 spots apresentaram abundância diferencial e 11 proteínas foram identificadas, dentre elas 6 proteínas mais abundantes em neutrófilos quiescentes, envolvidas em processos como transdução de sinal, motilidade celular e modulação da resposta inflamatória. Seis outras proteínas eram mais abundantes em neutrófilos estimulados pelo PAF, relacionadas a adesão celular, transdução de sinal e atividade antimicrobiana. Dentre as proteínas identificadas neste estudo, 17 foram descritas pela primeira vez em neutrófilos e 30 foram associadas pela primeira vez ao estímulo por PAF ou à ativação por fMLP. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Innate immunity is the first system activated against the invasion of microorganisms and particles in the body. This system includes the humoral and cellular responses. Neutrophils, a participant in the cellular immune response, are found in the bloodstream and move to the tissue when they are stimulated or activated by chemoattractants, known as effector cells of the inflammatory response. The activation and/or stimulation causes changes in this cell favouring movement, phagocytosis and destruction of microorganisms. This activation may be exacerbated by causing tissue injury. The activation process can be subdivided into three distinct phenotypic states: quiescent, stimulated or activated and these states can be triggered by substances as PAF and fMLP respectively. In the present study such conditions were compared. Tests demonstrating stimulation and activation of neutrophils by these agents were used as respiratory burst, cleavage of L-selectin and CD11b mobilization. After this evaluation, were compared two-dimensional gels among the three phenotypes (quiescent, stimulated and activated), which resulted in 166 proteins presenting differential abundance and among them 87 were identified. Analysis of the gene ontology terms for such proteins localized most of them in the cytoplasm and nucleus, and associated them to the biological processes of transcription in stimulated neutrophils and protein folding in activated neutrophils. Comparing among the three phenotypes, 16 proteins showed differential abundance and 11 were identified, among them 6 were more abundant in quiescent neutrophils, involved in processes like signal transduction, cell motility and modulation of the inflammatory response. Six other proteins were more abundant in neutrophils stimulated by PAF, related to cellular adhesion, signal transduction and antimicrobial activity. Among the identified proteins, 17 were described for the first time in neutrophils and 30 were associated for the first time to the stimulation by PAF or activation by fMLP.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-03-05T12:24:08Z No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-03-05T15:35:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / O câncer é descrito como uma doença que é desencadeada por fatores genéticos e epigenéticos. Dentre as manifestações epigenéticas ligadas à carcinogênese a desregulação nas modificações pós-traducionais que ocorrem nas caudas das histonas tem um papel de grande importância. Vários são os tipos de modificações que podem ocorrer e vários são os sítios a serem modificados, entre eles a metilação em resíduos de lisina. As metiltransferases de lisina são um grupo de enzimas que contem um domínio SET, o qual catalisa a adição de grupos metila em resíduos de lisina. Inicialmente, as metiltransferases de lisina foram identificadas como específicas para substratos de histonas, mas estudos posteriores mostraram que estas enzimas também metilam outras proteínas que não-histonas. A família SMYD de metiltransferases consiste no agrupamento de cinco proteínas que apresentam em sua estrutura ambos os domínios SET e MYND. Ainda que os membros desta família (SMYD1 a SMYD5) ainda não tenham sido completamente caracterizados, já foi descrito que expressões aberrantes de algumas destas proteínas estão ligadas à progressão tumoral de diversos tecidos como colorretal, fígado e mama. O SMYD5 foi recentemente descrito como fator importante na atividade inflamatória de macrófagos, mas seu papel na tumorigênese não foi investigado. Seguindo o perfil de outros membros da família SMYD, no presente trabalho investigamos uma possível relação do SMYD5 como o câncer de mama. Foi constatado que o SMYD5 está downregulado em todas as linhagens de células de câncer de mama estudadas. Ainda, obervamos que ele se encontra frequentemente hipoexpresso em amostras de câncer de mama. Entretanto, experimentos de knockdown ou superexpressão do SMYD5 não mostraram efeito significativo na proliferação celular in vitro. Revelamos que o SMYD5 está localizado em ambos núcleo e citoplasma e apresenta-se progressivamente menos presente em tecidos tumorais, quando comparado com tecido normal de mama. Os resultados sugerem uma forte ligação entre a baixa expressão do SMYD5 e o estado maligno da mama e o apontam como um potencial supressor tumoral no contexto mamário. Estudos posteriores ajudarão na compreensão dos mecanismos envolvidos na relação do SMYD5 com o câncer de mama. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is described as a disease triggered by genetic and epigenetic factors. Within epigenetic manifestations linked to carcinogenesis there are the post translational modifications that occur at histone tails. Several modification types may occur and several sites can be modified, amongst them there is the methylation at lysine residues. Lysine methyltransferases are a group of enzymes containing a SET domain, responsible for catalysing the addition of methyl groups at lysine residues. Early on, lysine methyltranferases were thought to be histone substrate specific, but further studies have shown these enzymes to be capable of methylating other non- histone proteins. The SMYD family of methyltransferases consists in five proteins that present both the SET and MYND domains within their structure. Even if members of this family (SMYD 1-5) are yet to be completely characterized, it has been described that aberrant expressions of some of these family members are linked to tumor progression in various tissues, such as colorectal, liver and breast. SMYD 5 has recently been described as an important factor in inflammatory activity mediated by macrophages, but its part in tumorigenesis had not been investigated thus far. Following the profile for other members of the SMYD family, in the present study a possible relation between SMYD5 and breast cancer has been sought. It was found that SMYD5 is downregulated in all breast cancer cell lines studied. In adition, it is also frequently hipoexpressed in clinical breast cancer samples. However, its knockdown or super expression has had no effect on in vitro cellular proliferation. We showed that SMYD5 is located in both the nucleus and cytoplasm and it is also progressive less present in carcinogenic tissues, if compared to regular breast tissue. The results suggest a strong link between SMYD5 low expression states and malignant breast and points it towards to a potential tumor suppressor role in breast context. Further studies will help in understanding the mechanisms involved in the relationship between SMYD5 and breast cancer.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, 2012. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Metodologia, Resultados e Discussão. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-29T11:33:19Z No. of bitstreams: 1 2012_LiviaPimenteldeSantAnaDourado_Parcial.pdf: 1181395 bytes, checksum: 33e9cc488aaa873a718b874f3559a2e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T12:19:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LiviaPimenteldeSantAnaDourado_Parcial.pdf: 1181395 bytes, checksum: 33e9cc488aaa873a718b874f3559a2e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T12:19:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LiviaPimenteldeSantAnaDourado_Parcial.pdf: 1181395 bytes, checksum: 33e9cc488aaa873a718b874f3559a2e9 (MD5) / Introdução e objetivo: O consumo de frutas e hortaliças tem sido inversamente associado à incidência de doença crônicas e ao processo de envelhecimento. Esse potencial protetor parece estar associado à presença, nesses alimentos, de compostos bioativos que exercem atividade antioxidante, reduzindo a geração de espécies reativas, causadores de danos oxidativos celulares. Na literatura, os poucos relatos acerca do potencial antioxidante de frutos do Cerrado apontam esses como uma boa fonte de agentes antioxidantes. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro o potencial antioxidante de doze frutos do cerrado e testar a hipótese que o tucum, fruto que apresentou alto teor de fenólicos totais e potencial antioxidante, quando consumido in natura é capaz de proteger os tecidos contra danos oxidativos gerados pelo excesso de ferro. Metodologia: Estudo in vitro. O conteúdo de fenólicos totais dos extratos aquoso e acetato etílico de 9 frutos (araticum - Annona crassiflora Mart.; cagaita - Eugenia dysenterica DC.;; ingá - Inga laurina Willd.; jatobá-do-cerrado - Hymenaea stigonocarpa Mart.; jenipapo - Genipa americana L.; jurubeba - Solanum paniculatum L.; lobeira - Solanum grandiflorum Ruiz & Pav.; mangaba - Hancornia speciosa Gomes; e tucum do cerrado - Bactris setosa Mart); 1 pseudofruto (cajuzinho-do-cerrado - Anacardium humile) e 1 caule (guariroba - Syagrus oleracea Mart. Becc.) típicos do cerrado foi determinado pelo método de Folin Ciocateau. Estudo in vivo. Vinte e quatro ratos Wistar machos foram tratados durante 30 dias com uma das seguintes dietas: (Controle) AIN-93G; (Fe) AIN-93G + 350 mg / kg de ferro; (Tu) AIN- 93G + 15% de tucum; (FeTu) AIN-93G + 350 mg / kg de ferro + 15% de tucum. O fígado, baço, coração, intestino, rim e cerébro foram retirados para determinação dos níveis de malondialdeído (MDA); proteínas carboniladas e concentração de ferro. A atividade específica das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPX), glutationa-s-transferase (GST) e da enzima oxidante NADPH oxidase foi também determinada nesses órgão. O potencial antioxidante total do soro foi determinado pelo método do potencial de redução do Fe (Ferric Reducing Ability of Plasma – FRAP). A análise estatística dos dados foi feita pelo teste T amostras independentes utilizando o programa SPSS, com nível de significância considerado de p ≤ 0,05. Resultados: Todos os extratos aquosos, a exceção daquele obtido da lobeira, apresentaram maior concentração de fenólicos totais, quando comparados aos extratos de acetato etílico. Os extratos de acetato etílico da lobeira, jenipapo, araticum e tucum apresentaram maior valor de fenólicos totais (1.166 ± 98; 651 ± 61; 580 ± 143; 540 ± 92 mg TAE / 100 g fruto seco), quando comparados ao extrato de maçã (151 ± 26 mg TAE / 100 g fruto seco). No caso dos extratos aquosos o tucum, ingá, jurubeba, cagaita, araticum, jenipapo, mangaba e cajuzinho (3.343 ± 664; 1.506 ± 55; 1.352 ± 226; 1.203 ± 53; 1.095 ± 159; 1.015 ± 62; 842 ± 60 e 455 ± 55 mg TAE / 100 g seco) apresentaram valores de fenólicos totais maiores que os valores da maçã (273 ± 15 mg TAE / 100 g seco). Em relação ao estudo in vivo, a suplementação de ferro diminuiu o consumo de dieta (p = 0,038), aumentou a concentração de ferro e MDA no fígado (p = 0,000 e 0,002, respectivamente) dos ratos Fe, quando comparados ao grupo Controle. No intestino, o grupo Fe apresentou maior concentração de ferro e o grupo Tu menor, quando comparados ao Controle (p = 0,011 e 0,019, respectivamente). Enquanto no grupo FeTu, o teor foi marginalmente maior que o grupo Fe e igual ao Controle (p = 0,095 e 0,170, respectivamente). Não foram observadas diferenças na concentração de proteína carbonilada nos diversos tecidos entre os grupos estudados. O consumo de tucum reduziu os níveis de MDA no fígado dos animais suplementados com ferro (grupo FeTu) em relação ao grupo Fe (p = 0,013), e aumentou o poder redutor do soro, tanto na presença quanto na ausência da suplementação de ferro, grupos Tu e FeTu, em relação ao grupo Controle (p = 0,006 e 0,011, respectivamente). A enzima GPX apresentou maior atividade no intestino, enquanto a GST no rim dos ratos suplementados com ferro em relação ao Controle (p = 0,046 e 0,043, respectivamente). A catalase, GR e GST tiveram a atividade diminuída no grupo FeTu, quando comparadas ao grupo Fe (p = 0,033; 0,014 e 0,018) no rim. Conclusão: O alto teor de fenólicos totais do extrato aquoso de tucum, associado ao maior potencial redutor do soro dos animais tratados com esse fruto, demonstra que o tucum possui potencial antioxidante. Apesar do fino mecanismo de regulação dos níveis endógenos de ferro do organismo, sua suplementação dietética pode resultar em sobrecarga no tecido de armazenamento e consequente aumento de danos oxidativos a lipídeos. O consumo de tucum in natura associado à dieta parece proteger o organismo de ratos contra danos oxidativos catalisados por ferro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background and aim: The consumption of fruits and vegetables has been inversely associated with the incidence of chronic disease and the aging process. This protective potential appears to be associated with the presence of bioactive compounds in these foods that exert antioxidant activity, reducing the generation of reactive species, which cause cellular oxidative damage. In the literature, few reports about the antioxidant potential of the Cerrado fruits point as a good source of antioxidants agents. The aim of this study was to evaluate the antioxidant potential of twelve fruits of cerrado in vitro and test the hypothesis that tucum, fruit that had high total phenolic content and antioxidant potential in vitro, when consumed in natura can protect tissues against oxidative damage generated by excess of iron. Methods: Study in vitro. The total phenolic content of aqueous and ethyl acetate extracts of 9 fruits (araticum - Annona crassiflora Mart.; cagaita - Eugenia dysenterica DC.; ingá - Inga laurina Willd.; jatobá-do-cerrado - Hymenaea stigonocarpa Mart.; jenipapo - Genipa americana L.; jurubeba - Solanum paniculatum L.; lobeira - Solanum grandiflorum Ruiz & Pav.; mangaba - Hancornia speciosa Gomes; and tucum do cerrado - Bactris setosa Mart); 1 pseudofruit (cajuzinho-do-cerrado - Anacardium humile) and 1 palm (guariroba - Syagrus oleracea Mart. Becc.) typical of cerrado was determined by Folin Ciocateau method. Study in vivo. Twenty-four male Wistar rats were treated for 30 days with one of the following diets: (Control) AIN-93G; (Fe) AIN-93G + 350 mg / kg of iron; (Tu) AIN-93G + 15% tucum; (FeTu) AIN-93G + 350 mg / kg iron + 15% tucum. The liver, spleen, heart, intestine, kidney and brain were removed to determine the levels of malondialdehyde (MDA), carbonyl protein and iron concentration. The specific activity of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPX), glutathione-s-transferase (GST) and the oxidant enzyme NADPH oxidase was also determined in these tissues. Total Serum Antioxidant Potential was determined by the method of ferric reducing antioxidant power (Ferric Reducing Ability of Plasma - FRAP). The statistical analysis was performed by independent samples T-test using SPSS (version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Results: All aqueous extracts, except that obtained from lobeira, had higher concentration of total phenolics compared to the ethyl acetate extracts. The total phenolic content of ethyl acetate extracts of lobeira, jenipapo, araticum and tucum was higher (1,166 ± 98, 651 ± 61, 580 ± 143, 540 ± 92 mg TAE / 100 g dry fruit) than that obtained for apple extract (151 ± TAE 26 mg / 100 g dry fruit). In the case of aqueous extracts, the tucum, ingá, jurubeba, cagaita, araticum, jenipapo, mangaba and cajuzinho (3,343 ± 664; 1506 ± 55, 1352 ± 226, 1203 ± 53, 1095 ± 159; 1015 ± 62, 842 ± 60 and TAE 455 ± 55 mg / 100 g dry fruit) showed values higher than the total phenolic of apple extract (273 ± 15 mg TAE / 100 g dry fruit). Regarding the in vivo study, the iron supplementation decreased the consumption of diet (p = 0.038), increased the concentration of iron and MDA in the liver (p = 0.000 and 0.002, respectively) of the rats of Fe group compared to Control group. In the intestine, the Fe group showed higher iron concentration and the Tu group lower compared to control (p = 0.011 and 0.019, respectively), while in FeTu group the content was marginally higher than the Fe group and equal to the Control (p = 0.095 and 0.170 respectively). There were no differences in the concentration of carbonyl protein in the different tissues between the groups of study. The consumption of tucum reduced MDA levels in the liver of animals supplemented with iron (group FeTu) compared to Fe group (p = 0.013), and increased the reducing power of serum in the presence and absence of iron supplementation, Tu and FeTu groups, compared to the Control group (p = 0.006 and 0.011, respectively). The enzyme GPX showed higher activity in the intestine, while the GST in the kidney of rats supplemented with iron compared to Control (p = 0.046 and 0.043, respectively). The specific activity of CAT, GR and GST decreased in the FeTu group compared to the Fe group (p = 0.033, 0.014 and 0.018) in the kidney. Conclusion: The high content of total phenolic in aqueous extract of tucum, associated with the greatest reducing potential of serum of the animals treated with this fruit, demonstrates that tucum has antioxidant potential. Despite the fine mechanism of endogenous iron levels regulation, their dietary supplementation can result in overload in the storage tissues and a consequent increase in oxidative damage to lipids. The consumption of tucum in natura associated to the diet seems to protect the organisms of rats against oxidative damage catalyzed by iron.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-14T12:47:05Z No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) Previous issue date: 2006 / Proteínas zinc finger são compostas por domínios compactados contendo α- hélices e folhas β unidos e estabilizados por um ou dois átomos de zinco. Arranjos repetidos de zinc fingers são comumente utilizados para reconhecimento de ácidos nucléicos. Dentre outras atividades, eles estão envolvidos em replicação, transcrição e reparo de DNA. No nucleocapsídeo do vírus HIV tipo 1 foi identificada uma proteína contendo o motivo zinc finger CX2CX4HX4C, estando esta proteína envolvida em várias etapas do ciclo de vida viral, incluindo a propriedade de encapsidação do RNA viral. Em tripanosomatídeos, somente poucas proteínas contendo o motivo zinc finger já foram identificadas até o presente momento. Em um fragmento genômico de 17 kb da banda XX de T. cruzi, nós identificamos três genes in tandem codificando para proteínas zinc finger do tipo CX2CX2HX4C. Nós também demonstramos que genes similares estão presentes em T. brucei e L. major como três definidos grupos monofiléticos entre esses tripanosomatídeos. Em T. cruzi, TcZFP8 corresponde a um novo gene codificando para uma proteína com oito motivos zinc finger. O homólogo de TcZFP8 em T. brucei é aparentemente ausente, enquanto um candidato foi identificado em L. major. A clonagem molecular e a expressão heteróloga de TcZFP8 foi realizada para produção de anticorpos e procedimentos como imunocitolocalização, SELEX e EMSA. Análise por Western blotting revelou a presença dessa proteína nas três formas do parasita. Análises usando extratos protéicos nucleares e citoplasmáticos de T.cruzi mostraram que essa proteína está presente na porção nuclear. Esse resultado foi confirmado através de análise de microscopia por imunofluorescência indireta. Experimento de SELEX demonstrou quatro diferentes populações com uma região interna rica em C e/ou G, porém sem seqüências consenso específicas. Análises preliminares de EMSA de uma das quatro populações selecionadas revelaram evidências de que TcZPP8 possa ter afinidade de ligação à fita simples de DNA. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Zinc fingers are compact protein domains composed of a α-helix and a β-sheet held together by a zinc ion. Tandem arrays of zinc fingers are commonly used to recognize nucleic acids. Among other activities, they are involved in the processes of replication, transcription, and DNA repair. The nucleocapsid protein of HIV-1 contains a zinc finger motif CX2CX4HX4C that contributes to multiple steps of the viral life cycle, including the proper encapsidation of HIV RNA. In trypanosomatids, only a few of the proteins that contain such fingers were identified. In a 17-kb genomic fragment of Trypanosoma cruzi chromosome XX we identified three tandemly linked genes coding for CX2CX4HX4C zinc finger proteins. We also showed that similar genes are present in Trypanosoma brucei and Leishmania major sharing three monophyletic groups among these trypanosomatids. In T. cruzi, TcZFP8 corresponds to a novel gene coding for a protein containing eight zinc finger motifs. Homologous of TcZFP8 in T. brucei is apparently absent, while one candidate in L. major was identified. Molecular cloning of gene TcZFP8 and heterologous expression were performed in Escherichia coli. The purified recombinant protein His6x-TcZFP8 was used to produce antibody in rabbits and GST-TcZFP8 in SELEX and EMSA procedures. Using Western blot analysis, we observed the presence of this protein in all three forms of the parasite: amastigote, trypomastigote and epimastigote. Analysis using cytoplasm and nuclear cell extracts showed that this protein is present in the nuclear extracts and indirect immunofluorescence microscopy analysis confirmed the nuclear localization of the TcZFP8. SELEX experiment showed four different populations rich in C and/or G nucleotides, but with none consensus sequence. Preliminary EMSA from one population gave evidence that TcZFP8 has affinity to bind to singlestranded DNA.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-25T16:14:58Z No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) Previous issue date: 2006 / As proteínas recombinantes de interesse terapêutico vêm ganhando cada vez mais espaço na indústria farmacêutica e atualmente já movimentam um mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhões de dólares em todo o mundo. As células de mamíferos são as hospedeiras de expressão preferencialmente escolhidas no caso de proteínas que requerem um grau sofisticado de processamento pós-traducional, sendo crescente a iniciativa de identificação de novas linhagens de células, especialmente humanas, como sistemas alternativos de expressão às células utilizadas. Nosso grupo de pesquisa tem interesse na produção de antígenos para seleção de anticorpos com potencial neutralizante, especialmente os antígenos de superfície do envelope viral de HIV-1, agente etiológico da pandemia mundial de AIDS, que atualmente apresenta mais de 40 milhões de infectados. O presente trabalho teve por objetivo a avaliação preliminar das células de ducto de glândula submandibular humana (HSG) como sistema de expressão heteróloga alternativo às células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Comparativamente, foi avaliada a eficiência de transfecção, assim como a de expressão transiente do anticorpo quimérico anti-Z-DNA Z22, na forma recombinante de fragmento FvFc pelas duas linhagens celulares. Outro objetivo foi a produção de versões recombinantes das glicoproteínas virais de HIV-1. Os resultados apontaram as células HSG como um bom sistema alternativo para a produção de proteínas heterólogas secretadas, especialmente quando transfectadas por co-precipitação com fosfato de cálcio, sendo ainda necessários alguns ajustes, uma vez que os choques osmóticos com glicerol e DMSO, considerados pontencializadores da transfecção, mostraram-se tóxicos da forma como foram executados. Foram amplificados e clonados em vetor de expressão para células de mamíferos os segmentos gênicos correspondentes a quatro versões recombinantes das glicoproteínas do envelope viral de HIV-1 (gp160, gp140, gp120 e gp41+PS), subtipo C que, de acordo com as nossas análises, utiliza CCR5 como co-receptor. Até o presente momento, não foi possível a detecção das glicoproteínas recombinantes, expressas de forma transiente em células CHO-K1, sendo necessários ajustes, principalmente na etapa de transfecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recombinant therapeutic proteins have become more and more important in the pharmaceutical industry, and nowadays they are responsible for an injection of about 50 to 60 million dollar a year into the worldwide market. Animal cell cultures are the preferential expression systems for those proteins which require extensive posttranslational modifications. In this view, the identification of alternative expression systems is an issue of increasing concern, specially considering human cell lines. Our research group has been interested in the production of antigens to be used for the selection of neutralizing antibodies, particularly those antigens derived from the envelope surface of HIV-1, the etiologic agent of the pandemic infection of AIDS, which nowadays affects more than 40 million people. This work aimed the preliminary evaluation of the human salivary gland duct cells (HSG) as a heterologous expression system alternative to the Chinese hamster ovary cells (CHO-K1). The transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression of the anti-Z-DNA Z22 chimeric antibody, as a recombinant FvFc fragment. Another objective was the production of recombinant versions of HIV-1 glycoproteins. Our results pointed out to the HSG cells as a good alternative system for the production of secreted heterologous proteins, specially when transfected by co-precipitation with calcium phosphate. Some adjusts are still needed, considering that the glycerol and DMSO osmotic shocks, generally considered as transfection pontentializers, proved to be toxic in the employed protocol. The genic fragments corresponding to four recombinant versions of the HIV-1 envelope glycoproteins (gp160, gp140 gp120 and gp41+PS), subtype C, were amplified and cloned in a mammal cells expression vector. According to our analysis, this virus subtype uses CCR5 as co-receptor. So far, it was not possible to detect the recombinant glycoproteins expressed in a transient form in the CHO-K1 cells. In order to achieve this objective, some adjustments are still necessary, specially concerning the transfection protocol.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-26T16:54:41Z No. of bitstreams: 1 2007_AnaCarolinaMeloAraujo.PDF: 10563299 bytes, checksum: be42b2e87e37f164b701a8c3fda4fa1a (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-26T19:28:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_AnaCarolinaMeloAraujo.PDF: 10563299 bytes, checksum: be42b2e87e37f164b701a8c3fda4fa1a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-26T19:28:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_AnaCarolinaMeloAraujo.PDF: 10563299 bytes, checksum: be42b2e87e37f164b701a8c3fda4fa1a (MD5) Previous issue date: 2007 / Toxinas citolíticas são produzidas por uma grande variedade de organismos, particularmente bactérias, alguns insetos, répteis e alguns vertebrados marinhos. Muitas dessas toxinas formam poros nas membranas das células, aumentando a sua permeabilidade e levando à morte celular. Entretanto, poucos exemplos têm sido estudados em plantas. Enterolobina foi a primeira proteína citolítica vegetal descrita na literatura. É uma proteína formadora de poros em membranas extraída de sementes de Enterolobium contortisiliquum. Este trabalho tem como objetivo verificar se calos de E.contortisiliquum são uma possível fonte para purificação da enterolobina, e comparar a expressão de proteínas em calos e sementes de E. contortisiliquum. Para produção de calos, sementes foram aleatoriamente selecionadas e escarificadas com lixa d’água em uma das faces e embebidas em água destilada overnight. Procedeu-se à desinfecção das sementes utilizando solução de hipoclorito de sódio a 30% e água destilada estéril. Inoculou-se uma semente para cada tubo de ensaio, contendo 20 mL de meio MS-61. Aguardou-se a germinação e desenvolvimento das plantas para seguir com os experimentos (aproximadamente 20 dias). Após esse período, foram realizados experimentos utilizando-se explantes de cotilédones, parte final dos cotilédones, hipocótilo e epicótilo, submetidos a 6 tipos de tratamentos em meio básico MS-61. Todas as culturas foram mantidas na luz (fotoperíodo: 16 horas luz/8horas escuro) a 27 ± ºC. Nos tratamentos com 2,4-diclorofenoxiacético (1mg/mL) e com ácido 2,4- diclorofenoxiacético (1mg/mL) e ácido abscísico (0.2 mg/mL) observou-se a formação de duas linhagens (verde e amarela, respectivamente) as quais foram utilizadas na preparação dos extratos de proteínas. Calos e sementes foram macerados em N2 líquido e pó de vidro e precipitadas com solução de TCA/acetona seguida pela extração e solubilização em tampão 2-DE. A concentração de proteína foi determinada utilizando-se Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). As amostras foram submetidas à focalização isoelétrica utilizando-se géis de gradiente imobilizados de pH (IPG) na faixa de 3-10. Para confirmar a presença de enterolobina, foi realizado immnublotting utilizando anticorpos de enterolobina produzidos em coelho. A análise comparativa dos mapas de 2-DE mostrou expressões diferenciadas entre sementes e calos. SDS-PAGE seguido de immnunoblotting não indicou a presença de enterolobina nos extratos de calos. Em sementes, cinco isoformas de enterolobina foram encontradas com pI aproximado na faixa entre 5 e 6. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cytolytic toxins are produced by a variety of living organisms, particularly bacteria, certain insects, poisonous reptiles and stinging marine invertebrates. Many of these toxins appear to function simply by forming pores in cell membranes, disrupting the permeability barrier and leading eventually to cell death. However, few examples have been studied in plants. Enterolobin was the first plant cytolytic protein described in the literature. It is a membrane pore-forming protein extracted from Enterolobium contortisiliquum seeds. The current work aimed at assaying E. contortisiliquum callus as possible source material for enterolobin purification, and comparing protein expression in callus and seeds of E. contortisiliquum. For callus production, seeds were randomly selected and scarified, and then overnight incubated in distilled water. A solution of 30 % sodium hipochloride was used for seed decontamination. Each seed was placed into a tube containing 20 mL of MS-61 medium. Seed germination and development was allowed for twenty days. After this period, explants of cotyledons and hypocotyles were subjected to six different treatments containing MS-61 basic medium. The cultures were incubated at 27ºC (16h light / 8h dark). Media with 2-4-diclorofenoxiacetic acid (1mg/mL) and with 2-4-diclorofenoxiacetic acid (1mg/mL) plus abscisic acid (0.2 mg/mL) provided two callus lines (yellow and green, respectively) which were used for preparation of protein extracts. Callus and seeds were ground in liquid N and glass 2 powder, and the proteins precipitated with TCA/acetone solution followed by extraction and solubilization in 2-DE buffer. Protein concentrations were measured by using Plus One 2D QuantKit. The samples were submitted to 2-DE using immobilized pH gradient gels in the 3-10 pH range during isoelectric focusing. To confirm the presence of the cytolisin in callus and seeds 2-DE gels, immunoblotting was made using enterolobin antibodies raised in rabbit. Comparative analysis of 2-DE maps showed different expression between seeds and callus. SDS-PAGE followed by immunoblotting did not indicate the presence of enterolobin in callus extracts. In seeds, enterolobin five isoforms were found within the 5 to 6 pI zone.