Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: Osvaldo de Freitas / Banca: Clovis Ryuichi Nakaie / Resumo: A maioria das bactérias possui dois tipos de topoisomerases IIA, DNA girase e topoisomerase IV (topo IV), que juntas ajudam a administrar a integridade e a topologia do DNA. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação do DNA e transcrição. Isso faz da girase e da topo IV alvos importantes para diversas drogas antibacterianas. Estruturalmente, ambas operam como um heterotetrâmero composto por duas proteínas GyrA e duas proteínas GyrB, para a girase, e duas proteínas ParC e duas ParE, na topo IV. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a girase e a topo IV, tais como as quinolonas, cumarinas e algumas toxinas naturais, incluindo o CcdB. A toxina bacteriana CcdB, é uma pequena proteína de 11,7 kDa, contendo 101 resíduos de aminoácidos que, juntamente com o CcdA, faz parte de um sistema de morte celular programada do plasmídeo F, um fator de conjugação muito estudado em Escherichia coli. CcdB atua como uma toxina e o CcdA como a antitoxina. Na ausência de CcdA, CcdB pode matar a bactéria através de um mecanismo, ainda pouco conhecido, que envolve a girase e/ou a topo IV, assim como a região C-terminal da toxina CcdB (Trp-99 a Ile-101). Neste trabalho está descrita a obtenção de uma série de seqüências peptídicas miméticas, racionalmente projetadas, baseadas na estrutura primária do CcdB natural, com o objetivo de melhor entender o mecanismo de inibição da atividade de ambas, DNA girase e topo IV, pelo CcdB, e também propor um novo grupo de moléculas com potencial atividade antibacteriana. / Abstract: Most bacteria posses two type IIA topisomerases, DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV), that together help manage DNA integrity and topology. Gyrase primarily introduces negative supercoils into DNA, and the topo IV, although closely related to gyrase, preferentially decatenates DNA and relaxes positive supercoils, essential functions for bacterial DNA replication and transcription. This makes of the gyrase and topo IV important targets for antibacterial drugs. Structurally both operate as a heterotetramer formed by two GyrA and two GyrB proteins for girase, and two ParC and two ParE proteins for topo IV. A large number of antibacterial agents act in the inhibition of the gyrase and topo IV, such as quinolones, coumarins, and some natural toxins including the protein CcdB. The bacterial toxin CcdB is a 11.7 kDa protein with 101 amino acids that with CcdA form a programmed cell death system of F plasmid, a conjugation factor widely studied in E. coli. CcdB acts like a toxin and CcdA as the antitoxin. In the CcdA absence, CcdB can kill the cell by an unclear mechanism that involves gyrase and/or topo IV, as well as the CcdB C-terminal region (Trp-99 to Ile-101). In this work it is described the obtaining of a several peptides mimics, rationally design, based on the primary structure of natural CcdB toxin, to a better understanding the inhibition mechanism of the activity of the gyrase and topo IV, by CcdB toxin, and also propose a new molecules group with potential antibacterial activity. The peptides mimics were synthesized by Solid Phase methodology (SPPS), purified and analyzed by liquid chromatography (HPLC) and identified by LC/ESI-MS and by amino acid analysis. The inhibition capacity of the peptide mimics was tested by electrophoresis agarose gels and by bacterial growth in liquid medium assays. / Doutor

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000399966-Texto+Completo-0.pdf: 2182806 bytes, checksum: b7ae0dc782e83e28c95813d364f5ef3b (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that acts on cells of the neutrophil lineage causing proliferation and differentiation of committed precursor and activation of mature neutrophils. The hG-CSF is an 18. 8 kDa protein consisting of 174 amino acid polypeptide chain with two intra-molecular disulphide bonds and one free cysteine at residue 17. This biopharmaceutical has been widely used with success in oncology patients who receive high-dose chemotherapy. It is also used as treatment and prophylactically to improve the immune system in patients with HIV, pneumonia, diabetic foot infections, leukemia and febrile neutropenia. Based on this large clinical application, the recombinant hG-CSF has been produced in genetically engineered Escherichia coli and was approved for use in chemotherapyinduced neutropenia by the U. S Food and Drug Administration in 1991. Filgrastim (generic name of G-CSF) lost its patent protection in 2006 becoming a target of Brazilian pharmaceutical industries. Currently, Brazil is totally dependent of the importation of this biopharmaceutical. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Filgrastim. In this work the granulocyte colonystimulating factor gene was assembled by PCR, Its amplicon was cloned into pET23a(+) expression vector using NdeI and BamHI, restriction enzymes. The overexpression was tested in different strains of E. coli cells and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain. In order to solubilize the inclusion bodies and purify the protein, many protocols have been tested. Finally, it was described an efficient protocol of isolation of inclusion bodies through a multi-step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhG-CSF. Characterization of homogeneous rhG-CSF using SEC-HPLC and RP-HPLC has shown similarity to the international standard. The biological activity assay, in vivo, has shown an equivalent biological effect to those obtained with the standard reference rhG-CSF. The protein rhG-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process of rhG-CSF, which has extreme importance to the industrial process and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma citocina hematopoiética que age sobre a linhagem de neutrófilos promovendo proliferação e diferenciação de seus precursores e ativação dos neutrófilos maduros. O G-CSF é uma proteína com 18,8 kDa, constituída por 174 aminoácidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma cisteína livre no resíduo 17. Este biofármaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com câncer que recebem altas doses de quimioterapia. Além disso, também tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de reforçar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diabéticos com infecções nos pés, leucemia e neutropenia febril. Em função desta ampla aplicação clínica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome genérico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das indústrias farmacêuticas. Atualmente, o Brasil é totalmente dependente da importação deste biofármaco. Logo, o objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para a posterior produção de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET23a(+), usando as enzimas de restrição NdeI e BamHI. Os testes de superexpressão foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condição de expressão na fração insolúvel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, inúmeros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubilização dos corpos de inclusão por um processo de múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente uma coluna cromatográfica de troca catiônica. A identidade da proteína foi confirmada por seqüenciamento N-terminal e Western blotting. A caracterização do rhG-CSF homogêneo, através de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padrão internacional. O teste de atividade biológica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi produzida por um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em um processo industrial, podendo trazer benefícios para a saúde da população.

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética que possui uma cápsula polissacarídica robusta e é um dos agentes etiológicos da criptococose. A linhagem R265 de C. gattii foi responsável pelo surto de criptococose na Ilha de Vancouver e há vários estudos indicando sua dispersão e ocupação de novos nichos ecológicos. Fatores de virulência bem caracterizados deste patógeno incluem: a capacidade de sintetizar o pigmento antioxidante melanina, a produção de uma cápsula polissacarídica antifagocíticas e a capacidade de sobreviver e proliferar a 37°C. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi identificar proteínas envolvidas na resposta da linhagem R265 de C. gattii à variação de temperatura experimentada quando o fungo deixa o ambiente para sobreviver no hospedeiro, usando análise in vitro e proteômica comparativa. Nossos dados demonstram que as proteínas com expressão aumentada a 25°C atuam principalmente em processos metabólicos de proteínas, carboidratos, lípidios, ácidos orgânicos e aminoácidos e que as proteínas com expressão aumentada a 37°C, em sua maior parte, participam de processos que incluem fosforilação, metilação, processos catabólicos de corpos cetônicos, GTP e ATP e processos metabólicos de nucleosidios. A diferença mais notável entre as condições testadas é a predominância, no desenvolvimento de C. gattii a 25°C, de proteínas envolvidas em processos de oxirredução e a presença de um número considerável de proteínas envolvidas na resposta ao stress e em processos catabólicos no desenvolvimento a 37°C. Em suma, o presente estudo é a primeira análise proteômica a fornecer informação sobre proteínas reguladas pela variação de temperatura e a primeira descrição da resposta da linhagem hipervirulenta R265 de C. gattii à esta condição. As proteínas identificadas podem ser alvos para novos estudos na identificação de proteínas-chave para o desenvolvimento do fungo a 37°C e para a pesquisa de biomarcadores que podem contribuir para o tratamento e prevenção da criptococose causada por este patógeno. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast which has a robust polysaccharide capsule and is one of the etiological agents of cryptococcosis. The R265 strain of C. gattii was responsible for the Vancouver Island outbreak and there are various studies including their dispersal and occupation of new ecological niches. Well-characterized virulence factors of this pathogen include: the ability to synthesize the antioxidant pigment melanin; the production of an antiphagocytic polysaccharide capsule; and the ability to survive and proliferate at 37°C. In this sense, the objective of this study was identified proteins involved in the response of C. gattii strain R265 to the temperature variation experimented when the fungi leaves the environment to survive in the host, using in vitro analysis and comparative proteomics. Our data demonstrated that the proteins up-regulated at 25°C act mainly in protein, carbohydrate, lipid, organic acid and amino acid metabolic processes and proteins up-regulated at 37°C participate mostly in processes that include phosphorylation, methylation, ketone body, GTP and ATP catabolic process and nucleoside metabolic process. The most striking difference between the conditions tested is the prevalence of proteins involved in oxidation-reduction in C. gattii growth at 25°C and the presence of a relevant number of proteins involved in stress response and catabolic process in C. gattii growth at 37°C. In brief, this study is the first proteomic analysis to provided information about proteins regulated by the infection temperature and the first description of the response of C. gattii high virulent strain R265 to this condition. The proteins identified could be targets to further studies for the identification of key proteins for the development at 37°C and to the search for biomarkers that can contribute to the treatment and prevention of cryptococcosis caused by this pathogen.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

A hiperamonemia é o principal elemento na patogênese da encefalopatia hepática e a neurotoxicidade da amônia envolve um efeito no sistema de neurotransmissão glutamatérgica. Os astrócitos são intimamente relacionados com a transmissão glutamatérgica e, de fato, muitas alterações gliais específicas têm sido relatadas devido à exposição à amônia. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como um parâmetro de ativação glial em diversas situações de injúria cerebral. Entretanto, existe pouca informação sobre essa proteína na toxicidade da amônia e nada se sabe sobre a sua secreção por astrócitos durante uma exposição à amônia. Nesse trabalho, nós investigamos a secreção de S100B em astrócitos corticais de ratos expostos de forma aguda à amônia, bem como a morfologia astrocítica, o imunoconteúdo da proteína fibrilar ácida glial (GFAP) e a atividade da enzima glutamina sintetase (GS). Além disso, investigamos um possível efeito da creatina nesses parâmetros gliais, devido a esse composto ter um suposto papel contra a toxicidade da amônia em culturas celulares. Encontramos um aumento da secreção de S100B em astrócitos expostos por 24 h à amônia, acompanhado de uma redução do imunoconteúdo de GFAP e da atividade da GS. Como elevados e persistentes aumentos extracelulares de S100B têm um efeito tóxico em células neuronais, a secreção alterada de S100B induzida pela amônia pode contribuir para o dano cerebral observado na encefalopatia hepática. A adição de creatina não impediu esse aumento na secreção de S100B, mas foi capaz de impedir a redução da concentração de GFAP e da atividade da GS induzidas pela exposição à amônia. / Hyperammonemia is a major element in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) and ammonia neurotoxicity involves an effect on the glutamatergic neurotransmitter system. Astrocytes are intimately related to glutamatergic neurotransmission and, in fact, many specific glial alterations have been reported due to ammonia exposure. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury. However, there is little information about this protein in ammonia toxicity and none about its secretion in astrocytes under ammonia exposure. In this study we investigated S100B secretion in rat cortical astrocytes acutely exposed to ammonia, as well astrocyte morphology, glial fibrillary acidic protein (GFAP) content and glutamine synthetase (GS) activity. Moreover, we studied a possible effect of creatine on these glial parameters, since that this compound has a putative role against ammonia toxicity in cell cultures. We found an increase in S100B secretion by astrocytes exposed to ammonia for 24 h, accompanied by a decrease in GFAP content and GS activity. Since elevated and persistent extracellular S100B plays a toxic effect on neural cells, altered extracellular content of S100B induced by ammonia could contribute to the brain impairment observed in HE. Creatine addition did not prevent this increment in S100B secretion, but was able to prevent the decrease in GFAP content and GS activity induced by ammonia exposure.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-06T13:36:54Z No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / A utilização de plantas como sistema de produção de proteínas é uma alternativa que está crescendo, e se tornando um importante recurso para a expressão de proteínas de uso terapêutico e de enzimas. Progressos significativos têm sido feitos no desenvolvimento de proteínas recombinantes produzidas em cultura celular e em tecidos de plantas, além de avanços no desenho e implementação de biorreatores. Portanto, o objetivo deste estudo é utilizar sistema de planta para expressão transiente de proteínas recombinantes. Um dos objetivos específicos é expressar a proteína docapsídeo de norovirus (NV CP) para montagem de virus like particles (VLP)utilizando vetor binário e os genes de supressor viral de silenciamento gênico(SG). Outro objetivo específico é produzir o antígeno multiepitopo do vírus dadengue utilizando vetor viral baseado no Cucumber mosaic virus (CMV). Comoobjetivo específico final o vetor baseado no CMV foi testado como vetor deindução de silenciamento gênico (VIGS). Para a expressão de NV CP, asproteínas VP1 e VP2 deste vírus foram clonadas em vetor binário ecoexpressas com a proteína viral supressora de SG, 126 K de Pepper mildmottle virus, em Nicotiana benthamiana. Para visualização, as VLPs forampurificadas de folhas agroinfiltradas e observadas no microscópio eletrônico de transmissão. O uso de vetor binário e gene de supressor viral de SG foi viável para expressão e montagem de NV VLP. Para a expressão da proteínamultiepitopo do vírus da dengue, foi realizada a modificação do vetor viralbaseado no CMV. O RNA 2 do vírus foi modificado para conter os sítios declonagem, e o genoma do vírus foi clonado em vetor binário para que o mesmo pudesse ser utilizado no sistema de agroinfiltração. Os resultados demonstraram que o vetor de expressão baseado no CMV produziu a proteína de interesse com baixo rendimento e que, portanto, deve ser aprimorado. Como objetivo de testar, portanto, a viabilidade deste vetor como VIGS, o mesmo foi modificado novamente para que pudesse realizar a clonagem utilizando sistema de recombinação. Para isso, o gene da fitoeno desaturase (PDS) foi clonado neste vetor, e os resultados demonstraram que o mesmo é infeccioso,porém novos testes serão realizados para aprimorar seu uso como VIGS. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of plant system as protein expression is an alternative strategy for themass production of therapeutic proteins and enzymes. Significant progresshave been made in producing recombinant proteins in plant cell culture and inplant tissues for the implementation as bioreactors. Therefore, the aim of thisstudy is to use plant system for transient expression of human virus antigen.One of viral proteins expressed was the capsid protein of norovirus (NV-CP) forassembly of virus like particles (VLP) using binary vector and viral suppressorsilencing gene (SG). Another protein was the dengue multi-epitope antigenusing Cucumber mosaic virus (CMV)-based viral vector. CMV-based vector wastested also as the vector induced gene silencing (VIGS) vector. For expressionof NV-CP, the gene of VP1 and VP2 protein were cloned into binary vector andco-expressed with viral protein suppressor (SG), 126K protein of Pepper mildmottle virus in Nicotiana benthamiana. To confirm the VLPs assembly, thepurified VP1 fraction was observed by transmission electron microscopy. Theresults demonstrated that the system using binary vector and SG is viable forthe expression and assembly of NV VLPs. For dengue multiepitopo proteinexpression, the CMV-based vector was modified. CMV RNA 2 segment wasmodified to contain new cloning site and virus genome was cloned into thebinary vector to be used in agroinfiltration system. The results showed thatCMV-based protein expression vector produced the target protein with lowlevels and, therefore, should be improved the system. To evaluate the viabilityof the CMV as a VIGS vector, CMV vector was modified introducing Gatewayrecombination site (Invitrogen). The phytoene desaturase (PDS) gene wascloned into this vector and infiltrated expecting photo-breeching effect resultedas gene knock-down by VIGS. The results demonstrate that it was infectious,but clear knock-down phenotype as photo-breaching was not observed. Thefurther tests are needed to enhance the effect as VIGS.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-11-20T15:32:26Z No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiaMarquimFirmodeAraujo_Parcial.pdf: 136250 bytes, checksum: ba00c8ba05fb025625f3dd14c3a7222b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-26T10:50:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiaMarquimFirmodeAraujo_Parcial.pdf: 136250 bytes, checksum: ba00c8ba05fb025625f3dd14c3a7222b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T10:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiaMarquimFirmodeAraujo_Parcial.pdf: 136250 bytes, checksum: ba00c8ba05fb025625f3dd14c3a7222b (MD5) / Na terapia nutricional da fenilcetonúria (PKU) o elemento chave do tratamento é uma alimentação com baixo teor de fenilalanina (Phe), que deve ser mantida por toda a vida. O conhecimento sobre o teor de Phe dos alimentos é essencial para a prescrição da dieta. A Tabela de Conteúdo de Fenilalanina em Alimentos, construída pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (TCFA/ANVISA), visa suprir a carência de dados sobre o teor de Phe em alimentos em tabelas brasileiras de composição de alimentos. O objetivo deste estudo foi comparar criticamente os teores de proteínas e de Phe de vegetais in natura disponíveis na TCFA/ANVISA (Brasil) e em oito Tabelas de Composição de Alimentos (TCAs) estrangeiras, de forma a avaliar a aplicabilidade das informações contidas nessas tabelas para a elaboração da dieta dos pacientes fenilcetonúricos. Testes estatísticos (teste de Wilcoxon e correlação de Spearman) foram realizados para analisar a variabilidade dos teores de proteínas e de Phe dos vegetais (16 frutas, 15 verduras, 12 legumes, 12 raízes, bulbos e tubérculos) entre as TCAs. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas (p>0,05) entre os resultados de proteínas e de Phe expressos na TCFA/ANVISA (Brasil) e a maior parte das TCAs estrangeiras, com exceção: (a) dos teores de proteínas das verduras entre a TCFA/ANVISA (Brasil) e a tabela FAO-AA (p=0,031); (b) dos teores de Phe das frutas entre a TCFA/ANVISA (Brasil) e a tabela DTU FOOD (Dinamarca) (p=0,046); e (c) dos teores de Phe das verduras, entre a TCFA/ANVISA (Brasil) e as tabelas FAO-AA (p=0,031) e FCNT (Alemanha) (p=0,008). Constatou-se que ao redor de 30% dos vegetais da TCFA/ANVISA (Brasil) devem ser reanalisados devido à elevada dispersão observada nos teores de Phe expressos nas TCAs. Correlação positiva foi observada entre os teores de Phe e de proteínas dos vegetais na maior parte das TCAs, o que sugere ser possível estimar o conteúdo de Phe a partir do conteúdo proteico, utilizando-se as concentrações de 3% a 4% de Phe nas proteínas. As frutas (n=15) incluídas neste estudo apresentaram teores médios de Phe inferiores a 75mg/100g, com exceção do abacate. Dezenove vegetais dos demais grupos também apresentaram teores médios de Phe inferiores a 75mg/100g, o que parece ser um dado importante, uma vez que resultados de estudos clínicos sugerem que esses vegetais podem ser classificados como de consumo livre pelos fenilcetonúricos. / The key element in the dietary treatment of phenylketonuria (PKU) is a low phenylalanine (Phe) diet, which must be maintained throughout life. The knowledge about the content of Phe in foods is essential for prescribing diet. Phenylalanine Content of Food Table, developed by the National Health Surveillance Agency (TCFA/ANVISA), aims to fulfill a data gap on the Phe content of foods in Brazilian food composition tables. The aim of this study was to critically compare the protein and Phe levels of raw vegetables available in TCFA/ANVISA (Brazil) and in eight foreign food composition tables (FCT) in order to evaluate the applicability of the information contained in these tables to elaborate the diet of people with phenylketonuria. Statistical analysis (Wilcoxon test and Spearman correlation) were performed to analyze the variability of the levels of protein and Phe of vegetables (16 fruits, 15 vegetables, 12 legumes, 12 roots, bulbs and tubers) among FCTs. No statistically significant differences (p> 0.05) were observed among the results of protein and Phe expressed in TCFA/ANVISA (Brazil) and most foreign FCTs, except for: (a) the protein content of vegetables between the TCFA/ANVISA (Brazil) and the FAO-AA table (p = 0.031); (b) the levels of Phe of fruits between TCFA/ANVISA (Brazil) and the DTU FOOD table (Denmark) (p = 0.046); and (c) the levels of Phe of vegetables among TCFA/ANVISA (Brazil) and FAO-AA (p = 0.031) and FCNT (Germany) (p = 0.008) tables. It was found that around 30% of vegetables in TCFA/ANVISA (Brazil) should be reanalysed due to the high variability observed in the levels of Phe expressed in the FCTs. It was noticed that protein level was correlated with the content of Phe of vegetables in most of the FCTs. This suggests that it is possible to predict the Phe content based on the protein, assuming that 1g of protein contains 30mg to 40mg of Phe. The mean levels of Phe of 15 fruits included in this study were below 75mg/100g except for avocado. The mean levels of Phe of 19 vegetables from the other groups were also below 75mg/100g. This appears to be an important finding, since the results of clinical studies suggest that these vegetables could be incorporated into the diet of people with phenylketonuria freely.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Biofísica, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-02-13T19:20:31Z No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / A bradicinina (Bk) é um nonapeptídeo vasodilatador que apresenta regiões com aminoácidos susceptíveis à ação de proteases. Quando metabolizada, a Bk não promove vasodilatação, devido à meia-vida reduzida. O objetivo deste trabalho é analisar a atividade da Bk e de dois análogos na presença de um inibidor de proteases denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin (BTCI). Sistemas contendo BTCI e Bk e seus análogos foram caracterizados estruturalmente na forma de complexos moleculares, por métodos espectroscópicos. As atividades dessas moléculas nas formas livre e de complexos, bem como o efeito na contratilidade em músculo liso de cobaia, foram avaliadas em ensaios colorimétricos in vitro e ex vivo. Além disso, o efeito do BTCI na potencialização da ação hipotensora da Bk e dos seus análogos foi investigado por meio de ensaios in vivo em ratos normotensos. As dimensões moleculares do BTCI na presença dos peptídeos, monitoradas por espalhamento de luz dinâmico, indicou formação de complexos entre estas moléculas. Esse processo foi associado a alterações conformacionais na estrutura do BTCI, monitoradas por espectroscopia de dicroísmo circular distante do UV. Adicionalmente, ensaios enzimáticos mostraram que o BTCI mantém sua atividade inibitória contra proteases na presença dos peptídeos e impede a degradação de Bk e seus análogos por estas proteases. Os ensaios em íleo de cobaia demonstraram que Bk e seus análogos apresentam atividade na contração do músculo liso, que é mantida quando adicionadoso BTCI e as proteases. Quando o BTCI foi testado in vivo em ratos Wistar, associado à Bk e aos análogos, diminuição da resistência vascular e, consequentemente, da hipotensão, foram observadas, além da vasodilatação renal e aórtica, principalmente quando complexado com a Bk e a Bk2. O presente estudo mostrou a inibição de proteases pelo BTCI na presença de Bk e seus análogos e indica este inibidor como uma ferramenta promissora para o aumento dos efeitos da Bk que visem o controle da hipertensão. Além disso, foi mostrado que os análogos de Bk podem ser utilizados como estratégia para o desenvolvimento de um sistema hipotensor de ação prolongada. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bradykinin (Bk) is a vasodilator nonapeptide presenting amino acid residues susceptible to proteases cleavage. Bk does not promote vasodilation when metabolized due its reduced half-life in this condition. The aim of this study was to analyze the activity of Bk and two analogs in the presence of the protease inhibitor named black-eyed pea trypsin proteases/chymotrypsin, BTCI. The BTCI, Bk and its analogues were characterized by spectroscopic methods in free and complexes forms. Ex vivo assays using guinea pig ileum were carried out to monitor the activity of the molecules in solution. Furthermore, the potentiation of the hypotensive action of Bk and its analogues, in the presence of BTCI, was investigated in normotensive rats. The hydrodynamic diameters of BTCI in the presence of peptides,monitored by dynamic light scattering, indicated the formation of complexes between these molecules. It was associated with conformational changes of BTCI,indicated by far- UV circular dichroismspectroscopy. Additionally, enzymatic assays showed that BTCI retains its inhibitory activity against proteases in the presence of these peptides, inhibiting their proteolytic degradation. Tests on guinea pig ileum demonstrated that BK and its analogues exhibit activity on the smooth muscle in the absence and presence of BTCI. When BTCI was tested in vivo on Wistar rats, in the presence of Bk and its analogues, induced a decrease in vascular resistance and, consequently, hypotension, as well as renal and aortic vasodilation, mainly when in complex with Bk and Bk2. This study indicates BTCI as a promising tool for increasing the effects of Bk aiming hypertension control. Furthermore, it shows that BK analogues are good strategies for the development of a system for prolonged hypotensive action.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-24T19:10:51Z No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-28T17:56:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-28T17:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Vírus de planta desenvolveram uma classe de proteínas responsáveis por garantir a infecção e disseminação viral. Estudos vêm demonstrando que essa classe de proteínas de movimento (MPs), interage com o plasmodesma (PD), aumentando o seu limite de exclusão (LEP), possibilitando a passagem dos vírus. Várias estratégias são utilizadas para o estudo de movimento viral. Alguns sistemas baseiam-se na utilização de clones infecciosos que possibilitam a inserção de genes heterólogos de MPs. Para o estudo do movimento célula à célula e sistêmico utilizamos o vetor viral Alfalfa mosaic virus (AMV). O sistema consiste na utilização de transgênicos P12 em combinação com transcritos do RNA 3 adaptados para a inserção de genes heterólogos. Com base neste sistema, demonstramos que a proteína de movimento NSm, pode ter relação com a limitação ou amplitude no espectro de infecção viral devido às diferenças significativas observadas no movimento célula à célula e sistêmico de tospovírus que apresentam características moleculares e biológicas distintas (Capítulo II). Concluímos que a movimentação das espécies do gênero tospovírus é dependente da formação de vírions baseado no contexto AMV de infecção e movimentação (Capítulo II). Também concluímos que as MPs de 4 espécies de tospovírus estudadas, são eficientes na formação de túbulos. Em ensaios de truncamento das MPs observamos que para o BeNMV, o extremo C-terminal não é essencial para o movimento, a partir da identificação do limite de aminoácidos que poderiam ser deletados da MP sem inibição do movimento célula à célula. Contrastantemente, as MPs dos vírus CSNV, TCSV e TSWV demonstraram a necessidade da integridade da proteína para garantia do movimento (Capítulo II). Com a utilização das metodologias de “biomolecular fluorescence complementation” (BiFC) e tratamentos químicos com Na2CO3 e Ureia, a partir das MPs, sugerimos que as NSm se associam a membrana de forma periférica. Baseado em predições de hidrofobicidade e orientação topológicas (BiFC topology) sugerimos o modelo de interação da NSm com membrana celular, onde a região central hidrofóbica está mergulhada na periferia das membranas lipídicas e os extremos C e N-terminal livres apontados ao citoplasma (Capítulo III). Finalmente, com a metodologia de BiFC de interação, a partir de ensaios de dímeros, heterodímeros, intra-associação e inter-associação de homólogos e heterólogos de MP e NP (nucleoproteína) observamos que: i) todas NSm e N são eficientes na formação de dímeros ii) as NSm interagem com a sua N cognata e iii) nós observamos interação entre NSm, N e NSm-N entre espécies distintas de tospovírus. Estes resultados podem facilitar uma melhor interpretação das interações de proteína viral com especial ênfase na compreensão das questões de infecção mista. Além do uso de transgênicos na expressão de proteínas heterólogas para geração de resistência, abordagens através do uso de resistência natural também vem sendo exploradas contra espécies do gênero Tospovirus. O presente estudo avaliou o envolvimento de 4 NSm de distintos tospovírus com a resposta de resistência (reação de hipersensibilidade e necrose) mediada pelo gene Sw5-b inserido em plantas de Nicotiana benthamiana. Substituições dos aminoácidos de posição C118Y e T120N da proteína NSm, caracterizados como cruciais para resistência foram realizados. BeNMV, CSNV, TCSV e TSWV NSm wt fusionadas a HA (Hemagglutinin), em processo de agroinfiltração, foram desafiadas contra plantas de N. benthamiana transformadas com gene Sw5-b. Observamos a possível quebra de resistência a partir da NSm do BeNMV, onde não observou-se reação necrótica. Plantas infiltradas com as demais NSm reagiram com resposta necrótica (Capítulo IV). Novo ensaio com vetores contendo as NSm com modificação dos aminoácidos C118 por Y e T120 por N foi desenvolvido. Baseado no resultado do ensaio anterior, as MPs que continham os aminoácidos essenciais para ruptura da resistência, foram modificadas por aminoácidos que não garantem a ruptura e o contrário foi feito para aquelas MPs que não ultrapassaram a resistência. Com base nessa abordagem observamos que CSNV, TCSV e TSWV NSm superaram a resistência sem a formação de necrose foliar, resultado que difere do observado com as mesmas MPs sem mutação, e intrigantemente, a BeNMV NSm aparentemente também superou a resistência sem a formação de lesões locais e necrose foliar após a modificação dos aminoácidos, dado contrastante. No contexto de infecção viral utilizando o sistema AMV, não obtivemos resultados satisfatórios de manutenção ou ruptura da resistência. (Capítulo V). No gênero Tospovirus, pouco se sabe sobre o sítio de replicação ou sobre envolvimento de organelas celulares com o processo de infecção. Existem apenas evidências de expressão isolada das proteínas virais co-localizando com filamentos de Actina e miosina, Membrana, ER e Complexo de Golgi. No presente estudo, com auxílio de metodologia de BiFC, além de ensaio com expressão heteróloga da NSm no contexto de infecção do vírus Potato virus X (PVX), visualizamos a associação da NSm de tospovírus com cloroplatos. Hipotetizamos o possível envolvimento dessa organela com processo de infecção dos tospovírus (Capítulo IV).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).