A dieta cetogênica (DC) é uma dieta com baixos níveis de carboidratos e proteínas e altos níveis de gordura, incluída como prática médica contra desordens convulsivas, particularmente em crianças refratárias a tratamentos com drogas antiepilépticas convencionais. Contudo, a base molecular do efeito terapêutico permanece incerta. Considerando as evidências da importância das células gliais para o desenvolvimento neuronal, sobrevivência e plasticidade, investigou-se marcadores astrocitários protéicos de ratos alimentados com a DC, em diferentes regiões do hipocampo, estrutura comumente envolvida em desordens convulsivas. Encontrou-se um aumento transitório na GFAP na região CA3 do hipocampo, mas não nas regiões CA1 e giro denteado. Esta mudança não foi acompanhada por mudanças no conteúdo de S100B ou na atividade da glutamina sintetase.Com o intuito de avaliar um possível comprometimento hipocampal foi investigado o comportamento cognitivo espacial com a tarefa do labirinto aquático. Nenhuma mudança foi observada. Esta gliose transitória na região CA3 pode estar relacionada a ou preceder outras mudanças na vizinhança talvez envolvidas na atenuação das desordens convulsivas. Os dados reforçam a importância dos astrócitos hipocampais como alvos durante a ingestão da DC.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

A dieta cetogênica (DC) é uma dieta com baixos níveis de carboidratos e proteínas e altos níveis de gordura, incluída como prática médica contra desordens convulsivas, particularmente em crianças refratárias a tratamentos com drogas antiepilépticas convencionais. Contudo, a base molecular do efeito terapêutico permanece incerta. Considerando as evidências da importância das células gliais para o desenvolvimento neuronal, sobrevivência e plasticidade, investigou-se marcadores astrocitários protéicos de ratos alimentados com a DC, em diferentes regiões do hipocampo, estrutura comumente envolvida em desordens convulsivas. Encontrou-se um aumento transitório na GFAP na região CA3 do hipocampo, mas não nas regiões CA1 e giro denteado. Esta mudança não foi acompanhada por mudanças no conteúdo de S100B ou na atividade da glutamina sintetase.Com o intuito de avaliar um possível comprometimento hipocampal foi investigado o comportamento cognitivo espacial com a tarefa do labirinto aquático. Nenhuma mudança foi observada. Esta gliose transitória na região CA3 pode estar relacionada a ou preceder outras mudanças na vizinhança talvez envolvidas na atenuação das desordens convulsivas. Os dados reforçam a importância dos astrócitos hipocampais como alvos durante a ingestão da DC.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

A hiperamonemia é o principal elemento na patogênese da encefalopatia hepática e a neurotoxicidade da amônia envolve um efeito no sistema de neurotransmissão glutamatérgica. Os astrócitos são intimamente relacionados com a transmissão glutamatérgica e, de fato, muitas alterações gliais específicas têm sido relatadas devido à exposição à amônia. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como um parâmetro de ativação glial em diversas situações de injúria cerebral. Entretanto, existe pouca informação sobre essa proteína na toxicidade da amônia e nada se sabe sobre a sua secreção por astrócitos durante uma exposição à amônia. Nesse trabalho, nós investigamos a secreção de S100B em astrócitos corticais de ratos expostos de forma aguda à amônia, bem como a morfologia astrocítica, o imunoconteúdo da proteína fibrilar ácida glial (GFAP) e a atividade da enzima glutamina sintetase (GS). Além disso, investigamos um possível efeito da creatina nesses parâmetros gliais, devido a esse composto ter um suposto papel contra a toxicidade da amônia em culturas celulares. Encontramos um aumento da secreção de S100B em astrócitos expostos por 24 h à amônia, acompanhado de uma redução do imunoconteúdo de GFAP e da atividade da GS. Como elevados e persistentes aumentos extracelulares de S100B têm um efeito tóxico em células neuronais, a secreção alterada de S100B induzida pela amônia pode contribuir para o dano cerebral observado na encefalopatia hepática. A adição de creatina não impediu esse aumento na secreção de S100B, mas foi capaz de impedir a redução da concentração de GFAP e da atividade da GS induzidas pela exposição à amônia. / Hyperammonemia is a major element in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) and ammonia neurotoxicity involves an effect on the glutamatergic neurotransmitter system. Astrocytes are intimately related to glutamatergic neurotransmission and, in fact, many specific glial alterations have been reported due to ammonia exposure. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury. However, there is little information about this protein in ammonia toxicity and none about its secretion in astrocytes under ammonia exposure. In this study we investigated S100B secretion in rat cortical astrocytes acutely exposed to ammonia, as well astrocyte morphology, glial fibrillary acidic protein (GFAP) content and glutamine synthetase (GS) activity. Moreover, we studied a possible effect of creatine on these glial parameters, since that this compound has a putative role against ammonia toxicity in cell cultures. We found an increase in S100B secretion by astrocytes exposed to ammonia for 24 h, accompanied by a decrease in GFAP content and GS activity. Since elevated and persistent extracellular S100B plays a toxic effect on neural cells, altered extracellular content of S100B induced by ammonia could contribute to the brain impairment observed in HE. Creatine addition did not prevent this increment in S100B secretion, but was able to prevent the decrease in GFAP content and GS activity induced by ammonia exposure.

PAES, L. C. F. Efeito anticonvulsivante e antioxidante do peptídeo sintético LS9 sobre modelo de convulsão induzido por pentilenotetrazol em camundongos. 2017. 70 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-14T13:38:47Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_lcfpaes.pdf: 1142566 bytes, checksum: adec2be0fd42cb1979a696c39063adfc (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-14T13:38:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_lcfpaes.pdf: 1142566 bytes, checksum: adec2be0fd42cb1979a696c39063adfc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T13:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_lcfpaes.pdf: 1142566 bytes, checksum: adec2be0fd42cb1979a696c39063adfc (MD5) Previous issue date: 2017-01-12 / Natural compounds have been used as sources of new molecules acting in the central nervous system. Recently our research group observed the anticonvulsant action of ant venom Dinoponera quadriceps in model of seizure induced by pentylenetetrazole (PTZ). In order to find out which molecules present in the venom are responsible for the mentioned effect, the peptide Dq-Fa, a natural component found in the venom of the Dinoponera quadriceps ant, was synthesized, titled LS9, and used in the present study in a model of convulsion induced by PTZ and on astrocyte culture in vitro. Male Swiss mice (28-33g) were pretreated with LS9 (0.1, 0.2 or 0.4 mg / kg, i.p., n = 6-8). Half an hour after pretreatment, seizure was induced in all animals by administration of PTZ (80 mg / kg). In the behavioral analysis, the times for the occurrence of the first seizure and time of death were recorded. To determine the parameters of oxidative stress, three cerebral areas (prefrontal cortex, hippocampus and striatum) were used and malondialdehyde (MDA), nitrite content and reduced glutathione levels (GSH) were measured. In the in vitro assay, the cell viability of cortical astrocytes was determined after treatment with different concentrations of LS9 or LS9 + PTZ for 24 hours by the MTT method (3- (4,5-dimethyl-2-thiazole bromide) -2, 5-diphenyl-2-H). The data were analyzed by ANOVA and Student-Newman-Keuls as a post-test, for the in vivo tests, and ANOVA followed by the Bonferroni post-test, for the in vitro experiments. The behavioral results found showed that all the analyzed concentrations of the peptide were able to increase the latency for the first seizure, with a concentration of 0.2 mg / kg significantly increased the latency period of death. There was a decrease in MDA levels in the prefrontal cortex (0.1 and 0.2 mg / kg concentrations), hippocampus (0.1 mg / kg concentration) and striatum (in all concentrations analyzed). All concentrations tested were able to significantly decrease the formation of nitrite in the prefrontal cortex. In the hippocampus and striatum the effect was similar, but not at all concentrations. At concentrations of 0.2 mg / kg, there was an increase in GSH levels in the prefrontal cortex, concentrations of 0.1 and 0.2 mg / kg promoted an increase in the striatum and there was no change in the hippocampus. In the in vitro assay, the results show that this peptide was not able to decrease the viability of cortical astrocytes and did not promote alteration of cell viability when associated with PTZ. Our findings show that the synthetic peptide LS9 promoted anticonvulsant effect, decreased production of lipid peroxidation and nitrite and increased GSH. In addition, it was not able to alter cell viability in cortical astrocyte culture in vitro, demonstrating no toxic effect in this cell line. / Compostos naturais tem sido utilizado como fontes de novas moléculas com atuação no sistema nervoso central. Recentemente nosso grupo de pesquisa observou a ação anticonvulsivante do veneno da formiga Dinoponera quadriceps em modelo de convulsão induzido pelo pentilenotetrazol (PTZ). Com o intuito de descobrir quais moléculas presentes no veneno são responsáveis pelo efeito mencionado, o peptídeo Dq-Fa, componente natural encontrado no veneno da formiga Dinoponera quadriceps, foi sintetizado, intitulado de LS9, e utilizado no presente estudo em modelo de convulsão induzido por PTZ e sobre cultura de astrócitos in vitro. Camundongos Swiss machos (28-33g) foram pré-tratados com o LS9 (0,1; 0,2 ou 0,4 mg/kg, i.p., n= 6-8). Meia hora após o pré-tratamento foi induzida a convulsão em todos os animais através da administração de PTZ (80 mg/kg). Na análise comportamental, foram registrados os tempos para ocorrência da primeira convulsão e tempo de morte. Para determinação dos parâmetros de estresse oxidativo foram utilizadas três áreas cerebrais (córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado) e mensurado os níveis de malondialdeído (MDA), o conteúdo de nitrito e nível de glutationa reduzida (GSH). No ensaio in vitro, foi determinada a viabilidade celular de astrócitos corticais, após o tratamento com diferentes concentrações de LS9 ou LS9 + PTZ, durante 24 horas, pelo método do MTT (brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difenil-2-H). Os dados foram analisados por ANOVA e Student-Newman-Keuls como pós-teste, para os ensaios in vivo, e ANOVA seguido pelo pós-teste de Bonferroni, para as experimentações in vitro. Os resultados comportamentais encontrados mostraram que todas as concentrações analisadas do peptídeo foram capazes de aumentar a latência para a ocorrência da primeira convulsão, sendo que a concentração de 0,2mg/kg aumentou, significativamente, o período de latência de morte. Houve diminuição dos níveis de MDA no córtex pré-frontal (nas concentrações 0,1 e 0,2mg/kg), hipocampo (na concentração de 0,1mg/kg) e corpo estriado (em todas as concentrações analisadas). Todas as concentrações testadas foram capazes de diminuir, significantemente, a formação de nitrito no córtex pré-frontal. No hipocampo e no corpo estriado o efeito foi semelhante, porém não em todas as concentrações. Na concentração de 0,2mg/kg, houve aumento dos níveis de GSH no córtex pré-frontal, as concentrações de 0,1 e 0,2mg/kg promoveram aumento no corpo estriado e não houve alteração no hipocampo. No ensaio in vitro, os resultados mostram que esse peptídeo não foi capaz de diminuir a viabilidade de astrócitos corticais e não promoveu alteração da viabilidade celular quando associado com PTZ. Nossos achados demonstram que o peptídeo sintético LS9 promoveu efeito anticonvulsivante, diminuiu a produção de peroxidação lipídica e nitrito e aumentou GSH. Além disso, não foi capaz de alterar a viabilidade celular em cultura de astrócitos corticais in vitro, não demonstrando efeito tóxico nessa linhagem celular.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-23T04:04:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337594.pdf: 3935498 bytes, checksum: a2ac9a3d0095a113d0a386cdb6154360 (MD5) Previous issue date: 2015 / Embora identificados há 150 anos, os astrócitos ainda suscitam discussões na comunidade científica a respeito das funções que desempenham no processamento da informação cerebral. Estudos do início da década de 90 apontaram que essas células poderiam não só atuar como suporte estrutural e homeostático aos neurônios, mas também modular a transmissão sináptica. A principal evidência que suportou essa hipótese foi a constatação de que o aumento da concentração intracelular de cálcio nos astrócitos, fenômeno denominado ?sinalização de cálcio?, desencadeia a liberação de transmissores químicos no meio extracelular, podendo alterar a dinâmica das sinapses. Observou-se também que essa sinalização não se restringe a uma célula, mas que ela avança ao longo da rede de astrócitos dando origem às ?ondas de cálcio?. Deste modo, constatou-se que essa sinalização é uma peça chave no debate a respeito das funções dos astrócitos. A discrepância observada nos resultados experimentais disponibilizados na literatura impossibilita uma conclusão absoluta sobre o assunto. Nessa perspectiva surge a proposta de se abordar o tema por meio da modelagem matemática. Alguns modelos que visam descrever a sinalização de cálcio nos astrócitos já foram propostos na literatura, todavia, eles são de cunho empírico e não levam em conta a complexa geometria dessas células. Diante desse cenário propõe-se o presente trabalho, que visa elaborar um modelo matemático fenomenológico, biologicamente coerente, para ondas de cálcio em astrócitos. Posteriormente, esse modelo pode ser aperfeiçoado para a predição da liberação dos transmissores químicos no meio extracelular e, deste modo, contribuir para a discussão sobre a possível modulação sináptica realizada pelos astrócitos. Após a definição dos fenômenos a serem considerados e da geometria celular a ser adotada, formulou-se o modelo matemático, que foi resolvido numericamente utilizando-se o método das diferenças finitas. Desenvolveu-se um aplicativo computacional que permite simular diversas geometrias de células e de redes de astrócitos. O modelo apresentou um comportamento coerente, semelhante a um resultado experimental disponibilizado na literatura para astrócitos em cultura. O período de oscilação, 16,5 s, e a máxima concentração de cálcio na célula, 0,7 µM, foram coerentes com os resultados experimentais. Foi possível também estudar a dinâmica da sinalização em redes de astrócitos, demonstrando que o modelo e o aplicativo propostos são adequados para descrever o fenômeno em estudo.<br> / Abstract : Astrocytes have been identified 150 years ago, but they still raise discussions in the scientific community about the role they play in brain information processing. Early 90?s studies showed that these cells could not only act as structural and homeostatic support to the neurons, but they also modulate synaptic transmission. The main evidence that supported this hypothesis was the finding that the increase in intracellular calcium concentration in astrocytes, a phenomenon called "calcium signaling", triggers the release of chemical transmitters in the extracellular fluid, may change the synapses dynamics. It was also observed that this signaling is not limited to one cell but it spreads along the astrocytes network like "calcium waves". Thus, it was found that this signaling is a key in the debate about the astrocytes functions. A discrepancy observed in the experimental results available in the literature precludes an absolute conclusion about it. From this perspective comes the proposal to approach the issue through mathematical modeling. Some models that aim to describe the calcium signaling in astrocytes have been proposed in the literature, however, they are empirical and they do not take into account the complex geometry of these cells. Facing this scenario this work is proposes to develop a phenomenological model, biologically consistent, to calcium waves in astrocytes. This model might later predict the release of chemical transmitters in the extracellular fluid and to contribute to the discussion on the possible synaptic modulation performed by astrocytes. After defining the phenomena to be considered and cell geometry to be adopted, the mathematical model was formulated and solved numerically using the finites differences method. A computer application was developed to simulate different cells geometries and astrocytes networks. The model showed a consistent behavior, similar to an experimental result in the available literature for astrocytes in culture. The period of oscillation, 16.5 s, and the maximum cell calcium concentration, 0.7 µM, were consistent with the experimental results. It was also possible to study the dynamics of signaling in astrocytes networks, showing that the model and the proposed application are suitable to describe the phenomenon under study.

A hiperamonemia é o principal elemento na patogênese da encefalopatia hepática e a neurotoxicidade da amônia envolve um efeito no sistema de neurotransmissão glutamatérgica. Os astrócitos são intimamente relacionados com a transmissão glutamatérgica e, de fato, muitas alterações gliais específicas têm sido relatadas devido à exposição à amônia. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como um parâmetro de ativação glial em diversas situações de injúria cerebral. Entretanto, existe pouca informação sobre essa proteína na toxicidade da amônia e nada se sabe sobre a sua secreção por astrócitos durante uma exposição à amônia. Nesse trabalho, nós investigamos a secreção de S100B em astrócitos corticais de ratos expostos de forma aguda à amônia, bem como a morfologia astrocítica, o imunoconteúdo da proteína fibrilar ácida glial (GFAP) e a atividade da enzima glutamina sintetase (GS). Além disso, investigamos um possível efeito da creatina nesses parâmetros gliais, devido a esse composto ter um suposto papel contra a toxicidade da amônia em culturas celulares. Encontramos um aumento da secreção de S100B em astrócitos expostos por 24 h à amônia, acompanhado de uma redução do imunoconteúdo de GFAP e da atividade da GS. Como elevados e persistentes aumentos extracelulares de S100B têm um efeito tóxico em células neuronais, a secreção alterada de S100B induzida pela amônia pode contribuir para o dano cerebral observado na encefalopatia hepática. A adição de creatina não impediu esse aumento na secreção de S100B, mas foi capaz de impedir a redução da concentração de GFAP e da atividade da GS induzidas pela exposição à amônia. / Hyperammonemia is a major element in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) and ammonia neurotoxicity involves an effect on the glutamatergic neurotransmitter system. Astrocytes are intimately related to glutamatergic neurotransmission and, in fact, many specific glial alterations have been reported due to ammonia exposure. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury. However, there is little information about this protein in ammonia toxicity and none about its secretion in astrocytes under ammonia exposure. In this study we investigated S100B secretion in rat cortical astrocytes acutely exposed to ammonia, as well astrocyte morphology, glial fibrillary acidic protein (GFAP) content and glutamine synthetase (GS) activity. Moreover, we studied a possible effect of creatine on these glial parameters, since that this compound has a putative role against ammonia toxicity in cell cultures. We found an increase in S100B secretion by astrocytes exposed to ammonia for 24 h, accompanied by a decrease in GFAP content and GS activity. Since elevated and persistent extracellular S100B plays a toxic effect on neural cells, altered extracellular content of S100B induced by ammonia could contribute to the brain impairment observed in HE. Creatine addition did not prevent this increment in S100B secretion, but was able to prevent the decrease in GFAP content and GS activity induced by ammonia exposure.

A dieta cetogênica (DC) é uma dieta com baixos níveis de carboidratos e proteínas e altos níveis de gordura, incluída como prática médica contra desordens convulsivas, particularmente em crianças refratárias a tratamentos com drogas antiepilépticas convencionais. Contudo, a base molecular do efeito terapêutico permanece incerta. Considerando as evidências da importância das células gliais para o desenvolvimento neuronal, sobrevivência e plasticidade, investigou-se marcadores astrocitários protéicos de ratos alimentados com a DC, em diferentes regiões do hipocampo, estrutura comumente envolvida em desordens convulsivas. Encontrou-se um aumento transitório na GFAP na região CA3 do hipocampo, mas não nas regiões CA1 e giro denteado. Esta mudança não foi acompanhada por mudanças no conteúdo de S100B ou na atividade da glutamina sintetase.Com o intuito de avaliar um possível comprometimento hipocampal foi investigado o comportamento cognitivo espacial com a tarefa do labirinto aquático. Nenhuma mudança foi observada. Esta gliose transitória na região CA3 pode estar relacionada a ou preceder outras mudanças na vizinhança talvez envolvidas na atenuação das desordens convulsivas. Os dados reforçam a importância dos astrócitos hipocampais como alvos durante a ingestão da DC.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.