A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.