O metabolismo cerebral é altamente dependente da glicose, que é derivada a partir da circulação sanguínea e metabolizada pelos astrócitos e outras células neuronais, através de várias vias. A captação da glicose no cérebro não envolve transportadores de glicose insulino-dependentes; no entanto, esse hormônio afeta o fluxo de glicose do cérebro. Alterações nos níveis de S100B (uma proteína derivada de astrócitos) no líquido cefalorraquidiano têm sido associados a alterações no metabolismo da glicose; no entanto, não há evidência que a insulina modula o metabolismo da glicose e a secreção de S100B. Investigamos então o efeito da S100B no metabolismo da glicose, medindo a incorporação de 3H-glicose em dois modelos, em células de glioma C6 e fatias hipocampais agudas, investigando o efeito da insulina sobre a secreção de S100B. Os nossos resultados mostram que: (a) a S100B em níveis fisiológicos diminui a captação de glicose, através da via do receptor multiligante RAGE e através da ativação da via de sinalização da proteína-quinase / ERK, e que (b) insulina estimulada a secreção de S100B via sinalização de PI3K. Os nossos resultados indicam a existência de uma relação insulina-S100B na modulação de glicose no tecido cerebral, o que pode melhorar a nossa compreensão sobre o metabolismo da glicose em várias condições, tais como a cetose, demência induzida por estreptozotocina e exposição farmacológica aos antipsicóticos, onde as mudanças de sinalização da insulina e extracelular celular de S100 foram relatados. / Brain metabolism is highly dependent on glucose, which is derived from the blood circulation and metabolized by the astrocytes and other neural cells via several pathways. Glucose uptake in the brain does not involve insulin-dependent glucose transporters; however, this hormone does affect the brain’s glucose in flux. Changes in cerebrospinal fluid levels of S100B (an astrocyte-derived protein) have been associated with alterations in glucose metabolism; however, there is no evidence as to whether insulin modulates glucose metabolism and S100B secretion. Herein we investigated the effect of S100B on glucose metabolism, measuring 3H-glucose incorporation in two preparations, C6 glioma cells and acute hippocampal slices, and we also investigated the effect of insulin on S100B secretion. Our results showed that: (a) S100B at physiological levels decreases glucose uptake, through via the multiligand receptor RAGE and mitogen-activated protein kinase/ERK signaling, and that (b) insulin stimulated S100B secretion via PI3K signaling. Our findings indicate the existence of insulin-S100B modulated glucose utilization in the brain tissue, and may improved our understanding of glucose metabolism in several conditions such as ketosis, streptozotocin-induced dementia and pharmacological exposure to antipsychotics, where changes of insulin signaling and extracellular cellular of S100 have been reported.

O diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) está associado a disfunções neurocognitivas e à astrogliose. Por outro lado, o exercício físico é capaz de prevenir danos cognitivos e de induzir importantes modificações no sistema nervoso central. Assim, o objetivo de nosso estudo foi investigar o efeito do exercício físico em esteira sobre a memória espacial e sobre a resposta de astrócitos no hipocampo de um modelo de DMT1. Cinqüenta e sete animais foram divididos em quatro grupos: controle treinado (TC) (n=15), controle não-treinado (NTC) (n=13), diabético treinado (TD) (n=14) e diabético não-treinado (NTD) (n=15). Um mês após a indução do diabetes pela estreptozotocina, os grupos treinados foram submetidos a cinco semanas de exercício físico, e então, todos os grupos foram avaliados na tarefa de reconhecimento do objeto reposicionado. A atividade locomotora foi avaliada em campo aberto e analisada pelo programa Anymaze. As expressões da proteína fibrilar glial ácida no hipocampo (GFAP) e da proteína S100B no hipocampo e no líquido cérebro-espinal foram mensuradas através do método de ELISA, e a imunorreatividade para GFAP hipocampal avaliada por imunoistoquímica associada à densitometria. Nossos resultados demonstraram que o exercício físico preveniu e/ou reverteu danos na memória espacial observado nos animais do grupo NTD. Diminuição na atividade locomotora foi observada em ambos os grupos NTD e TD quando comparado aos controles. As análises por ELISA e por imunoistoquímica mostraram que o os animais NTD apresentaram uma redução nos níveis de GFAP no hipocampo. Aumento nos níveis de S100B no líquido cérebroespinal foi observado no grupo NTD quando comparada a todos os demais, indicando que o exercício físico evitou essas alterações. Desse modo, nossos achados indicaram que o exercício físico evitou os déficits cognitivos e as alterações nos astrócitos induzidas pelo DMT1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is associated with neurocognitive dysfunction and astrogliosis. Physical exercise prevents cognitive impairments and induces important brain modifications. Thus, the aim of our study was to investigate the effect of treadmill exercise on spatial memory and astrocytic function in the hippocampus of a T1DM model. Fifty-seven Wistar rats were divided into four groups: trained control (TC) (n=15), non-trained control (NTC) (n=13), trained diabetic (TD) (n= 14) and nontrained diabetic (NTD) (n=15). One month after streptozotocin-induced diabetes, exercise groups were submitted to five weeks of physical training, and then, all groups were assessed in the novel object-placement recognition task. Locomotor activity was analyzed in the open field apparatus using Any-maze software. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S100B in hippocampus and cerebrospinal fluid were measured using ELISA assay, and hippocampal GFAP immunoreactivity was evaluated by means of immunohistochemistry and optical densitometry. The results showed that physical exercise prevents and/or reverts spatial memory impairments observed in NTD animals (P<0.01). Decreased locomotor activity was observed in both the NTD and TD groups when compared with controls (P<0.05). ELISA and immunohistochemistry analyzes showed there was a reduction in GFAP levels in the hippocampus of NTD animals, which was not found in TD group. ELISA also showed an increase in S100B levels in the cerebrospinal fluid from the NTD group (P<0.01) and no such increase was found in the TD group. Our findings indicate that physical exercise prevents and/or reverts the cognitive deficits and astroglial alterations induced by T1DM.

O metabolismo cerebral é altamente dependente da glicose, que é derivada a partir da circulação sanguínea e metabolizada pelos astrócitos e outras células neuronais, através de várias vias. A captação da glicose no cérebro não envolve transportadores de glicose insulino-dependentes; no entanto, esse hormônio afeta o fluxo de glicose do cérebro. Alterações nos níveis de S100B (uma proteína derivada de astrócitos) no líquido cefalorraquidiano têm sido associados a alterações no metabolismo da glicose; no entanto, não há evidência que a insulina modula o metabolismo da glicose e a secreção de S100B. Investigamos então o efeito da S100B no metabolismo da glicose, medindo a incorporação de 3H-glicose em dois modelos, em células de glioma C6 e fatias hipocampais agudas, investigando o efeito da insulina sobre a secreção de S100B. Os nossos resultados mostram que: (a) a S100B em níveis fisiológicos diminui a captação de glicose, através da via do receptor multiligante RAGE e através da ativação da via de sinalização da proteína-quinase / ERK, e que (b) insulina estimulada a secreção de S100B via sinalização de PI3K. Os nossos resultados indicam a existência de uma relação insulina-S100B na modulação de glicose no tecido cerebral, o que pode melhorar a nossa compreensão sobre o metabolismo da glicose em várias condições, tais como a cetose, demência induzida por estreptozotocina e exposição farmacológica aos antipsicóticos, onde as mudanças de sinalização da insulina e extracelular celular de S100 foram relatados. / Brain metabolism is highly dependent on glucose, which is derived from the blood circulation and metabolized by the astrocytes and other neural cells via several pathways. Glucose uptake in the brain does not involve insulin-dependent glucose transporters; however, this hormone does affect the brain’s glucose in flux. Changes in cerebrospinal fluid levels of S100B (an astrocyte-derived protein) have been associated with alterations in glucose metabolism; however, there is no evidence as to whether insulin modulates glucose metabolism and S100B secretion. Herein we investigated the effect of S100B on glucose metabolism, measuring 3H-glucose incorporation in two preparations, C6 glioma cells and acute hippocampal slices, and we also investigated the effect of insulin on S100B secretion. Our results showed that: (a) S100B at physiological levels decreases glucose uptake, through via the multiligand receptor RAGE and mitogen-activated protein kinase/ERK signaling, and that (b) insulin stimulated S100B secretion via PI3K signaling. Our findings indicate the existence of insulin-S100B modulated glucose utilization in the brain tissue, and may improved our understanding of glucose metabolism in several conditions such as ketosis, streptozotocin-induced dementia and pharmacological exposure to antipsychotics, where changes of insulin signaling and extracellular cellular of S100 have been reported.

Introdução: A apneia obstrutiva do sono (AOS) ocasiona a hipóxia intermitente (HI), causando doenças cardíacas, vasculares e neurológicas. O modelo de experimentação animal utiliza a HI para simular a AOS, permitindo a avaliação das alterações encefálicas, sendo o hipocampo uma área reconhecidamente influenciada pela hipóxia. A S100B é uma proteína de 21-kDa ligada ao cálcio, produzida e liberada principalmente pelos astrócitos no neurópilo do sistema nervoso central. Sua dosagem tem sido utilizada para compreender o envolvimento de distintos tipos celulares em determinadas condições patológicas. O presente estudo objetiva testar a hipótese de que a HI empregada em um modelo experimental de AOS em camundongos é capaz de alterar o número de astrócitos em diferentes subcamadas hipocampais (CA1, CA3 e DG), além de modificar qualitativamente a reatividade imuno-histoquímica destas células ao S100B. Materiais e Métodos: Camundongos CF-1 foram expostos ou a 35 dias de HI (n = 27) ou a HIS (n = 27), alternando 30 segundos de hipóxia progressiva a um nadir de 7%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Durante 8 horas, os animais sofreram um total de 480 ciclos de hipóxia/reoxigenação, equivalente a um índice de apneia de 60/hora. O encéfalo foi dissecado, sendo o hipocampo e suas subcamadas analisados histologicamente pela técnica de imuno-histoquímica com a utilização do anticorpo S100B. Resultados: Foi realizada a análise quantitativa dos astrócitos hipocampais imunorreagentes ao S100B. A média desta foi de 23,85 ± 0,37 astrócitos/0,25 mm2 no grupo HI, enquanto no grupo HIS foi de 21,03 ± 0,50 astrócitos/0,25 mm2 (p < 0,001). Esta diferença também foi também observada de forma global nas subcamadas CA1 e CA3, sendo menos perceptível no DG. A imunorreatividade astrocitária foi maior (+++) no grupo HI, não atingindo tal intensidade no grupo HIS. A análise qualitativa secundária evidenciou a presença de cariorrexe, de picnose neuronal, além de corpos celulares astrocitários discretamente hipertróficos apenas nos animais do grupo HI. Conclusão: A HI aumentou a densidade numérica de astrócitos hipocampais, assim como a imunorreatividade destas células ao S100B, no processo chamado de astrogliose reativa. Alterações neuronais secundárias também foram observadas no grupo HI. Investigações futuras utilizando outras metodologias permitirão uma melhor avaliação dos resultados aqui descritos. / Introduction: Obstructive sleep apnea (OSA) causes intermittent hypoxia (IH), leading to cardiovascular and neurological diseases. The animal experimental studies use IH to simulate OSA, enabling the analysis of brain alterations, with the hippocampus recognized as an area influenced by hypoxia. S100B is a 21-kDa protein bonded to calcium, produced and secreted primarily by astrocytes in the neutrophil of the central nervous system. Levels of the protein have been used to understand the involvement of different cell types in certain pathological conditions. The present study aimed to test the hypothesis that IH used in an experimental design investigating OSA in mice can alter the number of astrocytes in different hippocampal sublayers (CA1, CA3 and dentate gyrus), in addition to quantitatively modifying the immunohistochemical reactivity of these cells. Materials and Methods: CF-1 mice were exposed to 35 days of either IH (n = 27) or SIH (n = 27), alternating 30 seconds of progressive hypoxia with a nadir of 7%, followed by 30 seconds of normoxia. Over a period of 8 hours, the animals were submitted to a total of 48 hypoxia/reoxygenation cycles, equivalent to an apnea index of 60/hour. The brain was dissected and the hippocampus and its sublayers were histologically analyzed by immunohistochemistry using S100B antibodies. Results: A quantitative analysis was performed of hippocampal astrocytes immunoreactive to S100B. The means recorded were 23.85 ± 0.37 astrocytes/0.25 mm2 and 21.03 ± 0.50 astrocytes/0.25 mm2 (p < 0.001) in the IH and SIH (simulated intermittent hypoxia) groups, respectively. This difference was also observed in sublayers CA1 and CA3 overall, and was less noticeable in the dentate gyrus. Astrocyte immunoreactivity was greater (+++) in the IH group and did not achieve this intensity in the SIH group. Secondary qualitative analysis revealed the presence of karyorrhexis, pyknotic neurons, and discretely hypertrophic astrocytes only in animals from the IH group. Conclusion: IH increased the number density of hippocampal astrocytes, as well as their immunoreactivity to S100B, in a process known as reactive astrogliosis. Secondary neuron alterations were also observed in the IH group. Future investigations using alternative methodologies would allow a better assessment of the results described here.

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

Embora a inflamação seja um processo de defesa fisiológica, neuroinflamação desequilibrada tem sido associada com a fisiopatologia de doenças do SNC. Além disso, a exposição pré-natal à infecção bacteriana e/ou viral tem sido implicada em vários estudos como um importante fator ambiental capaz de afetar prejudicialmente o neurodesenvolvimento, aumentando assim o risco de esquizofrenia. Resposta imune materna, em vez de infecção direta do feto, poderia ser responsável pelo desenvolvimento da doença. Glia ativada libera uma variedade de citocinas pró-inflamatórias que contribuem para a disfunção neuronal. Além disso, as alterações de marcadores astrogliais parecem estar intimamente relacionadas à patologia da esquizofrenia, por exemplo, níveis elevados de S100B, uma proteína derivada da glia, foram observados no soro e LCR de pacientes com esquizofrenia. Nesta tese avaliou-se se a secreção de S100B (em células de glioma C6 e fatias de hipocampo de ratos Wistar) poderia ser diretamente modulada por citocinas inflamatórias alteradas na esquizofrenia, assim como o possível envolvimento da via da proteína cinase ativada por mítógeno (MAPK) nestas respostas. Os efeitos dos antipsicóticos típicos e atípicos na secreção de S100B induzida por citocinas foram analisadas. Nós também avaliamos se a administração de LPS em ratas prenhas no final da gestação afeta alguns aspectos comportamentais da prole em sua vida adulta, e investigamos os efeitos deste tratamento sobre parâmetros gliais usando preparação ex vivo dos descendentes, além de observar se o tratamento pré-natal afeta marcadores gliais (S100B e GFAP) da prole adulta. Usamos a prole aos 30 e 60 dias para avaliar as diferenças entre os ratos jovens e adultos e também investigar a existência de diferenças entre os descendentes do sexo masculino e feminino. Avaliamos também os parâmetros de estresse oxidativo NO e GSH. Nós observamos que secreção de S100B foi aumentada pelas citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF-, IL-6 e IL-8) em glioma C6 e em fatias hipocampais através da via MAPK, e estresse oxidativo pode ser um componente desta modulação. Além disso, IL-6 foi capaz de induzir um aumento no conteúdo de S100B e GFAP em glioma C6 e os antipsicóticos, haloperidol e risperidona, foram capazes de inibir a secreção de S100B estimulada por IL-6. Observamos também que o modelo de alteração imune maternal provocou alterações comportamentais na prole adulta, especialmente no comportamento social dos ratos afetados, além de modificar o padrão de secreção da proteína S100B e da captação de glutamato em fatias ex vivo da prole adulta. Constatamos que conteúdo de glutationa e NO são modificados de forma dependente de idade/gênero. Foi observada também uma pronunciada astrogliose particularmente hipocampal, com GFAP apresentando-se aumentada em ratos juvenis e adultos enquanto que conteúdo de S100B apresentou diminuição na prole juvenil e aumento em ratos adultos em resposta a exposição imune maternal. Aparentemente, infecção pré-natal parece levar a anormalidades comportamentais e neuroquímicas, incluindo modificação de marcadores gliais, na vida pós-natal, possivelmente via citocinas. / Although inflammation may be a physiological defense process, imbalanced neuroinflammation has been associated with the pathophysiology of brain disorders. Furthermore, prenatal exposure to bacterial and viral infection has been implicated by several studies indicating that such exposure is an important environmental factor out that may detrimentally affect neurodevelopment, increasing the risk of schizophrenia. Maternal immune response, rather than direct infection of the fetus, could be responsible for disease development. Activated glia releases a variety of pro-inflammatory cytokines that contribute to neuronal dysfunction. Moreover, changes in astrogliais markers seem to be closely related pathology of schizophrenia, for example, elevated levels of S100B, a glia derived protein, have been observed in the serum and CSF of schizophrenic patients. We evaluated whether S100B secretion (in C6 glioma cells and hippocampal slices in Wistar rats) could be directly modulated by the main inflammatory cytokines altered in schizophrenia, as well as the possible involvement of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in these responses. The effects of typical and atypical antipsychotic drugs on glial cytokine-induced S100B release were analyzing. We also evaluated whether administration of LPS to rats dams in late gestation affects some aspects of the offspring behavior in their adult life, and investigated the effects of this treatment on glial parameters using ex vivo preparation of offsprings, and whether it affects astroglial markers (S100B and GFAP) of the offspring in later life. We used the offspring at 30 and 60 days to evaluate the differences between juvenile and adult rats and also investigate the existence of differences between male and female offspring. We also investigated the oxidative stress parameters NO and GSH. We observed that S100B secretion was increased by the pro-inflammatory cytokines (IL-1 , TNF-, IL-6 and IL-8) in C6 glioma and in hippocampal slices via the MAPK, and oxidative stress may be a component this modulation. Furthermore, IL-6 was capable of inducing an increase in content GFAP and S100B in C6 glioma and antipsychotic, haloperidol and risperidone have been capable of inhibiting S100B secretion stimulated by IL-6. We also note that the model of maternal immune changes caused behavioral changes in the adult offspring, especially in the social behavior of rat affected and modified the pattern of secretion of S100B protein and glutamate uptake in ex vivo slices of adult offspring. We found that content of glutathione and NO are modified so age / gender dependent. There was also a pronounced hippocampal astrogliosis, with GFAP presenting increased in juvenile and adult rats while S100B content was reduced in juvenile and increased in adult offspring rats in response to exposure to maternal immune. Apparently, prenatal infection appears to lead to behavioral and neurochemical abnormalities, including modification of glial markers in the postnatal life, possibly via cytokines.

A fenilcetonúria é um dos mais comuns erros inatos do metabolismo, caracterizada por uma deficiência ou uma menor atividade da enzima fenilalanina hidroxilase, responsável pela hidroxilação irreversível da fenilalanina em tirosina. Essa deficiência enzimática leva a um quadro de hiperfenilalanina, característico desta doença, ocasionando o acúmulo de fenilalanina em diferentes tecidos corporais. Quando não diagnosticada precocemente, a criança com fenilcetonúria apresenta um quadro clínico caracterizado por microcefalia, retardo mental grave e epilepsia. Estudos em culturas de células neuronais observaram que a fenilalanina causa alterações na transmissão sináptica glutamatérgica, o que foi relacionado com as alterações cerebrais características de pacientes fenilcetonúricos não tratados. Entretanto, nenhum estudo em modelo in vivo foi realizado para elucidar a participação dos astrócitos, o principal tipo celular responsável pela remoção do glutamato da fenda sináptica, nesse processo de toxicidade. Outros fatores observados na doença são um aumento sérico de S100B em pacientes, bem como um aumento de GFAP, observado em cerebelo de camundongos hiperfenilalaninêmicos. O treinamento físico impediu o aumento do estresse oxidativo em modelo animal de hiperfenilalaninemia, além de impedir a diminuição da concentração de triptofano cerebral causada pela indução do modelo. Considerando os efeitos da fenilcetonúria no sistema nervoso central e a falta de estudos sobre o papel dos astrócitos nessa doença, bem como o possível potencial terapêutico do treinamento físico, o objetivo deste estudo foi avaliar as funções astrocitárias, incluindo o metabolismo glutamatérgico e proteínas específicas como a S100B e a GFAP, em um modelo de hiperfenilalaninemia induzido em ratos jovens e a influência do treinamento físico nestes e em animais saudáveis. Foi observada uma diminuição na captação de glutamato com consequente aumento na concentração de glutamato no líquor dos animais submetidos ao modelo de hiperfenialaninemia, sugerindo um quadro de excitotoxicidade. Também foi observada uma redução da concentração de S100B no tecido cerebral e aumento da concentração dessa proteína no líquor. O treinamento físico, realizado em paralelo com a indução do modelo foi capaz de impedir todas essas alterações, exceto pelo aumento de S100B no líquor. Além disso, nos animais controle, o treinamento físico também teve efeitos no sistema nervoso central, aumentando o conteúdo intracelular de S100B e GFAP. Juntos, esses dados sugerem que os astrócitos estão envolvidos na fisiopatologia da fenilcetonúria e que o treinamento físico pode ser uma estratégia terapêutica adjuvante para essa doença, uma vez que, apesar de não ter normalizado a concentração sérica de fenilalanina, foi capaz de exercer um papel protetor no sistema nervoso central. Outro achado relevante foi o efeito do exercício físico no sistema nervoso central dos animais jovens, sugerindo um aumento do trofismo astrocitário, que pode ser de extrema importância para o desenvolvimento cerebral. / Phenylketonuria is one of the most common inborn errors of metabolism characterized by a deficiency or reduced activity of the enzyme phenylalanine hydroxylase, responsible for irreversible hydroxylation of phenylalanine to tyrosine. This enzyme deficiency leads to hyperphenylalaninemia, characteristic of this pathology, causing an increase in the phenylalanine concentration in different tissues. If not detected early, children with phenylketonuria have a clinical condition characterized by microcephaly, severe mental retardation and epilepsy. Studies in neuronal cell cultures observed that phenylalanine causes changes in glutamatergic synaptic transmission, which has been linked to brain changes characteristics of untreated patients. However, there is a lack of information about the involvement of astrocytes, the primary cell type responsible for the removal of glutamate from the synaptic cleft, in the process of toxicity in animal model. It has been observed an increase in serum S100B in patients, and an increase in GFAP measured in cerebellum of hyperphenylalaninemic mice. The physical training prevented the oxidative stress in an animal model of hyperphenylalaninemia, and the decrease in the concentration of brain tryptophan caused by the induction of the model. Considering the effects of phenylketonuria in the central nervous system and the lack of studies on the role of astrocytes in this pathology as well as the possible therapeutic potential of physical training, the objective of this study was to evaluate the astrocytic functions, including glutamatergic metabolism and specific proteins as S100B and GFAP, in a hyperphenylalaninemic model induced in young rats and the influence of exercise training in hyperphenylalaninemic and healthy animals. We observed a decreased glutamate uptake with a consequent increase in glutamate concentration in cerebrospinal fluid in animals subjected to hyperphenylalaninemic model, suggesting a excitotoxicity mechanism. Besides, hyperphenylalaninemic rats showed a reduction of S100B concentration in brain tissue and an increase in the concentration of this protein in cerebrospinal fluid. Physical training, held in parallel with the induction of the model was able to prevent all these changes, except for the increased S100B in cerebrospinal fluid. Moreover, in control animals, physical training also had effects on the central nervous system, increasing the intracellular content of S100B and GFAP. Together, these data suggest that astrocytes are involved in the pathophysiology of phenylketonuria and exercise training may be considered a complementary therapeutic strategy since it was able to exert a protective role in the central nervous system, even than it was not able to normalize serum phenylalanine concentration. Another important finding was the effect of exercise on central nervous system of young animals, suggesting an increase in astrocytic tropism, which can be extremely important for brain development.

Mutação na proteína <font face = \"symbol\">b-glucuronidase Klotho tem sido associada com envelhecimento prematuro e disfunção cognitiva. Embora altamente expressa em regiões específicas do encéfalo, as funções da proteína Klotho no sistema nervoso central ainda são desconhecidas. Aqui, mostramos que animais com gene mutado e hipomórfico para a proteína Klotho possuem regulação glicêmica alterada, sugerindo maior sensibilidade à insulina. No sistema nervoso central, vias relacionadas à sinalização intracelular de insulina apresentam-se mais ativadas no hipocampo, com maior ativação de AKT e mTOR e inativação dos fatores de transcrição FOXO. Neurônios hipocampais em cultura parecem responder à estimulação por insulina e glutamato aumentando os níveis de Klotho. De forma coerente, antagonismo de receptor AMPA ou NMDA suprime a expressão neuronal de Klotho. Também mostramos aqui que a forma solúvel da Klotho é capaz de induzir a glicólise aeróbica de astrócitos impedindo a metabolização do piruvato pela mitocôndria, e estimulando seu processamento pela lactato desidrogenase. Inibição farmacológica de FGFR1, fosforilação da ERK e de transportadores de ácidos monocarboxílicos previne a liberação de lactato induzida por Klotho em astrócitos. Inibição da AKT pelo tratamento com Klotho induz a atividade transcricional dos fatores de transcrição FOXO e promove proteção antioxidante em astrócitos pelo aumento de expressão de catalase. De forma similar, tratamento com a Klotho apresentou propriedades antiinflamatórias em astrócitos, impedindo ativação do fator de transcrição NF-<font face = \"symbol\">kB após estímulo com LPS. Em neurônios, tratamento com a proteína Klotho induz ubiquitiniação e degradação proteassomal de PFKFB3. Por fim, provamos que a quantidade de Klotho diminui em hipocampo de animais envelhecidos. Genes e proteínas relacionados ao metabolismo energético e ao acoplamento metabólico de neurônios e astrócitos tem padrão de expressão alterados no hipocampo com o envelhecimento, mostrando que essa pode ser uma característica importante para explicar o declínio cognitivo comum ao processo de envelhecimento. Em conjunto, esses dados sugerem que a Klotho pode ser um novo participante do acoplamento metabólico entre neurônios e astrócitos. / Mutations in the <font face = \"symbol\">b-glucuronidase protein Klotho have been associated with premature aging and cognitive dysfunction. Although highly expressed in specific regions of the brain, Klotho actions in the central nervous system are still largely unknown. Here we show that animals with a mutated hypomorphic Klotho gene have altered glycemia regulation, suggestive of a higher insulin sensitivity. In the central nervous system, pathways related to insulin intracellular signaling were shown to be up-regulated in the hippocampus, with higher AKT and mTOR activation, and inactivation of transcription factor FOXO. Here, we show that cultured hippocampal neurons respond to insulin and glutamate stimulation by elevating Klotho protein levels. Conversely, APA and NMDA antagonism suppress neuronal Klotho expression. We also provide evidence that soluble Klotho enhances astrocytic aerobic glycolysis by hindering pyruvate metabolism through the mitochondria, and stimulating its processing by lactate dehydrogenase. Pharmacological inhibition of FGFR1, ERK phosphorylation, and monocarboxylic acid transporters prevents Klotho-induced lactate release from astrocytes. AKT inhibition by Klotho treatment induces transcriptional activity of FOXO transcription factors and promote antioxidant defense in astrocytes by inducing catalase expression. Similarly, Klotho treatment has anti-inflammatory properties, as shown by its ability to hinder NF-<font face = \"symbol\">kB activation in astrocytes after LPS stimulation. In neurons, Klotho treatment induces PFKFB3 ubiquitination and degradation through the proteasome. Lastly, in the hippocampus, we show that Klotho is less present in hippocampi of aged mice. Genes and proteins related to energy metabolism and metabolic coupling between neurons and astrocytes show an altered expression pattern with aging, suggesting that this could be a crucial characteristic that explains cognitive decline commonly seen during the aging process. Taken together these data suggest Klotho as a potential new player in the metabolic coupling between neurons and astrocytes.

A amônia é uma neurotoxina implicada em desordens metabólicas cerebrais associadas com hiperamonemia. A neurotoxicidade aguda da amônia pode ser mediada por mecanismos excitotóxicos envolvendo o sistema glutamatérgico, incluindo a ativação do receptor NMDA e o subsequente aumento na concentração de Ca2+. O estresse oxidativo está relacionado à neurotoxicidade da amônia e o óxido nítrico parece estar envolvido nesta condição. Os astrócitos desempenham um papel essencial na proteção dos neurônios contra excitotoxicidade por captar o excesso de amônia e glutamato e convertê-los em glutamina, usando a enzima glutamina sintetase, e também protegendo contra o estresse oxidativo. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como parâmetro de ativação ou comprometimento em várias situações de dano cerebral, incluindo hiperamonemia. Antioxidantes, como o resveratrol, apresentam muitos efeitos biológicos, incluindo a modulação de parâmetros gliais como a captação de glutamato, a atividade da glutamina sintetase e a secreção de S100B. Neste estudo, foi investigado o efeito de antioxidantes sobre a secreção de S100B induzida pela amônia em células astrogliais. O resveratrol foi capaz de prevenir o aiumento da secreção de S100B, após 24 h de exposição à amônia, provavelmente via inibição de óxido nítrico e proteína cinase A (PKA). Então, o resveratrol pode ser um possível agente protetor contra a neurotoxicidade induzida pela amônia. / Ammonia is a neurotoxin implicated in brain metabolic disorders associated with hyperammonemia. Acute ammonia neurotoxicity can be mediated by excitotoxic mechanism involving glutamatergic system, including NMDA receptor activation and subsequent increase in intracellular Ca2+ concentration. Oxidative stress is related to ammonia neurotoxicity and nitric oxide can be involved in this condition. Astrocytes play an essential role in protecting neurons against excitotoxicity uptake excess ammonia and glutamate and converting it into glutamine, using enzyme glutamine synthetase and also protected against oxidative stress. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury, including hyperammonemia. Antioxidants, such as resveratrol, showed many biological effects, including modulation of glial parameters as glutamate uptake, glutamine synthetase activity and S100B secretion. In this study, we investigated the effect of antioxidants on S100B secretion induced by ammonia in astroglial cells. Resveratrol was able to prevent the increase of S100B secretion, after 24 h ammonia exposure, probably via nitric oxide and protein kinase A (PKA) inhibition. Then, resveratrol may be a possible protective agent against neurotoxicity induced by ammonia.

A ingestão de ácidos graxos na forma de gordura proveniente da dieta tem aumentado nos últimos anos, principalmente na forma de gordura saturada. Tem sido observado que ácidos graxos saturados podem causar a liberação de citocinas em diversos tecidos e células. Além disso, em indivíduos obesos, tem se observado que há uma inflamação crônica e de baixo grau, que poderia ter entre seus causadores os ácidos graxos provenientes da dieta. Já os ácidos graxos poli-insaturados têm sido citados como sendo neuroprotetores devido a suas propriedades anti-inflamatórias e anti-apoptóticas. A barreira hematoencefálica (BHE) é um dos principais fatores que regulam a captação dos ácidos graxos no sistema nervoso central (SNC). A captação de ácidos graxos pelo cérebro é seletiva, priorizando a entrada de ácidos graxos poli-insaturados e suprimindo a entrada de ácidos graxos saturados. Além disso, a quantidade relativa de ácidos graxos no sangue pode afetar o grau de penetração desses no SNC. Existem diversas condições onde há aumento na permeabilidade da BHE e, nessas situações, o SNC pode ficar mais exposto a substâncias que normalmente não estão presentes ou estão em baixas concentrações, como os ácidos graxos saturados de cadeia longa. Dessa forma, é importante que se analise os efeitos dessas substâncias em células cerebrais. Os astrócitos são células presentes no SNC caracterizadas por expressarem e secretarem a proteína S100B e por expressarem a proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Os astrócitos captam glutamato e o metaboliza através da enzima glutamina sintetase (GS), formando glutamina, um processo importante para evitar o acúmulo de glutamato e excitotoxicidade. Essas células são muito resistentes ao estresse oxidativo devido ao seu alto conteúdo de glutationa reduzida (GSH). Em condições patológicas, os astrócitos liberam o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e a produção dessa citocina é um importante componente da resposta neuroinflamatória que está associada com muitas desordens neurológicas. Os astrócitos possuem o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE), que tem entre seus ligantes a S100B e sua ativação está envolvida na resposta inflamatória imediata. O receptor tipo toll 4 (TLR4) também está presente nessas células e ligado à resposta inflamatória. A ciclooxigenase 2 (COX-2) é uma enzima associada à inflamação e sua indução é responsável por desencadear muitas citocinas e mediadores inflamatórios presentes em diversos tipos celulares. Utilizando cultura primária de astrócitos de ratos Wistar, nós investigamos a ação dos ácidos graxos saturados e insaturados sobre parâmetros função de astrocitária, oxidativos e inflamatórios. Nosso estudo não encontrou alterações na viabilidade e integridade celular. Observamos um aumento dose-dependente na secreção de S100B nos astrócitos incubados apenas com o ácido palmítico. Não encontramos alterações para nenhum ácido graxo no conteúdo de GFAP, GSH ou captação de glutamato. Para o ácido linoleico observamos um aumento na atividade da GS e na oxidação do DCF. A secreção de TNF-α aumentou para os ácidos graxos saturados e não se alterou para os poli-insaturados. O conteúdo de COX-2, TLR4 e RAGE não foi alterado. Nossos resultados reforçam os dados de que ácidos graxos saturados, e não os insaturados, causam aumento na liberação de citocinas e podem contribuir para o processo neuroinflamatório encontrado em condições de aumento na permeabilidade da BHE. Além disso, verificamos que nem toda inflamação desencadeia aumento na secreção de S100B, visto que só tivemos esse comportamento para o ácido palmítico. Nossos resultados também reforçam o potencial terapêutico do ácido linoleico, que poderia desencadear adaptações nos astrócitos com possíveis benefícios para pacientes acometidos por patologias que envolvam a excitotoxicidade glutamatérgica. / The intake of fatty acids in the form of fat from the diet has increased in recent years, especially in the form of saturated fat. It has been observed that saturated fatty acids can cause the release of cytokines in various tissues and cells. Furthermore, in obese individuals, it has been observed a chronic and low-grade inflammation, which could have among their causers the diet fatty acids. Polyunsaturated fatty acids have been considered neuroprotective because of their antiinflammatory and antiapoptotic properties. The blood-brain barrier (BBB) is one of the major factors regulating the uptake of fatty acids in the central nervous system (CNS). The brain uptake of fatty acids is selective, prioritizing the entry of polyunsaturated fatty acids and suppressing the entry of saturated fatty acids. In addition, the relative amount of fatty acids in the blood can affect the degree of penetration of these into the CNS. There are several conditions where there is an increase in BBB permeability and in these situations the CNS may be more exposed to substances that are not normally present or are in low concentrations, such as saturated long chain fatty acids. Thus, it is important to analyze the effects of these substances in brain cells. Astrocytes are cells present in the CNS characterized by expressing and secreting the S100B protein and by expressing the glial fibrillary acidic protein (GFAP). Astrocytes uptake glutamate and metabolize it through the glutamine synthetase (GS) enzyme, forming glutamine, an important process to avoid the accumulation of glutamate and excitotoxicity. These cells are very resistant to oxidative stress because of their high reduced glutathione content (GSH). In pathological conditions, astrocytes release tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and the production of this cytokine is an important component of the neuroinflammatory response that is associated with many neurological disorders. Astrocytes have the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE), which has among its ligands S100B and its activation is involved in the immediate inflammatory response. The tolllike receptor 4 (TLR4) is another receptor present in these cells, which is also linked to the inflammatory response. The cycloxygenase-2 (COX-2) is an enzyme associated with inflammation and its induction is responsible for triggering many cytokines and inflammatory mediators in many cell types. Using astrocyte primary cultures from Wistar rats, we investigated the effect of saturated and unsaturated fatty acids on astrocytic function and oxidative and inflammatory parameters. Our study found no changes in cell viability and integrity. We observed a dose-dependent increase in S100B secretion in astrocytes incubated only with palmitic acid. We did not find alterations from fatty acids in the content of GFAP and GSH as well as uptake of glutamate. For linoleic acid, we observed an increase in GS activity and in DCF oxidation. TNF-α secretion increased to the saturated fatty acids and did not change for polyunsaturated. The contents of COX-2, TLR4 and RAGE did not change. Our results reinforce the data that saturated fatty acids, and not unsaturated, cause an increase in the release of cytokines and may contribute to the neuroinflammatory process found under conditions of increase in BBB permeability. In addition, we found that inflammation not always triggers an increase in S100B secretion, since we only had this behavior for palmitic acid. Our results also reinforce the therapeutic potential of linoleic acid, which could trigger adaptations in astrocytes with possible benefits for patients affected by pathologies involving glutamatergic excitotoxicity.