As plantas tóxicas continuam entre as principais causas de morte em bovinos no Brasil. Elas apresentam efeito relativamente específico sobre os tecidos e/ou sistemas. Várias plantas tóxicas do Brasil causam dano hepático, de forma aguda ou crônica, muitas vezes acompanhado de encefalopatia hepática, cuja patogenia ainda não havia sido elucidada nos casos de hepatopatia tóxica aguda em bovinos. O presente estudo teve como objetivo caracterizar microscopicamente as alterações encefálicas relacionadas a hepatopatias tóxicas em bovinos e resultou em três artigos. O primeiro deles descreve alterações encefálicas histológicas em bovinos com intoxicação espontânea por Cestrum intermedium e suas características na avaliação imuno-histoquímica (IHQ), com emprego dos anticorpos anti-proteína S100 e anti-proteína glial fibrilar ácida. No segundo artigo são caracterizadas as alterações encefálicas de 22 bovinos intoxicados natural ou experimentalmente por cinco espécies de planta de ação hepatotóxica aguda ou pela ingestão de P. flavipes, com avaliação de telencéfalo, tronco encefálico e cerebelo pelas técnicas de hematoxilina e eosina (HE), histoquímicas de ácido periódico de Shiff (PAS) e lectinas e pelas provas de IHQ usando os anticorpos anti-S100, anti-GFAP e anti-vimentina. Neste artigo são evidenciadas alterações relevantes em astrócitos, tanto da substância branca quanto da cinzenta e se demonstra serem os mesmos o principal alvo de lesão na hepatopatia tóxica aguda em bovinos, evidenciado pela IHQ. As técnicas histoquímicas citadas não apresentaram resultados promissores, por isso não são apresentadas no Artigo 2. No terceiro artigo é realizada avaliação comparativa de encéfalos de bovinos intoxicados por Senecio sp. com uso das mesmas técnicas e que demonstrou não haver alterações significativas em astrócitos e estruturas vasculares encefálicas, reiterando a patogenia anteriormente proposta, de que a degeneração esponjosa, alteração histológica encefálica amplamente descrita nessa intoxicação, é caracterizada por edema intramielínico. / Toxic plants remain among the major causes of death in cattle in Brazil. They have relatively specific effects on animal tissues or systems. Several Brazilian poisonous plants cause acute or chronic liver damage, often accompanied by hepatic encephalopathy, the pathogenesis of which was not yet elucidated in cases of acute toxic liver disease in cattle. This study resulted in three articles. The first describes histological findings in brains of cattle poisoned by Cestrum intermedium and their immunohistochemical characteristics using the anti-protein S100 and anti-glial fibrillary acidic protein markers. The second article characterizes changes in the brain from 22 cattle natural or experimentally poisoned by five plant species with acute hepatotoxic effects or by the ingestion of P. flavipes larvae. Hematoxylin and eosin stained slides of cerebrum, brainstem and cerebellum were evaluated, as well histochemical preparations stained with periodic acid Schiff or lectins and immunohistochemical evaluation employing anti-S100, anti-GFAP and anti-vimentin markers. These histochemical techniques did not show promising results, so these are not shown in the second article. Relevant changes were observed in astrocytes from white and gray matter, presenting these cells as the main target of injury in acute toxic liver disease in cattle. The third paper presents a comparative evaluation of the brains of ten cattle poisoned by Senecio sp. using the same techniques. There were no significant changes in astrocytes and brain vascular structures, backing up the pathogenesis previously proposed; that the histological brain changes identified as spongy degeneration, largely described in this poisoning, are characterized by intramyelinic edema.

Apesar de representarem cerca de 50% de todas as células do encéfalo humano, as células da glia foram negligenciadas pela Doutrina do Neurônio, no início do século XX, por não serem excitáveis e por não se comunicarem como os neurônios. Durante um longo período, os estudos sobre os astrócitos se restringiam a suas funções de suporte do SNC. Atualmente se sabe que os astrócitos expressam receptores para uma variedade de neurotransmissores, como por exemplo, receptores colinérgicos nicotínicos, sugerindo possíveis mecanismos de resposta aos sinais enviados pela atividade neuronal, de modo variável e dinâmico, espontaneamente ou dependente da atividade neuronal e ativado pela alteração dos níveis intracelulares de Ca2+. Entretanto, os mecanismos específicos que explicam como essas células podem ser ativadas e qual sua contribuição para funcionamento do SNC ainda não estão totalmente esclarecidos. A secreção da proteína trófica S100B pelo astrócito pode ser um exemplo de comunicação celular, bem como também marcador biológico para diversas doenças. O nosso grupo já mostrou o envolvimento de diversos sistemas neuronais na modulação da secreção da proteína S100B. Um outro exemplo de comunicação é a liberação de gliotransmissores e a influência aguda astrocítica na transmissão sináptica. O objetivo dessa tese foi investigar se ativação do sistema colinérgico modula a secreção da proteína S100B em culturas primárias de astrócitos. Ainda, investigamos o uso da optogenética para o estudo da gliotransmissão em fatias de hipocampo. As culturas foram tratadas com inibidores da acetilcolinesterase (huperzina-A e tacrina), agonistas (acetiltiocolina, nicotina e carbacol) e antagonistas (mecamilamina e escopolamina) colinérgicos incubados durante 1 e 24 h. Os estudos em optogenética partiram primeiramente da caracterização do sistema cre/lox através da análise da expressão das proteínas de interesse, seletiva para astrócitos, por imunohistoquímica. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a huperzina-A aumentou a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos, assim como o tratamento com nicotina; no segundo, discutiu-se as limitações metodológicas quanto a especificidade das proteínas e alteração da fisiologia dos astrócitos. Os resultados obtidos nessa tese ressaltam para a importância do conhecimento da fisiologia do astrócito, contribuindo para o entendimento de um possível mecanismo de ativação colinérgico dos astrócitos em promover secreção de S100B. Também é preciso ressaltar a relevância de novas metodologias que ajudam a descrever melhor o papel dos astrócitos na atividade sináptica. / Although about half of the brain cells are glial cells, the Neuron Doctrine has neglected them, at the beginning of 20th century, because they were not excitable and also, they were unable to communicate as neurons. For a long time, the studies about astrocytes functions were limited to trophic and metabolic support to neurons by which providing for the homeostasis of the nervous system. A variety of studies have been shown the expression of different neurotransmitters receptors in astrocytes, for instance, nicotinic receptors, suggesting the possibility of astrocytic response to neuronal activity. This response is variable and dynamic and mostly can be activated by changes at the intracellular calcium levels. However, the specific mechanisms of astrocytic Ca2+ excitability and how this process could contribute to CNS functioning are still unclear. The S100B secretion could be an example of cellular communication, as well as biomarker for diverse diseases. S100B is calcium binding protein, produced and secreted mainly by astrocytes. Our group has already demonstrated the relevance of various neuronal systems mediating the S100B secretion. Another astrocytic form of communication could be the release of gliotransmitters and the acute influence at synaptic transmission. The aim of this thesis was to investigate whether cholinergic system activation could modulate S100B secretion in primary astrocytes cultures. Moreover, we investigated the optogenetic properties as a tool for gliotransmission studies in hippocampal slices. The astrocytes cultures were treated with acetylcolinesterase inhibitors (huperzine-A and tacrine), agonists (acetylthiocholine, nicotine and carbachol) and antagonists (mecamylamine and scopolamine) for 1 and 24h. The optogenetic studies were conducted, firstly, from the cre/lox characterization of protein expression, selectively for astrocytes, by immunohistochemistry. The first study results showed that huperzine-A increased S100B secretion, as well as nicotine; in the second study, we have discussed the main methodological limitations concerning the protein specificity and astrocytes physiology changes. These results raise the importance of astrocytes functions investigations, especially S100B secretion, contributing for the first time to the understanding of astrocytes excitability likely trough nicotinic system activation. In addition, it is worthy to note that new methodologies are relevant and can help us in a better description of astrocytes role during synaptic activity and brain functioning.

A Doença de Alzheimer é uma desordem que acomete milhões de indivíduos por todo o mundo, e a sua incidência tem aumentado muito nas últimas décadas. A doença é caracterizada por diversas alterações no sistema nervoso central, e dentre elas ocorrem alterações importantes no metabolismo da glicose, com redução da utilização desse composto, levando a um importante déficit energético. A Doença de Alzheimer está intimamente relacionada com o Diabetes Mellitus, pois além de ocorrerem alterações semelhantes nas duas desordens, pacientes com diabetes têm risco aumentado de desenvolver Alzheimer. Além da correlação com Diabetes Mellitus, existem evidências de que a hipercolesterolemia também está associada ao maior risco de desenvolver Doença de Alzheimer, o que nos levou a investigar o potencial neuroprotetor das estatinas. Esse trabalho tem como objetivo avaliar alterações comportamentais e bioquímicas em dois modelos de desordens do metabolismo da glicose, bem como avaliar o possível papel neuroprotetor das estatinas, aminoguanidina e n-acetil-cisteína. / Alzheimer’s disease is a disorder that affects millions of individuals around the world, and its incidence has increased in recent decades. Alzheimer’s disease is characterized by several alterations in the central nervous system, and changes in glucose metabolism is among the most important, reducing the uptake of this compound, leading to a significant energy deficit. Alzheimer’s disease is closely related to Diabetes Mellitus, and similar metabolic changes occur in both disorders. Besides, diabetic patients present increased risk for Alzheimer’s disease. In addition, another risk factor to Alzheimer’s is high levels of plasma cholesterol, which lead some research groups to evaluate the potential neuroprotective effect of statins. The aim of this study is to asses behavioral and biochemical changes in two models of glucose metabolism disorders, and evaluate the possible neuroprotective role of statins, aminoguanidine and N-acetyl-cysteine

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

Embora a inflamação seja um processo de defesa fisiológica, neuroinflamação desequilibrada tem sido associada com a fisiopatologia de doenças do SNC. Além disso, a exposição pré-natal à infecção bacteriana e/ou viral tem sido implicada em vários estudos como um importante fator ambiental capaz de afetar prejudicialmente o neurodesenvolvimento, aumentando assim o risco de esquizofrenia. Resposta imune materna, em vez de infecção direta do feto, poderia ser responsável pelo desenvolvimento da doença. Glia ativada libera uma variedade de citocinas pró-inflamatórias que contribuem para a disfunção neuronal. Além disso, as alterações de marcadores astrogliais parecem estar intimamente relacionadas à patologia da esquizofrenia, por exemplo, níveis elevados de S100B, uma proteína derivada da glia, foram observados no soro e LCR de pacientes com esquizofrenia. Nesta tese avaliou-se se a secreção de S100B (em células de glioma C6 e fatias de hipocampo de ratos Wistar) poderia ser diretamente modulada por citocinas inflamatórias alteradas na esquizofrenia, assim como o possível envolvimento da via da proteína cinase ativada por mítógeno (MAPK) nestas respostas. Os efeitos dos antipsicóticos típicos e atípicos na secreção de S100B induzida por citocinas foram analisadas. Nós também avaliamos se a administração de LPS em ratas prenhas no final da gestação afeta alguns aspectos comportamentais da prole em sua vida adulta, e investigamos os efeitos deste tratamento sobre parâmetros gliais usando preparação ex vivo dos descendentes, além de observar se o tratamento pré-natal afeta marcadores gliais (S100B e GFAP) da prole adulta. Usamos a prole aos 30 e 60 dias para avaliar as diferenças entre os ratos jovens e adultos e também investigar a existência de diferenças entre os descendentes do sexo masculino e feminino. Avaliamos também os parâmetros de estresse oxidativo NO e GSH. Nós observamos que secreção de S100B foi aumentada pelas citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF-, IL-6 e IL-8) em glioma C6 e em fatias hipocampais através da via MAPK, e estresse oxidativo pode ser um componente desta modulação. Além disso, IL-6 foi capaz de induzir um aumento no conteúdo de S100B e GFAP em glioma C6 e os antipsicóticos, haloperidol e risperidona, foram capazes de inibir a secreção de S100B estimulada por IL-6. Observamos também que o modelo de alteração imune maternal provocou alterações comportamentais na prole adulta, especialmente no comportamento social dos ratos afetados, além de modificar o padrão de secreção da proteína S100B e da captação de glutamato em fatias ex vivo da prole adulta. Constatamos que conteúdo de glutationa e NO são modificados de forma dependente de idade/gênero. Foi observada também uma pronunciada astrogliose particularmente hipocampal, com GFAP apresentando-se aumentada em ratos juvenis e adultos enquanto que conteúdo de S100B apresentou diminuição na prole juvenil e aumento em ratos adultos em resposta a exposição imune maternal. Aparentemente, infecção pré-natal parece levar a anormalidades comportamentais e neuroquímicas, incluindo modificação de marcadores gliais, na vida pós-natal, possivelmente via citocinas. / Although inflammation may be a physiological defense process, imbalanced neuroinflammation has been associated with the pathophysiology of brain disorders. Furthermore, prenatal exposure to bacterial and viral infection has been implicated by several studies indicating that such exposure is an important environmental factor out that may detrimentally affect neurodevelopment, increasing the risk of schizophrenia. Maternal immune response, rather than direct infection of the fetus, could be responsible for disease development. Activated glia releases a variety of pro-inflammatory cytokines that contribute to neuronal dysfunction. Moreover, changes in astrogliais markers seem to be closely related pathology of schizophrenia, for example, elevated levels of S100B, a glia derived protein, have been observed in the serum and CSF of schizophrenic patients. We evaluated whether S100B secretion (in C6 glioma cells and hippocampal slices in Wistar rats) could be directly modulated by the main inflammatory cytokines altered in schizophrenia, as well as the possible involvement of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in these responses. The effects of typical and atypical antipsychotic drugs on glial cytokine-induced S100B release were analyzing. We also evaluated whether administration of LPS to rats dams in late gestation affects some aspects of the offspring behavior in their adult life, and investigated the effects of this treatment on glial parameters using ex vivo preparation of offsprings, and whether it affects astroglial markers (S100B and GFAP) of the offspring in later life. We used the offspring at 30 and 60 days to evaluate the differences between juvenile and adult rats and also investigate the existence of differences between male and female offspring. We also investigated the oxidative stress parameters NO and GSH. We observed that S100B secretion was increased by the pro-inflammatory cytokines (IL-1 , TNF-, IL-6 and IL-8) in C6 glioma and in hippocampal slices via the MAPK, and oxidative stress may be a component this modulation. Furthermore, IL-6 was capable of inducing an increase in content GFAP and S100B in C6 glioma and antipsychotic, haloperidol and risperidone have been capable of inhibiting S100B secretion stimulated by IL-6. We also note that the model of maternal immune changes caused behavioral changes in the adult offspring, especially in the social behavior of rat affected and modified the pattern of secretion of S100B protein and glutamate uptake in ex vivo slices of adult offspring. We found that content of glutathione and NO are modified so age / gender dependent. There was also a pronounced hippocampal astrogliosis, with GFAP presenting increased in juvenile and adult rats while S100B content was reduced in juvenile and increased in adult offspring rats in response to exposure to maternal immune. Apparently, prenatal infection appears to lead to behavioral and neurochemical abnormalities, including modification of glial markers in the postnatal life, possibly via cytokines.

A doença de Alzheimer (DA) resulta de múltiplos eventos patogênicos, que incluem anormalidades no processamento protéico, inflamação e estresse oxidativo, levando à destruição seletiva de populações neuronais, especialmente de neurônios colinérgicos. Tal hipótese colinérgica justifica o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE) como a estratégia utilizada para tratamento de pacientes com DA. Huperzina A (HupA), um alcalóide Licopodium extraído de uma espécie vegetal (Huperzia serrata) de uso tradicional pela medicina chinesa, parece se apresentar como uma alternativa. A HupA atua como um inibidor potente, reversível e altamente específico da AChE. Sua potência como anticolinesterásico é similar ou superior à da fisostigmina, galantamina, donepezil e tacrina, anticolinesterásicos aprovados para o tratamento da DA Este alcalóide também demonstrou múltiplos efeitos neuroprotetores, incluindo modificação do processamento do peptídeo -amilóide, redução do estresse oxidativo, proteção neuronal contra apoptose e regulação da expressão e secreção de fatores tróficos, tais como fator de crescimento neuronal e em situações de injúria com comprometimento de funções glutamatérgicas. A S100B é uma proteína da família S100 de proteínas ligantes de cálcio, produzida e secretada por astrócitos no SNC. Quando em baixas concentrações no meio extracelular (nanomolar), ela é trófica; já em concentrações maiores (micromolar), é tóxica, podendo levar à apoptose. Sabe-se que a S100B está envolvida na patofisiologia de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na DA, no qual ocorre um aumento dos níveis dessa proteína no líquor em sua fase precoce. Neste trabalho investigamos o efeito da HupA, da tacrina (tetraaminoacridina ou THA) e da acetiltiocolina (ATCh) em astrócitos e em fatias hipocampais, quanto à secreção e conteúdo intracelular de S100B e proteína fibrilar glial ácida (GFAP), durante 1 e 24 h. A HupA (100 μM) aumentou a secreção em cultura de astrócitos em 1 h, mas diferentemente causou uma redução em fatias hipocampais, bem como ATCh (100 μM). Após 24 h de tratamento, foi possível observar em cultura de astrócitos um efeito da tacrina a 100 μM sobre a redução do conteúdo de S100B intracelular, mas não de HupA ou ATCh. O imunocontéudo de GFAP não foi alterado após os tratamentos. Uma análise geral desses resultados nos mostra que a HupA pode regular mecanismos de secreção da S100B. Além disto, a modulação de secreção desta proteína parece ser modulada por receptores colinérgicos. / Alzheimer´s Disease (AD) results in multiple pathogenic events, which include abnormalities of protein process, inflammation and oxidative stress, leading to a neuronal population destruction, especially of cholinergic neurons. This cholinergic hypothesis justifies the use of acetylcholinesterase inhibitors (IAChE) as the strategy for patients with AD. Huperzine A (HupA), a novel Lycopodium alkaloid isolated originally from a traditional Chinese medicine, seems to be an alternative. HupA is a reversible, potent and selective IAChE. Its potency and duration of AChE inhibition rival those of physostigmine, galanthamine, donepezil and tacrine, approved for treatment of DA. HupA also demonstrated multiple neuroprotector effects, including modifying the β-amyloid processing, decreasing oxidative stress, protecting neurons against apoptosis and also expressing and regulating secretion of trophic factors, such as neuronal growth factor (NGF) and also acts reducing glutamatergic excitotoxicity. S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS) and plays a regulatory role in the cytoskeleton and cell cycle. Moreover, extracellular S100B, a marker of glial activation in several conditions of brain injury, for example in AD, has a trophic or apoptotic effect on neurons, depending on its concentration. Here we investigated the effect of HupA, tacrina (tetraminoacridine or THA) and acetilthiocholine (ATCh), on S100B secretion, S100B and GFAP intracellular contend in cortical astrocytes cultures and hippocampal slices treated for 1 and 24 h. For 1 h, HupA and ATCh (100 μM) increased the secretion in astrocytes for 1 h, but caused a reduction on hippocampal slices (P < 0.05). After 24 h of treatment, tacrine (100 μM) reduced the S100B intracellular contend in astrocytes cultures, but it was not observed with HupA or ATCh. The GFAP immunocontent did not change after these treatments. Generally, our data show that HupA can regulate S100B secretion mechanisms and that this modulation could be activated by cholinergic receptors.

O hipocampo compõe uma das estruturas do sistema límbico, suas funções são variadas, tendo seu papel na regulação do comportamento emocional e em processos relacionados com a estocagem de memórias. Apesar de ter pouco ou nenhum papel no controle da função reprodutiva, o hipocampo é ainda assim um alvo sensível aos esteróides gonadais. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é um eficiente marcador do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar o numero de células imunorretivas à GFAP (GFAP-ir), avaliar a imunorreatividade dos marcadores para filamentos intermediários astrocitários, bem como sua morfologia pelo método de Scholl, a GFAP-ir, no estrato radiatum da região CA1 do hipocampo, de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: no primeiro foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n = 48), cujas idades foram: 11 dias pós-natal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). No segundo experimento, utilizou-se ratos Wistar adultos machos e fêmeas nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 30) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária do hipocampo. No terceiro experimento utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de uma via, sendo aplicado o teste post-hoc Bonfferoni. A comparação dos dados de GFAP-ir apresentou diferenças significativas no número de células e na orientação dos prolongamentos. O número de prolongamentos centrais, aumentaram com a idade, sendo mais significativo para as fêmeas (F45xF11, p≤ 0,001, F45xF21, p≤ 0,01 e F45xF31 p≤ 0,01) que nos machos (M45x M21 p≤ 0,05). Já o número de processos laterais mostrou um aumento mais significativo com a idade nos machos (M45XM11, p≤ 0,001; M45XM21, p≤ 0,001 e M45xM31, p≤ 0,01) que nas fêmeas (F45xF11, p≤ 0,01). Havendo ainda diferenças quando analisados a orientação dos processos primários separadamente de suas ramificações. Os ratos machos apresentaram maior GFAP-ir do que as fêmeas em todas as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; p < 0,001), assim como apresentaram mais células que as fêmeas (p<0,001). Para orientação mais uma vez as diferenças ficaram restritas aos machos, tanto para os processos centrais como para os laterais (p<0,001 e p<0,05 respectivamente). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol provocaram aumento da GFAP-ir (P < 0,001), assim como houve um aumento do numero de células (P < 0,05) enquanto a morfologia não mostrou diferenças entre os grupos. Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em machos e fêmeas. Esses achados permitem concluir que esta influência hormonal sobre o hipocampo está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades morfológicas acima de tudo. Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas, ao longo do desenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso. / The hippocampus is part of the limbic system, its functions are varied, and their role in the regulation of emotional behavior and in processes related to the memories storage. Despite having little or no role in the control of reproductive function, the hippocampus still a sensitive target to gonadal steroids. Intermediate filaments such as glial fibrillary acidic protein (GFAP) is an efficient marker of the cytoskeleton of astrocytes and the action of gonadal hormones could alter this structure. The objectives of this study were to measure the number of GFAP imunorreactive cells (GFAP-ir), analysing the immunoreactivity the intermediate filaments of astrocyte, and their morphology by the Scholl‟s method, GFAP-ir in the stratum radiatum of the CA1 region from dorsal hippocampus of male and female rats during postnatal development. In addition, we investigated the GFAP-ir in the same regions of adult males and females, these under physiological hormonal changes (during the estrous cycle), as shown by supraphysiological (hormone replacement after ovariectomy). Three experiments were performed: the first was used male and female rats during postnatal development (n = 48), whose ages were 11 days postnatal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) and 45 ( PN45). In the second experiment, we used adult male Wistar rats and nulliparous adult females during the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, n= 30) to reveal differences caused by female gonadal hormones on the content of astrocytes in the hippocampus. In the third experiment, a nulliparous adult females subjected to ovariectomy (OVX) (n = 18) and treated with hormone replacement therapy of estradiol benzoate added or not with progesterone. Data were compared between groups by means of a test analysis of variance (ANOVA) one-way, and applied post-hoc Bonfferoni‟s test. A comparison of the GFAP-ir showed significant differences in cell number and orientation of the extensions. The number of central extensions, increased with age, being more significant for females (F45xF11, p ≤ 0,001, F45xF21, p ≤ 0,01 and F45xF31 p ≤ 0,01) than in males (M45x M21 p ≤ 0,05). Since the number of lateral processes showed more significantly with age in males (M45XM11, p ≤ 0,001; M45XM21, p ≤ 0,001 and M45xM31, p ≤ 0,01) than in females (F45xF11, p ≤ 0,01). We also found differences when analyzed the orientation of primary processes separately from their branches. Male rats showed higher GFAP-ir than females at all stages of the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, p <0,001) and had more cells than females (p <0,001). About cell orientation, the differences were observed just in males, both for the core processes and to the lateral (p <0,001 and p <0,05 respectively). In ovariectomized females, injections of estradiol benzoate caused an increase in GFAP-ir (P <0,001), as well as an increase in the number of cells (p <0,05), but the morphology did not differ between groups. These findings suggest that the GFAP astrocyte can be affected both by physiological levels of ovarian hormones and on the hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to neuro-glial plasticity related to local activities and integrated these brain areas in males and females. These findings show that hormonal influence on the hippocampus were present in early stages of development of the SN of rat, specially in the morphological characteristics. In addition, differences in astrocytic composition found throughout the development, probably were related to the neuron-glia interaction in accordance with aspects of behavioral and neuroendocrine adjustments, specific to each gender, and each stage of differentiation of the nervous system.

Apesar de representarem cerca de 50% de todas as células do encéfalo humano, as células da glia foram negligenciadas pela Doutrina do Neurônio, no início do século XX, por não serem excitáveis e por não se comunicarem como os neurônios. Durante um longo período, os estudos sobre os astrócitos se restringiam a suas funções de suporte do SNC. Atualmente se sabe que os astrócitos expressam receptores para uma variedade de neurotransmissores, como por exemplo, receptores colinérgicos nicotínicos, sugerindo possíveis mecanismos de resposta aos sinais enviados pela atividade neuronal, de modo variável e dinâmico, espontaneamente ou dependente da atividade neuronal e ativado pela alteração dos níveis intracelulares de Ca2+. Entretanto, os mecanismos específicos que explicam como essas células podem ser ativadas e qual sua contribuição para funcionamento do SNC ainda não estão totalmente esclarecidos. A secreção da proteína trófica S100B pelo astrócito pode ser um exemplo de comunicação celular, bem como também marcador biológico para diversas doenças. O nosso grupo já mostrou o envolvimento de diversos sistemas neuronais na modulação da secreção da proteína S100B. Um outro exemplo de comunicação é a liberação de gliotransmissores e a influência aguda astrocítica na transmissão sináptica. O objetivo dessa tese foi investigar se ativação do sistema colinérgico modula a secreção da proteína S100B em culturas primárias de astrócitos. Ainda, investigamos o uso da optogenética para o estudo da gliotransmissão em fatias de hipocampo. As culturas foram tratadas com inibidores da acetilcolinesterase (huperzina-A e tacrina), agonistas (acetiltiocolina, nicotina e carbacol) e antagonistas (mecamilamina e escopolamina) colinérgicos incubados durante 1 e 24 h. Os estudos em optogenética partiram primeiramente da caracterização do sistema cre/lox através da análise da expressão das proteínas de interesse, seletiva para astrócitos, por imunohistoquímica. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a huperzina-A aumentou a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos, assim como o tratamento com nicotina; no segundo, discutiu-se as limitações metodológicas quanto a especificidade das proteínas e alteração da fisiologia dos astrócitos. Os resultados obtidos nessa tese ressaltam para a importância do conhecimento da fisiologia do astrócito, contribuindo para o entendimento de um possível mecanismo de ativação colinérgico dos astrócitos em promover secreção de S100B. Também é preciso ressaltar a relevância de novas metodologias que ajudam a descrever melhor o papel dos astrócitos na atividade sináptica. / Although about half of the brain cells are glial cells, the Neuron Doctrine has neglected them, at the beginning of 20th century, because they were not excitable and also, they were unable to communicate as neurons. For a long time, the studies about astrocytes functions were limited to trophic and metabolic support to neurons by which providing for the homeostasis of the nervous system. A variety of studies have been shown the expression of different neurotransmitters receptors in astrocytes, for instance, nicotinic receptors, suggesting the possibility of astrocytic response to neuronal activity. This response is variable and dynamic and mostly can be activated by changes at the intracellular calcium levels. However, the specific mechanisms of astrocytic Ca2+ excitability and how this process could contribute to CNS functioning are still unclear. The S100B secretion could be an example of cellular communication, as well as biomarker for diverse diseases. S100B is calcium binding protein, produced and secreted mainly by astrocytes. Our group has already demonstrated the relevance of various neuronal systems mediating the S100B secretion. Another astrocytic form of communication could be the release of gliotransmitters and the acute influence at synaptic transmission. The aim of this thesis was to investigate whether cholinergic system activation could modulate S100B secretion in primary astrocytes cultures. Moreover, we investigated the optogenetic properties as a tool for gliotransmission studies in hippocampal slices. The astrocytes cultures were treated with acetylcolinesterase inhibitors (huperzine-A and tacrine), agonists (acetylthiocholine, nicotine and carbachol) and antagonists (mecamylamine and scopolamine) for 1 and 24h. The optogenetic studies were conducted, firstly, from the cre/lox characterization of protein expression, selectively for astrocytes, by immunohistochemistry. The first study results showed that huperzine-A increased S100B secretion, as well as nicotine; in the second study, we have discussed the main methodological limitations concerning the protein specificity and astrocytes physiology changes. These results raise the importance of astrocytes functions investigations, especially S100B secretion, contributing for the first time to the understanding of astrocytes excitability likely trough nicotinic system activation. In addition, it is worthy to note that new methodologies are relevant and can help us in a better description of astrocytes role during synaptic activity and brain functioning.

As plantas tóxicas continuam entre as principais causas de morte em bovinos no Brasil. Elas apresentam efeito relativamente específico sobre os tecidos e/ou sistemas. Várias plantas tóxicas do Brasil causam dano hepático, de forma aguda ou crônica, muitas vezes acompanhado de encefalopatia hepática, cuja patogenia ainda não havia sido elucidada nos casos de hepatopatia tóxica aguda em bovinos. O presente estudo teve como objetivo caracterizar microscopicamente as alterações encefálicas relacionadas a hepatopatias tóxicas em bovinos e resultou em três artigos. O primeiro deles descreve alterações encefálicas histológicas em bovinos com intoxicação espontânea por Cestrum intermedium e suas características na avaliação imuno-histoquímica (IHQ), com emprego dos anticorpos anti-proteína S100 e anti-proteína glial fibrilar ácida. No segundo artigo são caracterizadas as alterações encefálicas de 22 bovinos intoxicados natural ou experimentalmente por cinco espécies de planta de ação hepatotóxica aguda ou pela ingestão de P. flavipes, com avaliação de telencéfalo, tronco encefálico e cerebelo pelas técnicas de hematoxilina e eosina (HE), histoquímicas de ácido periódico de Shiff (PAS) e lectinas e pelas provas de IHQ usando os anticorpos anti-S100, anti-GFAP e anti-vimentina. Neste artigo são evidenciadas alterações relevantes em astrócitos, tanto da substância branca quanto da cinzenta e se demonstra serem os mesmos o principal alvo de lesão na hepatopatia tóxica aguda em bovinos, evidenciado pela IHQ. As técnicas histoquímicas citadas não apresentaram resultados promissores, por isso não são apresentadas no Artigo 2. No terceiro artigo é realizada avaliação comparativa de encéfalos de bovinos intoxicados por Senecio sp. com uso das mesmas técnicas e que demonstrou não haver alterações significativas em astrócitos e estruturas vasculares encefálicas, reiterando a patogenia anteriormente proposta, de que a degeneração esponjosa, alteração histológica encefálica amplamente descrita nessa intoxicação, é caracterizada por edema intramielínico. / Toxic plants remain among the major causes of death in cattle in Brazil. They have relatively specific effects on animal tissues or systems. Several Brazilian poisonous plants cause acute or chronic liver damage, often accompanied by hepatic encephalopathy, the pathogenesis of which was not yet elucidated in cases of acute toxic liver disease in cattle. This study resulted in three articles. The first describes histological findings in brains of cattle poisoned by Cestrum intermedium and their immunohistochemical characteristics using the anti-protein S100 and anti-glial fibrillary acidic protein markers. The second article characterizes changes in the brain from 22 cattle natural or experimentally poisoned by five plant species with acute hepatotoxic effects or by the ingestion of P. flavipes larvae. Hematoxylin and eosin stained slides of cerebrum, brainstem and cerebellum were evaluated, as well histochemical preparations stained with periodic acid Schiff or lectins and immunohistochemical evaluation employing anti-S100, anti-GFAP and anti-vimentin markers. These histochemical techniques did not show promising results, so these are not shown in the second article. Relevant changes were observed in astrocytes from white and gray matter, presenting these cells as the main target of injury in acute toxic liver disease in cattle. The third paper presents a comparative evaluation of the brains of ten cattle poisoned by Senecio sp. using the same techniques. There were no significant changes in astrocytes and brain vascular structures, backing up the pathogenesis previously proposed; that the histological brain changes identified as spongy degeneration, largely described in this poisoning, are characterized by intramyelinic edema.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T18:16:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação completa final 2.pdf: 2784660 bytes, checksum: 15ae7aeb47a5c6076dc1ce82e7adefad (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T18:16:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação completa final 2.pdf: 2784660 bytes, checksum: 15ae7aeb47a5c6076dc1ce82e7adefad (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / CNPQ; FACEPE / O Sildenafil (Viagra®) promove acúmulo de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) através da inibição seletiva da fosfodiesterase-5 (PDE5). Embora esse medicamento mantenha um excelente nível de segurança e perfil de tolerabilidade, apenas disfunção erétil e, mais recentemente, hipertensão pulmonar são doenças tratadas atualmente com Sildenafil. Astrócitos e micróglia são células do SNC que exercem um papel importante em numerosas patologias do cérebro, incluindo a Esclerose Múltipla (EM). A EM é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por desmielinização das células nervosas, que leva a severa deficiência psicomotora. Tem sido reportado que o acúmulo intracelular de GMPc modula a reação microglial e astrocitária e protege oligodendrócitos diferenciados (formadores da mielina), reduzindo danos causados à mielinização. Portanto, o presente estudo investigou os efeitos do Sildenafil em modelo de EM induzido pela ingesta de Cuprizona. Cinco camundongos C57BL/6 selvagens e cinco iNOS-/-, machos, com 7-10 semanas de idade, foram usados por grupo. Os grupos receberam, durante quatro semanas: 1) Cuprizona 0,2% misturada na ração, 2) Cuprizona na ração e Sildenafil 3, 25 ou 50 mg/Kg na água de beber (os iNOS-/- receberam apenas a dose de 25 mg/Kg), ou 3) Os controles receberam água e ração puras. Após os tratamentos, os cerebelos foram processados de acordo com a rotina para microscopia eletrônica de transmissão, western blotting, imunohistoquímica (parafina), imunofluorescência (congelação) ou coloração Luxol Fast Blue. Os resultados demonstraram que, nos animais selvagens, Cuprizona induziu temores, limitações motoras e alterações posturais nos animais, aumentou os níveis das proteínas GFAP e Iba-1, indicando gliose reativa e ativação microglial e aumentou COX-2, indicando um ambiente pró-inflamatório no cerebelo; além disso, provocou redução da espessura da mielina e da intensidade de mielinização e promoveu alterações ultraestruturais na bainha de mielina e nos axônios do cerebelo. Sildenafil protegeu significativamente o microambiente neural dos animais tratados com Cuprizona, apresentando efeito dose-dependente, cuja dose mais efetiva foi a de 25 mg/Kg. O tratamento com Sildenafil diminuiu os tremores e limitações motoras induzidos pela Cuprizona, manteve a expressão basal de GFAP e Iba-1, diminuiu fortemente a expressão de COX-2 e das citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, , IL-1β e IL-2), impediu a desmielinização e protegeu ultraestruturalmente a organização mielínica e axonal. Nos animais iNOS-/-, os efeitos clínicos induzidos pela Cuprizona foram semelhantes aos vistos nos animais selvagens e Sildenafil diminuiu esses efeitos. Cuprizona aumentou a expressão de GFAP, Iba-1 e IFN-γ. Nesses animais, entretanto, Sildenafil aumentou a marcação para GFAP, indicando que não teve efeito protetor nos astrócitos, na ausência do NO produzido pela iNOS. Por outro lado, diminuiu a expressão de Iba-1 e IFN-γ, indicando efeito anti-inflamatório e inativação da micróglia estimulada pela Cuprizona. Os animais iNOS-/- controle (sem nenhum tratamento) apresentaram alterações degenerativas na mielina, que foram agravadas pela Cuprizona. Sildenafil diminuiu a intensidade dessas alterações, embora não tenha resolvido-as completamente. Portanto, o aumento dos níveis de GMPc, pela inibição da PDE5, provavelmente agiu como antiinflamatório e agente protetor de astrócitos, micróglia e oligodendrócitos, diminuindo os danos ao tecido neural. Interessantemente, a via de ação do Sildenafil foi tipo celular-dependente, ou seja, foi independente do NO produzido pela iNOS em micróglia e oligodendrócitos e dependente em astrócitos. Portanto, após ensaios clínicos, o Sildenafil pode ser um medicamento compatível com a administração oral para a população com EM e outras doenças neurodegenerativas, promovendo efeitos benéficos adicionais aos tratamentos atuais. Esclarecer o mecanismo de ação do Sildenafil nas células neurais será alvo de estudos futuros do nosso grupo.