PINHEIRO, Rachel Sindeaux Paiva. Efeito gastroprotetor de uma fração proteica isolada do látex de Plumeria rubra (Apocynaceae) em lesão gástrica induzida por etanol : envolvimento de receptores TRPV1, da via NO/GMPc/Katp e da glutationa. 2012. 107 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-25T15:39:27Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_rsppinheiro.pdf: 2084534 bytes, checksum: a449a6188346f118a8f793351a2f6bd8 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:51:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_rsppinheiro.pdf: 2084534 bytes, checksum: a449a6188346f118a8f793351a2f6bd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_rsppinheiro.pdf: 2084534 bytes, checksum: a449a6188346f118a8f793351a2f6bd8 (MD5) Previous issue date: 2012 / The Plumeria rubra is a laticifer plant of family Apocynaceae, popularly known as “Jasmim”. It is widely distributed in tropical and subtropical regions, including Brazil. This plant is commonly used for the treatment of syphilis, fever, and as a purgative. Some studies show that the latex of P. rubra has antioxidant and vasodilator activity. The aim of this study was to evaluate the gastroprotective effect of laticifers proteins of Plumeria rubra (PrLP) in ethanol-induced gastric damage, to investigate the possible involvement of TRPV1 receptors, NOcGMPKATP pathway and glutathione, and possible toxic effects. Animal handling and experimental protocols were registered on the Institutional Ethics Committee under number 057/2010. Swiss mice (n=8), fasting for 16 hours, were treated intravenously (i.v.) with PrLP doses of 0.05, 0.5, 5 and 50 mg/kg. After 30 min the animals received 0.2 ml of absolute ethanol per oral (p.o.). After 60 min of ethanol administration, the animals were sacrificed, their stomachs removed and analyzed to determine lesion index. To investigate the involvement of mediators in PrLP effect, animals received indomethacin (10 mg/kg, p.o.), L-NAME (20 mg/kg, i.p.), ODQ (10 mg/kg, i.p.), glibenclamide (5 mg/kg, i.p.) and capsazepine (5 mg/kg, i.p.) prior to treatment with PrLP (0.5 mg/kg i.v.). Misoprostol (50 µg/kg; p.o.), L-arginine (600 mg/kg; i.p.), diazoxide (3 mg/kg; i.p.) and capsaicin (0.3 mg/kg; p.o.) were used as standard-drug. To evaluate the effect of PrLP on the levels of NO3-/NO2, the dosage was performed in the homogenate of the stomach, but to investigate a possible antioxidant effect, it was carried out the measurement of the GSH levels in normal and injured stomachs. For sub-chronic toxicity animals were treated for 7 days with 50 mg/kg i.v., followed by evaluation of various parameters, such as: body weight, complete blood count, biochemical (urea, ALT, AST) and wet weight of vital organs (heart, spleen, liver and kidney). PrLP at doses of 0.5, 5 and 50 mg/kg was able to inhibit the gastric lesions by 81.9, 72.8 and 68%, respectively, retrieving the GSH levels in the mucosa by 105% compared with the ethanol group and PrLP did not alter the GSH levels in animals that were not ethanol-lesioned stomachs. Additionally, PrLP also increased in 26% NO3-/NO2- levels that were reduced by ethanol administration. Indometacin, L-NAME, ODQ, glibenclamide and capsazepine were able to reverse the PrLP protective effect, demonstrating the involvement of prostaglandins, NO, GMPc, potassium channels ATP-dependent and TRPV1 receptors in its mechanism of action. Furthermore, the treatment for 7 days with PrLP did not change any parameter evaluated showing safety in their use. These results indicate that PrLP have gastroprotective pharmacology activity on the gastric mucosa which seems to be mediated in part by modulation of prostaglandin, NO/cGMP/KATP pathway and TRPV1 receptors, which play a fundamental role in maintaining blood flow and gastric mucosa defense. PrLP acts avoiding depletion of GSH levels ethanol-induced. Since this is important for the maintenance of mucosal antioxidant defenses. Moreover, PrLP did not shown acute toxicity in animals. / A Plumeria rubra L. é uma planta laticífera pertencente à família Apocynaceae, popularmente conhecida como Jasmim. Esta amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil. Essa planta é utilizada popularmente para o tratamento de sífilis, febre e como purgativo. Alguns estudos mostram que o látex de P. rubra possui atividade antioxidante e vasodilatadora. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito gastroprotetor das proteínas laticíferas da Plumeria rubra (PrLP) em modelo de úlcera gástrica induzida por etanol, investigar o possível envolvimento dos receptores TRPV1, da via NOGMPcKATP e da glutationa, e possíveis efeitos tóxicos. A manipulação dos animais e os protocolos experimentais foram registrados no Comitê de Ética Institucional sob o número 057/2010. Camundongos Swiss (n = 8), em jejum de 16h, foram tratados por via intravenosa com PrLP nas doses de 0,05; 0,5; 5 e 50 mg/kg. Após 30 min da administração de PrLP os animais receberam 0,2 ml de etanol absoluto v.o. Decorridos 60 min dessa administração, os animais foram sacrificados, os estômagos removidos e analisados para determinação do índice de lesão. Para investigar o envolvimento de mediadores no efeito de PrLP, os animais receberam indometacina (10 mg/kg; v.o.), L-NAME (20 mg/kg; i.p.), ODQ (10 mg/kg; i.p.), glibenclamida (5 mg/kg; i.p.) e capsazepina (5 mg/kg; i.p) antes do tratamento com PrLP (0,5 mg/kg; i.v.). Misoprostol (50 µg/kg v.o), L-arginina (600 mg/kg; i.p.), diazóxido (3mg/kg; i.p.) e capsaicina (0,3 mg/kg; v.o.) foram utilizados como droga-padrão. Para avaliar o efeito de PrLP sobre os níveis de NO3-/NO2, foi realizada sua dosagem no homogenato do estômago, mas para investigar um possível efeito antioxidante, foi realizada a dosagem dos níveis de GSH em estômagos normais e lesionados. Para a toxicidade sub-crônica os animais foram tratados por 7 dias com a dose de 50 mg/kg; i.v., seguido da avaliação de vários parâmetros, tais como: peso corporal, hemograma completo, bioquímicos (uréia, ALT e AST) e peso úmido de órgãos vitais (coração, baço, fígado e rim). PrLP nas doses de 0,5; 5 e 50 mg/kg foi capaz de inibir lesão gástrica em 81,9; 72,8 e 68%, respectivamente, recuperou os níveis de GSH na mucosa em 105% quando comparados com o grupo etanol e não alterou os níveis de GSH em animais que não tiveram seus estômagos lesionados pelo etanol. Adicionalmente, PrLP também aumentou em 26% os níveis de NO3-/NO2- que foram reduzidos pela administração de etanol. Indometacina, L-NAME, ODQ, Glibenclamida e capsazepina foram capazes de reverter o efeito de PrLP, demonstrando o envolvimento das Prostaglandinas, NO, GMPc, canais de KATP e dos receptores TRPV1 em seu mecanismo de ação. Além disso, o tratamento por 7 dias com PrLP não alterou nenhum parâmetro avaliado, mostrando segurança no seu uso. Estes resultados indicam que PrLP possui atividade farmacológica gastroprotetora sobre a mucosa do estômago ao qual parece ser mediada em parte pela modulação de prostaglandina, pela via NO/GMPc/KATP e pelos receptores TRPV1, ao qual possuem papel fundamental na manutenção do fluxo sanguíneo e na defesa da mucosa gástrica. PrLP atua evitando a depleção dos níveis de GSH induzidas pelo etanol. Sendo isto importante para a manutenção das defesas antioxidantes da mucosa. Além do mais, PrLP não apresenta toxicidade aguda nos animais.

BARROSO NETO, I. L. Aspectos estruturais do efeito vasorelaxante de lectinas de leguminosas. 2014. 116 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-22T18:18:04Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_ilbneto.pdf: 7270817 bytes, checksum: 5f31a968576e4b5bf59d3781f6d09559 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-29T21:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_ilbneto.pdf: 7270817 bytes, checksum: 5f31a968576e4b5bf59d3781f6d09559 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T21:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_ilbneto.pdf: 7270817 bytes, checksum: 5f31a968576e4b5bf59d3781f6d09559 (MD5) Previous issue date: 2014 / Lectins are multiactive proteins that have at least one domain capable of recognizing specific carbohydrates reversibly without changing them. The legume lectin family is a group of this protein class further studied, in particular highlighted the subtribe Diocleinae. These lectins have a high degree of structural similarity, but it does not follow the biological activities. This variability must reside in details, small differences that can be analyzed in studies based in structures. The primary sequence of C. grandiflora lectin (ConGF) shows great similarity with lectins of the same genus, but it has the largest number of mutations representative of the genus Dioclea, characterizing it as the Canavalia subgenus closest to Dioclea, and it is the most primitive among the canavalias. ConGF presented relaxing effect on smooth muscles of endothelial aortas of rats; however, the effects are weak against other Diocleinae lectins. The justification for this does not lie in a low structural similarity but in small changes in the orientation of key amino acids residues, which become responsible for biological diversity in action presented here, as required in other phenomena elicited by lectins. For Cymbosema roseum lectin (CRLI), the relaxing effect was also evaluated and the role of extracellular calcium was observed for this activity. Surprisingly, the calcium was not definitive for determining CRLI mechanism as dependent or independent of calcium ions. Our research has led to the construction of a theory which this lectin has dual mechanism of nitric oxide synthase (eNOS) activation. The first path is based on a specific membrane endothelial receptor able to activate eNOS by calmodulin. The second path relies on the ability of CRLI binding to the glycocalyx heparano sulfate at a domain different from the CRD demonstrated by molecular docking, which explain mechanical activation of eNOS. This proteoglycan is the main mechanoreceptor candidate of shear stress and this phenomenon is the major agent of maintenance of vascular tone by NO production. A lectin from gender Dioclea was also evaluated to increase the range of legume proteins tested. As other lectins of this work, D. sclerocarpa presented the ability to relax smooth muscle of the aorta dependent on the endothelium nitric oxide production. Both its effect and its structure have a high degree of similarity with lectins of the same genus. A feature set corroborates with its low relaxant effect. DSL has a CRD design less favorable for this activity. In addition, the presence of a glutamate at position 205 proved to be a decisive factor in the activity regulation and it negatively modulates Dioclea lectins relaxant effect. / As lectinas são proteínas multiativas que apresentam pelo menos um sítio capaz de reconhecer de maneira reversível carboidratos específicos sem modificá-los. A família das lectinas de leguminosas representa o grupo desta classe proteica mais bem estudada, em especial destaque a subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não se observa quanto às atividades biológicas. Esta variabilidade reside em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. A sequência primária da lectina de C. grandiflora (ConGF) apresenta grande similaridade com lectinas do mesmo gênero, porém concentra o maior número de mutações representativas do gênero Dioclea, caracterizando-o como o subgênero de Canavalia mais próximo de Dioclea, e dentre as canavalias é a mais primitiva. A ConGF apresentou efeito relaxante em músculo liso de aortas de ratos endotelizadas, no entanto, os efeitos mostram-se fracos frente a outras lectinas de Diocleinae. A justificativa para este fato não reside em uma baixa similaridade estrutural, mas em pequenas mudanças na orientação de aminoácidos-chave, que se tornam responsáveis pela diversidade na ação biológica apresentada aqui, como deve ocorrer em outros fenômenos elicitados por lectinas. Para a lectina de Cymbosema roseum (CRLI), além de avaliado o efeito relaxante, foi observado o papel do cálcio extracelular nesta atividade. Surpreendentemente, o cálcio não foi definitivo para determinar o mecanismo de CRLI como dependente ou independente deste íon. Nossa investigação permitiu a formulação de uma hipótese em que esta lectina apresenta um duplo mecanismo de ativação da óxido nítrico sintetase endotelial (eNOS). A primeira via é baseada em um receptor específico na membrana do endotélio capaz de ativar a eNOS através da calmodulina. A segunda via é baseada na habilidade de ligação de CRLI ao heparano sulfato do glicocálice em um sítio diferente do CRD demonstrada por docking molecular, o que justifica a ativação mecânica da eNOS. Este proteoglicano é o principal candidato a mecanoreceptor da tensão de cisalhamento, principal fenômeno da manutenção do tônus vascular pela produção de NO. Dentre as proteínas de Diocleinae, foi ainda avaliada uma lectina do gênero Dioclea. D. sclerocarpa apresentou, como as outras lectinas deste trabalho, a habilidade de relaxar músculos lisos de aortas. Fenômeno que ocorreu com a dependência do endotélio via produção de óxido nítrico e com a participação do CRD de DSL. Tanto seu efeito como sua estrutura apresentam alto grau de semelhança com lectinas do mesmo gênero e um conjuntos de características corrobora para seu baixo efeito relaxante. DSL apresenta um desenho de CRD pouco favorável para esta atividade e, além disso, a presença de um glutamato na posição 205 demonstrou ser um fator determinante na regulação desta atividade. Este resíduo modula negativamente a capacidade relaxante frente a lectinas que do mesmo gênero que possuem um resíduo de aspartato nesta mesma posição.

GUEDES, Sarah Florindo de Figueiredo. Proteínas salivares como biomarcadores para cárie dentária. 2014. 57 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-05T12:44:42Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_sffguedes.pdf: 1322683 bytes, checksum: 99787c9799f9656d39944e08af665126 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-05T12:45:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_sffguedes.pdf: 1322683 bytes, checksum: 99787c9799f9656d39944e08af665126 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-05T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_sffguedes.pdf: 1322683 bytes, checksum: 99787c9799f9656d39944e08af665126 (MD5) Previous issue date: 2014 / The number of studies that correlate salivary proteins and dental caries have incre ased considerably, however, there is not sufficient evidence to classify them as specific biomarkers for the disease. The aim of the study was to conduct a comparative analysis of saliva proteins of patients with early childhood caries (CPI) at different l evels of severity, in order to identify specific potential salivary biomarkers for diagnosis of this pathology. Methodology: 1) electronic search was performed in PubMed Medline database by applying the terms " carie " and "protein and salivary peptides." On e hundred and twenty studies were identified and 10 selected for review; 2) One hundred twenty - six children (24 - 71 months old) were selected. The children were examined in accordance with the visual index ICDAS II and divided into 3 groups (n = 42): Group caries - free (CF) (ICDAS 0), Group enamel caries ( EC ) (ICDAS 1, 2 and 3) and Group caries dentin ( DC ) (ICDAS 5 and 6). Then, the saliva was collected, processed and stored. The samples were digested and analyzed for mass spectrometry alter native multiplexed scanning (MSE ) . Analyses were perform ed with TransOmics Software, ANOVA and Volcano plot v - plot (p<0.05). Results: 1) n inety percent out of articles showed a relationship between salivary proteins and th e presence or absence of caries; 2) three hundred one proteins were identified and quantified, among them, 122 proteins were statis tically significant different at least in one group 84 were identified in all 3 groups ; o ne protein was expressed only in CF and other in EC ; 11 were expressed only in CF and EC , 15 in CF and DC , 10 in EC and DC . Of the 122 proteins, 54 proteins were at least 5 times more expressed in the comparison between the groups and were considered as candidates for biomarkers. From these 54, 1 8 proteins with potential mechanism of action r elated to dental caries were selected and analyzed . Conclusion : The relationship between salivary proteins and the presence or absence of caries is notorious and is already established. In this study, 18 proteins showed a relationship with t he CPI, and SAA 1, AIMP1, IL36A, IL36G and CAH1 have a greater potential to be considered biomarkers of dental caries. However, longitudinal studies have yet to be performed in order to establish the role of each protein studied and consolidate its role as a biomarker. / O número de estudos que correlacionam proteínas salivares e cárie dentária têm aumentado consideravelmente, no entanto, não há elementos suficientes que permitam qualificá-las como biomarcadores específicos para a doença. O objetivo do estudo foi realizar uma análise comparativa das proteínas da saliva de pacientes com cárie precoce da infância (CPI) em diferentes níveis de severidade, visando à identificação de potenciais biomarcadores salivares específicos para diagnóstico desta patologia. Metodologia: 1) busca eletrônica foi realizada na base de dados PubMed Medline aplicando os termos: "cárie" e "proteínas e peptídeos salivares". Cento e vinte estudos foram identificados e 10 selecionados para a revisão; 2) Cento e vinte e seis crianças (24-71 meses de idade) foram selecionadas. As crianças foram examinadas de acordo com o índice visual ICDAS II e divididas em 3 grupos (n = 42): Grupo livre de cárie (CF) (ICDAS 0), Grupo cárie de esmalte (EC) (ICDAS 1, 2 e 3) e Grupo cárie dentina (DC) (ICDAS 5 e 6). As amostras foram digeridas e analisadas por espectrometria de massa de varrimento multiplexado alternativo (MSE). As análises foram realizadas com TransOmics Software, Anova e Volcano plot v-plot (p<0,05). Resultados: 1) Noventa por cento de artigos mostraram uma relação entre proteínas salivares e presença ou ausência de cáries; 2) Trezentos e uma proteínas foram identificadas e quantificadas. Destas, 122 proteínas foram expressas com diferença estatística significante em pelo menos um grupo: 84 foram identificados nos 3 grupos; uma proteína foi expressa apenas no CF e outro no EC; 11 foram expressas apenas no CF e EC, 15 no CF e DC, 10 no EC e DC. Das 122 proteínas, 54 proteínas foram, pelo menos, 5 vezes mais expressas na comparação entre os grupos e foram consideradas como candidatas a biomarcadores. Destas 54, 18 proteínas com potencial mecanismo de ação relacionado a cárie dentária foram selecionadas e analisadas. Conclusão: A relação entre proteínas salivares e presença ou ausência de cárie é notória e já está estabelecida. Neste estudo,18 proteínas apresentaram uma relação com a CPI, e a SAA1, AIMP1, IL36A, IL36G e CAH1 possuem um maior potencial para serem consideradas biomarcadores da cárie dentária. No entanto, estudos longitudinais ainda precisam ser realizados, a fim de estabelecer o papel de cada uma das proteínas estudadas e consolidar o seu papel como um biomarcador.

COUTO, José Luciano Pimenta. Estudo de parâmetros salivares em portadores de picnodisostose. 2010. 96 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-14T12:01:20Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T16:01:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T16:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) Previous issue date: 2010 / Picnodysostosis (PKND) is a skeletal displasia characterized by short stature, osteosclerosis, acrosteolisis, craniofacial deformities and bone fragility. Approximately 200 cases have been described among different ethnic groups, with an estimated incidence of 1.7: 1.000.000 live births. The use of saliva as a diagnostic tool has advanced exponentially within recent years. Unbalance in the amount and composition of saliva may generate oral diseases such as dental caries and periodontitis, and may also indicate important systemic alterations. This study has aimed to investigate the parameters of human whole saliva in patients with PKND. Our study sample consisted of 4 individuals with PKND (experimental group) and 4 healthy individuals without PKND (control group). Salivary flow rate, pH and protein profile were evaluated in this population. Non stimulated whole saliva was collected and centrifuged. The supernatant was separated and lyophilized and stored at -20°C for posterior total protein and bidimensional electroforetic analysis. Statistically significant differences were observed between groups (p<0,05) for the analyzed salivary parameters. When compared to the control group, individuals with PKND presented reduced salivary flow rate, lower pH values, reduced total protein concentration, and protein bands with differentiated expression. The results of this study suggest the existence of a differentiated pattern of salivary composition between groups. / A picnodisostose é uma displasia esquelética caracterizada por baixa estatura, osteoclerose, acrosteólise, deformidades crânio-faciais e fragilidade óssea. Aproximadamente 200 casos foram descritos em diferentes grupos étnicos, estimando-se uma incidência de 1,7: 1.000.0000 de nascidos. O uso da saliva como um método de diagnóstico avançou exponencialmente nos últimos anos. Desequilíbrios na quantidade e composição da saliva podem gerar afecções bucais tais como cáries e doença periodontal, além de ser indicativo de alteração sistêmica importante. Esse trabalho objetivou estudar parâmetros de saliva total humana em pacientes portadores de picnodisostose (PYCN). A amostra consistiu em 04 indivíduos com PYCN (grupo experimental) e 04 indivíduos não-sindrômicos (grupo controle), tendo sido avaliado fluxo salivar, pH e perfil protéico. Saliva total não estimulada foi coletada e centrifugada; o sobrenadante foi retido, liofilizado, armazenado a -20°C e analisado para contagem de proteínas totais e eletroforese bidimensional. Foi possível detectar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p<0,05) para os parâmetros salivares analisados. Quando comparados com o grupo controle, portadores de PYCN apresentaram redução no fluxo salivar; pH com valores aumentados; redução na concentração total de proteínas e bandas protéicas com expressão diferenciadas. Os resultados desse estudo sugerem haver padrões diferenciados na composição salivar entre os grupos avaliados.

DAMASCENO, Juliana Ximenes. Estudo longitudinal do perfil salivar proteico de crianças nos primeiros meses de vida. 2015. 67 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-17T10:54:36Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_jxdamasceno.pdf: 562016 bytes, checksum: 312d86a630dd2a904b8c35a626ceafaa (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-17T11:30:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_jxdamasceno.pdf: 562016 bytes, checksum: 312d86a630dd2a904b8c35a626ceafaa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-17T11:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_jxdamasceno.pdf: 562016 bytes, checksum: 312d86a630dd2a904b8c35a626ceafaa (MD5) Previous issue date: 2015 / Studies on the development of salivary composition in the first year of life can promote the information about the immune maturation in children. Saliva is the most easily available and accessible body fluid, which makes it one of the most sought after tools in diagnostic and biomarks. In this context, this thesis, constituted by 01 article aimed to characterize salivary proteins in the first months of life using unidimensional electrophoresis. On this study, stimulated whole saliva was obtained from 79 babies, both genders at first and third months of life. Supernatants were analyzed, salivary flow rate (mL/min) was calculated for each child and total protein concentration determined by the Bicinchoninic Acid Protein (BCA) method. Proteins were characterized according to their molecular weights within the unidimensional electrophoresis. The results showed salivary flow rates significantly different (p = 0.000) between the first and third months of life, being the flow rate of whole saliva at third month (Median: 0.10, min-max: 0.02-0.2 mL/ min) higher than at first month (Median: 0.02, min-max: 0.02-0.06mL/min). The weight in Kg showed significant differences (p = 0.000) between the first month (Median: 3.32, Min-Max: 2.02-4.03) and third months (Median: 6.26, Min-Max: 4.49-9.30).This study also showed difference concerning to total protein concentration between saliva of the first and third months (p = 0.000), being higher concentrations found in first (Median: 1.293, min-max: 0.427-3.931 μg/mL) than in third (Median: 0.720, min-max: 0.164-2.244 μg/mL). Bands with 150 (p=0.004), 100 (p=0.000), 42 (p=0.001), 30 (p=0.039), 25 (p=0.001), 20 (p=0.009), 15 (p=0.011) and 13 kDa (p=0.002) presented higher intensity in whole saliva of the first month. A band with 218 kDa was expressed exclusively during the third month of life. Apgar at 1 min was positively correlated with the total number of bands expressed in the first (p = 0.019) and third months (p = 0.014). In conclusion, the concentration of total salivary proteins decreases between the first and third months, and the expression of the salivary proteins changes depending on the age, where the expression of specific protein bands is specific to certain developmental stages during the first 3 months. / Estudos sobre o desenvolvimento da composição salivar no primeiro ano de vida podem promover informações a cerca da maturação imunológica em crianças. A saliva é o fluido humano mais disponível e de fácil acesso, o que faz dela uma das ferramentas mais pesquisadas no campo de diagnóstico e biomarcadores. Nesse contexto, essa tese, constituída de 1 artigo objetivou caracterizar proteínas salivares nos primeiros meses de vida, utilizando eletroforese unidimensional. Nesse estudo, saliva total estimulada e foram obtidas de 79 bebês de ambos os gêneros no primeiro e terceiro meses de vida. Os sobrenadantes foram analisados, o fluxo salivar foi calculado (mL/min) para cada criança e a concentração de proteínas totais foi determinada pelo Método do Ácido Bicinconínico (BCA). Proteínas foram caracterizadas de acordo com o peso molecular através de eletroforese unidimensional. Os resultados demonstraram fluxos salivares significativamente diferentes entre o primeiro e terceiro meses de vida (p = 0,000), sendo o fluxo salivar no terceiro mês maior (Mediana = 0,10; Min-Max = 0,02-0,20 mL/ min) do que no primeiro mês (Mediana = 0,02; Min-Max = 0,02-0,06 mL/min).O peso em kg mostrou diferença significante (p = 0,000) entre o primeiro mês (Mediana: 3,32; Min-Max: 2,02-4,03) e o terceiro (Mediana: 6,26; Min-Max: 4,49-9,30). O presente trabalho também demonstrou diferença estatisticamente significante entre as concentrações de proteínas totais do primeiro e terceiro meses de vida (p < 0,001), onde a concentração de proteínas totais foi maior na saliva total do primeiro mês (Mediana = 1,29; Min-Max = 0,43-3,93 μg/mL) que no terceiro (Mediana: 1,293; Min-Max: 0,427-3,931 μg/mL). Bandas com 150 (p=0,004), 100 (p=0,000), 42 (p=0,001), 30 (p=0,039), 25 (p=0,001), 20 (p=0,009), 15 (p=0,011) e 13 kDa (p=0,002) apresentaram maior intensidade na saliva total durante o primeiro mês. A banda com 218 kDa foi observada exclusivamente durante o terceiro mês de vida. O Apgar no primeiro minuto se correlacionou positivamente com o número total de bandas expressas no primeiro (p = 0,019) e terceiro mês (p = 0,014). Em conclusão, a concentração de proteínas totais salivares reduz entre o primeiro e o terceiro meses de vida, e a expressão de proteínas salivares muda em função da idade, onde a expressão de determinadas bandas proteicas é específica a determinados períodos de desenvolvimento durante os primeiros 3 meses de vida.

CORREIA NETO, Cornevile. Produção e purificação parcial de IgY anti-lectina de sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras. 2015. 72 f. Dissertação (mestrado em biotecnologia de recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-31T18:35:56Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-18T20:14:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T20:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are a group of proteins present in various living organisms, particularly in plants and especially in Leguminosae seeds. Among this family, a species that stands out for having large amount of lectin in the seed is the Canavalia brasiliensis. One approach for the investigation of lectins on biological systems is the detection there of by techniques involving antibody. Such techniques may include from classical immunochemical assays (immunodiffusion, immunoelectrophoresis and rocketimunoeletroforese) to ELISA experiments and advanced microscopy techniques. In this sense, antibodies become biotechnological tools invaluable since they are capable of specifically recognizing epitopes of the target molecules. Immunoglobulins (Igs) are proteins present in high concentration in the blood plasma of mammals. They are vectors of humoral immunity, with the primary function to join the foreign antigens to the individual so as to neutralize them. In the case of poultry the main immunoglobulin class (IgYs) can be found not only in blood, but also in egg yolk. This fact enables fast and efficient purification of these molecules facilitating its use as biotechnological inputs. Thus, this study aimed to produce antibodies against the lectin extracted from Canavalia brasiliensis seed (ConBr) (Fabaceae) in laying hens, implementing production methodology of new biotechnological inputs for the study of lectins. For this laying hens were immunized with 200 or 400μg of lectin Canavalia brasiliensis (ConBr) for 15 weeks at 10-day intervals. Collected eggs from vaccinated birds had their isolated and precipitated yolk in 0-30% fraction with ammonium sulfate for partial purificaçãoo of IgYs. Confirmation of the presence of antibodies was made by immunodiffusion assays agarose gel. The fraction showed 0-30%, from the first week after the immunization, capable of recognizing ConBr IgYs. This profile appeared in all groups over the 15-week experiment. The production of specific IgYs against the lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) proved feasible and remained throughout the experiment, possibly in reasonable quantities. In this sense, IgYs produced in this work provide a powerful biotechnological tool to be made available for future studies. / As lectinas constituem um grupo de proteínas presentes em diversos organismos vivos, sobretudo em vegetais e especialmente em sementes de Leguminosae. Dentre essa família, uma espécie que se destaca por possuir grande quantidade de lectina na semente é a Canavalia brasiliensis. Uma das possíveis abordagens para a investigação de lectinas em sistemas biológicos é a detecção das mesmas através de técnicas que envolvam anticorpos. Tais técnicas podem incluir desde ensaios clássicos de imunoquímica (imunodifusão, imunoeletroforese e rocketimunoeletroforese), até experimentos de ELISA e técnicas avançadas de microscopia. Neste sentido, os anticopos tornam-se ferramentas biotecnológicas de grande valia uma vez que são capazes de reconhecer especificamente epítopos das moléculas alvo. As imunoglobulinas (Igs) são proteínas presentes em grande concentração no plasma sanguíneo de mamíferos. São os vetores da imunidade humoral, tendo como função principal unir-se aos antígenos estranhos ao indivíduo, de modo a neutralizá-los. No caso das aves a principal classe de imunoglobulinas (IgYs) pode ser encontrada não somente no sangue mas também nas gemas dos ovos. Esse fato permite purificação rápida e eficiente dessas moléculas facilitando seu uso como insumos biotecnológicos. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo produzir anticorpos contra a lectina extraída da semente de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras, implementando metodologia de produção de novos insumos biotecnológicos para o estudo de lectinas. Para tanto galinhas poedeiras foram imunizadas com 200 ou 400μg da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) por 15 semanas em intervalos de 10 dias. Ovos coletados das aves imunizadas tiveram suas gemas isoladas e precipitadas na fração 0-30% com sulfato de amônio para a purificação parcial das IgYs. A confirmação da presença dos anticorpos foi feita por ensaios de imunodifusão em gel de agarose. A fração 0-30% apresentou, a partir da primeira semana após a imunização, as IgYs capazes de reconhecer ConBr. Esse perfil se apresentou em todos os grupos ao longo das 15 semanas de experimento. A produção das IgYs específicas contra a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) se mostrou viável e permaneceu durante todo experimento, possivelmente em quantidades razoáveis. Neste sentido, as IgYs produzidas nesse trabalho constituem uma potente ferramenta biotecnológica a ser disponibilizada para estudos futuros.

As proteínas 14-3-3 formam uma família altamente conservada, expressas em todos os organismos eucariotos já estudados. Através da interação com seus alvos, as proteínas 14-3-3 participam de importantes processos celulares, como controle do ciclo celular, apoptose, transdução de sinal e diferenciação celular. Neste trabalho, essa família gênica foi estudada em Echinococcus granulosus e em Echinococcus multilocularis, as espécies de maior importância do gênero Echinococcus. E. granulosus e E. multilocularis, na fase larval, são agentes etiológicos da hidatidose cística e da hidatidose alveolar, respectivamente, zoonoses associadas a grandes prejuízos na área da pecuária e a gastos no tratamento de pacientes humanos. Por meio da análise dos bancos de dados disponíveis e comparação com os dados genômicos, neste estudo, seis potenciais genes codificadores de proteínas 14-3-3 foram identificados para ambas as espécies, sendo denominados Eg14-3-3 e Em14-3-3 para E. granulosus e E. multilocularis, respectivamente. Análises filogenéticas das sequências preditas de aminoácidos codificadas por esses genes demonstram que as proteínas Eg14-3-3 e Em14-3-3 retêm características ancestrais, não se agrupando claramente com proteínas ortólogas de outros organismos quanto ao tipo de isoforma (zeta e épsilon), como ocorre, por exemplo, em mamíferos. A fim de caracterizar funcionalmente as proteínas Eg14-3-3, o padrão de expressão das isoformas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 foi avaliado. A identificação dessas isoformas em componentes do metacestódeo de E. granulosus que representam interfaces parasito-hospedeiro sugere a possível participação dessas proteínas em mecanismos de interação com o hospedeiro. Estudos para a identificação dos ligantes protéicos que interagem com as proteínas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 também foram realizados. Entre os ligantes identificados estão chaperonas, proteínas associadas à conversão de energia, citoesqueleto, e transporte e metabolismo de carboidratos. Essas interações apontam o envolvimento da família proteica 14-3-3 em mecanismos que promovem o estabelecimento e sobrevivência de E. granulosus. A caracterização das interações identificadas neste estudo poderá auxiliar na elucidação de aspectos biológicos básicos do parasito, e mecanismos moleculares utilizados para o desenvolvimento e manutenção do metacestódeo nas vísceras do hospedeiro intermediário por longo período de tempo. / The 14-3-3 proteins form a highly conserved family, and have been shown to be actively expressed in all eukaryotic organisms studied so far. Through interaction with their targets, the 14-3-3 proteins participate in some of the major eukaryotic cellular processes, such as cell cycle regulation, apoptosis, signal transduction, and cell differentiation pathways. In the present work, this gene family has been studied in two species of the genus Echinococcus, namely Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, which, in their larval stage, are the causative agents of the cystic hydatid disease and the alveolar hydatid disease, respectively, two economically relevant zoonotic diseases associated with livestock production losses and human health care expenditures. Through analysis and comparison of available database, and searches in Echinococcus sequencing genome data, six candidate genes encoding 14-3-3 proteins were identified in both species, being named Eg14-3-3 and Em14-3-3 to E. granulosus and E. multilocularis, respectively. Interestingly, the phylogenetic analyses of deduced amino acid sequences encoded by these genes showed that Eg14-3-3 and Em14- 3-3 proteins retain more ancestral characteristics, and do not group clearly with orthologous proteins from other organisms relative to isoform types (zeta and epsilon), as occurs, for example, in mammals. In order to functionally characterize the Eg14-3-3 proteins, the expression patterns of the Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 isoforms were analyzed. The identification of both isoforms in E. granulosus metacestode components, that represent host–parasite interface, suggests a possible participation of these proteins on mechanisms of interaction with the host. Additionally, studies aiming the identification of proteins able to bind to Eg14-3-3ζ2 and Eg14-3-3ζ3 isoforms were carried out. Among the ligands identified, chaperones, proteins associated with energy production and conversion, cytoskeleton and carbohydrate transport and metabolism, were present, suggesting the involvement of 14-3-3 protein family in mechanisms that promote the establishment and survival of E. granulosus. Further characterization of the interactions identified in this study can help to elucidate basic biological aspects of these parasites, as well as molecular mechanisms involved in the development and maintenance of hydatid cyst in within intermediate host tissues for long time.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-07-09T21:07:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-07-24T13:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-24T13:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) Previous issue date: 2014 / A esquistosomose mansônica é a segunda parasitose mais devastadora segundo a Organização Mundial da Saúde, afligindo mais de 240 milhões de pessoas no mundo. Contudo, apesar do genoma do Schistosoma mansoni ser extensivamente estudado, os mecanismos envolvidos no remodelamento morfológico e adaptação do parasito após instalação no hospedeiro mamífero permanecem desconhecidos. A hipótese deste trabalho é que modificações pós-traducionais dependentes de SUMO e NEDD8 regulam o proteoma de maneira estágio-específica, contribuindo para uma adaptação rápida ao hospedeiro mamífero. Para investigar essa hipótese, inicialmente foi utilizado busca por similaridade, pesquisa de domínio e resíduos conservados, seguido de análises filogenéticas para identificar os genes relacionados com a via de sumorilação e nedilação de proteínas. Nesta etapa, também foram analisados genes do complexo COP9 signalossoma, devido a sua atividade denediladora intrínseca. Os resultados sugerem o envolvimento de 24 genes, sendo 9 com a modificação dependente de SUMO, 7 para a via dependente de NEDD8 e 8 com a montagem do complexo COP9. Em geral, as proteínas preditas apresentam um alto grau de conservação em relação às proteínas ortólogas. Para investigar padrões de expressão gênica diferencial ou estágio-específica nos estágios de cercária, verme adulto e esquistossômulos de 3,5 horas a 7 dias de cultivo in vitro, foi utilizada a técnica de qRT-PCR. Com relação à via de sumorilação, foi verificada uma expressão diferencial das E3 ligases: SmPIAS e SmRanBP2 e das enzimas desumoriladoras: SmSENP1 e SmSENP7. Além disso, a protease SmSENP1 mostrou uma atividade diferencial em verme adulto e em cercária. Já em relação à via de nedilação, foi observada uma correlação positiva entre o perfil de expressão dos constituintes da via de NEDD8 e seus alvos clássicos: culinas 1-5; p53 e p73. Subunidades do complexo COP9 signalossoma também foram avaliadas e mostraram ser mais expressas em cercária do que em verme adulto, o perfil de expressão entre os esquistossômulos foi semelhante. Também foram observadas que ambas as vias de modificação são ativadas em condições de estresse e inibidas na presença de MG132, um inibidor clássico do proteassoma. A continuação desta linha de investigação, utilizando técnicas proteômicas e silenciamento gênico, poderá confirmar a hipótese de que o proteoma de cercária e esquistossômulos jovens são extensivamente modificados por SUMO e NEDD8, sugerindo uma importância dessas vias de modificação para a instalação do parasitismo. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Schistosomiasis is the second most devastating parasitic disease according to the World Health Organization, afflicting over 240 million people worldwide. Although the Schistosoma mansoni genome has been extensively studied, the mechanisms involved in morphological remodeling and adaptation of the parasite in the mammalian host remain unknown. Our working hypothesis is that SUMO and NEDD8-dependent post-translational modifications regulate, in a stage - specific manner, the parasite´s proteome, contributing to a rapid adaptation to the mammalian host. To investigate this hypothesis, we initially used, domain and conserved residues similarity searches, followed by phylogenetic analysis to identify genes involved in the SUMOylation and NEDDylation pathways. In this step, the genes related to COP9 signalosome complex were also analyzed, due to their intrinsic deNEDDylating activity. The results suggest the involvement of 24 genes, of which 9 were related to SUMO modification, 7 to NEDD8 pathway and 8 involved in the assembly of the COP9 complex. In general, the predicted proteins showed a high degree of conservation compared to orthologue proteins. To investigate differential gene expression patterns in cercariae, adult worms and in-vitro schistosomula cultured for 3.5 hours and 7 days it was used the qRT-PCR technique. Concerning the SUMOylation pathway, it was observed a differential expression of E3 ligases: SmPIAS and SmRanBP2 and also for deSUMOylating enzymes: SmSENP1 and SmSENP7. Moreover, SmSENP1 protease showed a differential activity in adult worms and cercariae. As for the NEDDylation pathway, a positive correlation was observed comparing the expression profile of the NEDD8 pathway constituents and their classic targets p53 and p73 cullins 1-5. Subunits of the COP9 signalosome complex were also evaluated and showed to be up-regulated in the cercariae compared to adult worms, the expression profiles of such subunits were similar among the cultured schistosomula. It was also observed that both pathways are activated under stress and inhibited in the presence of MG132, a classic proteasome inhibitor. Proteomic techniques and gene silencing may further validate our hypothesis that the cercariae and early-schistosomula proteomes are extensively modified by SUMO and NEDD8, revealing the importance of these pathways for parasite installation and maintenance inside the vertebrate host.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-01-21T19:53:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) Previous issue date: 2014 / A angiogênese ou neovascularização é um processo que inclui a ativação, adesão, proliferação e transmigração de células a partir de vasos sanguíneos pré-existentes, formando novos vasos. Para que isso ocorra, as células endoteliais devem primeiramente escapar da sua localização estável, através da ruptura da membrana basal, mediada por serino proteases (SPs) e metaloproteases (MPs) e migrar em direção ao estímulo angiogênico. Neste sentido, o equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos é necessário para manter a homeostase celular e a angiogênese fisiológica. Os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir proteases tripsina-símile e quimotripsina-símile. Dotado de capacidade antitumoral essa molécula pode atuar inibindo proteases envolvidas na angiogênese. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido comprovada, tanto em preparações enriquecidas, o BBI concentrado (BBIC) quanto em preparações purificadas. Entretanto, essa atividade antitumoral pode estar relacionada à presença de outras substâncias em sua preparação. Mais recentemente a Lunasina tem sido apontada como o principal componente responsável por tal atividade. O mecanismo de ação proposto para a Lunasina está relacionado à capacidade de inibição da acetilação de histonas, regulando a desespiralização da cromatina e assim, inibindo a proliferação celular. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiangiogênico de ambas as substâncias tendo em vista a possibilidade de inibição de enzimas proteolíticas pelo BBI e a atividade antiproliferativa da Lunasina. A avaliação do potencial antiangiogênico foi realizada através do Ensaio em Membrana Corioalantóica (CAM) de Gallus domesticus. Para identificar as atividades biológicas dessas proteínas da soja e explorar os possíveis mecanismos relacionados à atividade antiangiogenica, o domínio ativo da Lunasina (PL22) foi sintetizado e testado no ensaio de CAM in vivo. Testamos ainda o BBI purificado a partir de sementes de soja e a associação de PL22 e BBI. O peptídeo PL22 e o BBI apresentaram atividade na redução de vasos sanguíneos, a partir da dose de 7000 pmol. A porcentagem de redução do número de bifurcações em relação ao controle foi de 18% para o BBI na dose de 70 pmol e de 31% para o peptídeo PL22 na mesma dose. Entretanto não foi verificado efeito cooperativo ou sinérgico na associação do peptídeo PL22 com o BBI. Não foram observadas variações na expressão dos marcadores conexina-43 e VEGF pela técnica de Western blotting, sugerindo esses marcadores não estão relacionados ao mecanismo de ação do BBI e PL22. Os resultados da análise corroboram as avaliações feitas pela contagem direta dos vasos em microscópio digital do ponto de vista do efeito antiangiogênico. Além disso, foi observada uma atividade antinflamatória pra ambas as subtâncias. A apreciação dos perfis eletroforéticos bidimensionais de extratos das membranas corioalantóicas tratadas com BBI e PL22 demonstram uma expressão de proteínas diferencial em relação ao controle que permitirá a identificação de possíveis marcadores visando esclarecer o mecanismo e confirmar molecularmente os efeitos constatados. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Angiogenesis or neovascularization is a process, which includes activation, adhesion and transmigration of cells from pre-existing blood vessels, forming new blood vessels. For the process occur, endothelial cells must first escape from their stable location, through disruption of the basement membrane, mediated by serine proteases (SPs) and metalloproteases (MPs) and migrate toward the angiogenic stimulus. Accordingly, the balance between proteases and their endogenous inhibitors is necessary to maintain cellular homeostasis and physiological angiogenesis. Protease inhibitors Bowman- Birk type (BBI) are proteins characterized by the presence of two independent domains capable of inhibiting trypsin-like and chymotrypsin-like proteases. Endowed with antitumor capacity this molecule may act by inhibiting proteases involved in angiogenesis. The ability of BBI to prevent carcinogenesis has proved both in enriched preparations, BBI concentrate (BBIC) and in purified preparations. However, the antitumor activity could be related to the presence of other substances in its preparation. More recently, lunasin was identified as the main component responsible for this activity. The proposed mechanism of action for lunasin was related with the ability to inhibit histone acetylation, regulating the chromatin unfolding and thus inhibiting cell proliferation. This study aimed to evaluate the antiangiogenic potential of both substances in view of the possibility of inhibition of proteolytic enzymes by BBI and antiproliferative activity of lunasin. The assessment of antiangiogenic potential was performed using Chorioallantoic Membrane Assay (CAM) of Gallus domesticus. To identify the biological activities of these proteins in soy and explore the possible use in anti- angiogenic therapy, the active area of lunasin (PL22) was synthesized and tested in the CAM assay in vivo. BBI also was tested and purified from soybean seeds and the association of PL22 and BBI. The PL22 peptide and BBI showed activity in reducing blood vessels from the dose of 7000 pmol . The percentage of reduction in the number of bifurcations compared to control was 18% for the BBI at a dose of 70 pmol and 31 % for the PL22 peptide at the same dose. However, no cooperative or synergistic effect was observed in association with the peptide PL22 and BBI. No changes in the expression of markers connexin-43 and VEGF by Western blotting was observed, suggesting these markers are not related to the mechanism of action of BBI and PL22. The results of the analysis support the evaluation performed by direct counting of vessels in digital microscope view of the antiangiogenic effect. In addition, an anti-inflammatory activity for both subtances was observed. The assessment of the two-dimensional electrophoretic profiles of extracts of chorioallantoic membranes treated with BBI and PL22 showed a differential expression of proteins compared to control. These experiments represent an approach to identify markers and mechanisms related to the observed effect.