Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-09-20Bitstream added on 2014-06-13T19:06:01Z : No. of bitstreams: 1 garrido_ss_dr_araiq.pdf: 1028585 bytes, checksum: e89c831c561b8a3f32e4e5f09d4310d6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A maioria das bactérias possui dois tipos de topoisomerases IIA, DNA girase e topoisomerase IV (topo IV), que juntas ajudam a administrar a integridade e a topologia do DNA. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação do DNA e transcrição. Isso faz da girase e da topo IV alvos importantes para diversas drogas antibacterianas. Estruturalmente, ambas operam como um heterotetrâmero composto por duas proteínas GyrA e duas proteínas GyrB, para a girase, e duas proteínas ParC e duas ParE, na topo IV. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a girase e a topo IV, tais como as quinolonas, cumarinas e algumas toxinas naturais, incluindo o CcdB. A toxina bacteriana CcdB, é uma pequena proteína de 11,7 kDa, contendo 101 resíduos de aminoácidos que, juntamente com o CcdA, faz parte de um sistema de morte celular programada do plasmídeo F, um fator de conjugação muito estudado em Escherichia coli. CcdB atua como uma toxina e o CcdA como a antitoxina. Na ausência de CcdA, CcdB pode matar a bactéria através de um mecanismo, ainda pouco conhecido, que envolve a girase e/ou a topo IV, assim como a região C-terminal da toxina CcdB (Trp-99 a Ile-101). Neste trabalho está descrita a obtenção de uma série de seqüências peptídicas miméticas, racionalmente projetadas, baseadas na estrutura primária do CcdB natural, com o objetivo de melhor entender o mecanismo de inibição da atividade de ambas, DNA girase e topo IV, pelo CcdB, e também propor um novo grupo de moléculas com potencial atividade antibacteriana. / Most bacteria posses two type IIA topisomerases, DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV), that together help manage DNA integrity and topology. Gyrase primarily introduces negative supercoils into DNA, and the topo IV, although closely related to gyrase, preferentially decatenates DNA and relaxes positive supercoils, essential functions for bacterial DNA replication and transcription. This makes of the gyrase and topo IV important targets for antibacterial drugs. Structurally both operate as a heterotetramer formed by two GyrA and two GyrB proteins for girase, and two ParC and two ParE proteins for topo IV. A large number of antibacterial agents act in the inhibition of the gyrase and topo IV, such as quinolones, coumarins, and some natural toxins including the protein CcdB. The bacterial toxin CcdB is a 11.7 kDa protein with 101 amino acids that with CcdA form a programmed cell death system of F plasmid, a conjugation factor widely studied in E. coli. CcdB acts like a toxin and CcdA as the antitoxin. In the CcdA absence, CcdB can kill the cell by an unclear mechanism that involves gyrase and/or topo IV, as well as the CcdB C-terminal region (Trp-99 to Ile-101). In this work it is described the obtaining of a several peptides mimics, rationally design, based on the primary structure of natural CcdB toxin, to a better understanding the inhibition mechanism of the activity of the gyrase and topo IV, by CcdB toxin, and also propose a new molecules group with potential antibacterial activity. The peptides mimics were synthesized by Solid Phase methodology (SPPS), purified and analyzed by liquid chromatography (HPLC) and identified by LC/ESI-MS and by amino acid analysis. The inhibition capacity of the peptide mimics was tested by electrophoresis agarose gels and by bacterial growth in liquid medium assays.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000380548-Texto+Completo-0.pdf: 266524 bytes, checksum: a46413371cdc9f2cd8ff77f42e6f29db (MD5) Previous issue date: 2005 / Background: From the example of dislipidemics, which is one of the main cardiovascular risk factors, C-reactive protein (CRP) was recently identified as a cardiovascular event predictor. However, the relation between the anatomic gravity of the coronary artery disease (CAD) defined by angiography and the CRP levels or lipids in subjects with chronic stable angina is not well established. Methods: Observational transversal study that evaluated 138 subjects with stable angina, submitted to cardiac catheterism, compared anatomic gravity of CAD with hipersensitive CRP and lipids levels. And experienced and blind to laboratory results hemodynamicist evaluated the angiographic data. The anatomic gravity was quantified by the use of a score (0-12 points) that bestowed 1 point for each vase with stenosis >50% (0-3 points) and additional points considering the greater stenosis of each vase (0= no stenosis; 1= <50%; 2= 50-75%; 3= >75%). The subjects were classified in three groups: A group= score from 0 to 3; B group= score from 4 to 7; C group= >7.Results: Mean age was 56,9 years old ±11,3 years and 51% were female. 72 subjects were allocated to A group , 21 to B group and 45 to C group. A direct relation between the angiographic CAD and age (p=0,005) and trigliceride levels (p=0,018) was observed. There was no association with total cholesterol levels (p=0,13) or CRP (p=0,94). There was a tendency of inverse relation with the HDL levels (p=0,009). Conclusion: CRP levels do not present relation with the presence and severity of the CAD evaluated by angiography in subjects with chronic stable angina. More research will be necessary to evaluate the role of HDL on CAD. / Introdução: Dislipidemia é um importante fator de risco modificável para evento coronariano mas muitos eventos ocorrem em pessoas com níveis de lípides normais que aparentemente teriam risco clínico baixo. Novos fatores de risco para doença coronariana foram definidos, entre eles a dosagem sérica de proteína C reativa hipersensível (hs-CRP). Angiografia coronariana é o padrão ouro para o diagnóstico anatômico de doença coronariana e tem sido utilizada para avaliação de pacientes que sofreram eventos agudos ou que necessitam manejo clínico mais adequado. Objetivos: Estabelecer a relação entre o grau de estenose coronariana e os níveis de hs-CRP. Analisar a correlação entre fatores de risco clássicos e grau de estenose coronariana. Material e métodos: Neste estudo transversal foram incluídos pacientes submetidos a cateterismo cardíaco eletivo no Serviço de Hemodinâmica do Hospital São Lucas da PUCRS, com avaliação dos resultados obtidos e dos níveis de hs-CRP e de lipídios dosados.Resultados: Foram avaliados 138 pacientes (70 mulheres e 68 homens, idade média de 56,9 +/- 11,3 anos) submetidos a angiografia coronariana, avaliada por um profissional experiente cegado para outros dados do estudo, de acordo com 2 escores: escore de vaso (0-3 pontos para 0-3 vasos com doença coronariana) e escore de estenose (0-3 pontos; 0 = s/ lesões, 1 = estenose 1-49%; 2 = 50-74%; 3 = >75%). De acordo com o escore total obtido, foram encontrados 72 pacientes sem doença ou com doença arterial coronariana mínima (grupo A, escore 0-3), 21 pacientes com doença moderada (grupo B, escore 4-7) e 45 pacientes com doença severa (grupo C, >7). Foi analisada a correlação entre esses grupos e os níveis de hs-CRP, colesterol total, HDL colesterol, triglicerídeos e a idade. Pacientes com idade mais avançada apresentaram escore mais elevado (p=0,005). Não houve significância estatística com relação aos níveis de colesterol total e de PCR e houve relação inversa com níveis de HDL colesterol (p=0,095) e triglicerídeos (p=0,018). Conclusão: Os fatores de risco clássicos demonstraram relação com severidade da doença coronariana (idade, HDL colesterol e triglicerídeos). Os níveis de hs-CRP demonstraram associação com a presença mas não com a severidade da doença arterial coronariana de acordo com a angiografia coronária.

Orientadora : Profª. Drª. Elaine Machado Benelli / Coorientadora : Profª. Drª. Cecília Fabiana da Gama Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/03/2017 / Inclui referências : f. 33-34 / Resumo: A análise estrutural de proteínas é uma ferramenta de grande importância na biologia moderna, uma vez que possibilita o estudo do mecanismo de ação de diversas doenças e o desenvolvimento de novos medicamentos. Atualmente, a principal técnica utilizada no estudo da estrutura tridimensional de proteínas é a cristalografia de raios-X, sendo responsável pela resolução de cerca de 90% das estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB). Contudo, a difração de raios-X requer a obtenção de um cristal de proteína de alta qualidade. A cristalização de proteínas é um processo que exige condições específicas, envolvendo uma transição de fase na qual as moléculas de proteína deixam de ser solúveis e passam a formar núcleos organizados. Assim, esse processo é limitado pela nucleação, que requer o choque ordenado das moléculas de proteína para dar início ao crescimento do cristal. Esta, por sua vez, necessita que seja atingida a supersaturação das proteínas em solução. Para atingir essa condição utiliza-se mais comumente a técnica de difusão de vapor, na qual ocorre um aumento de concentração de proteína na gota por meio da difusão lenta de água para um reservatório com maior concentração salina. Quando a condição de supersaturação for atingida muito rapidamente, forma-se um precipitado amorfo em vez de cristais ordenados. Além disso, um nível de saturação muito alto pode levar a formação de inúmeros núcleos, desfavorecendo o crescimento dos cristais e prevalecendo cristais pequenos e de baixa qualidade. Na literatura são propostas diversas alternativas para facilitar a nucleação e crescimento dos cristais, que demandam concentrações menores de proteína e menos tempo. Uma alternativa comum é a chamada nucleação heterogênea, em que o meio cristalizante é semeado com materiais minerais ou orgânicos, como micro-cristais da própria proteína. Outra alternativa é a utilização de um campo elétrico, magnético ou eletromagnético para promover a organização das moléculas na solução de proteína. No entanto, muitas dessas metodologias ainda apresentam limitações, sobretudo com relação a qualidade dos cristais formados. Neste contexto, o presente trabalho apresenta uma nova abordagem para promover a nucleação, empregando a aplicação de um campo elétrico externo durante a formação de um filme protéico e a utilização deste filme organizado como centro de nucleação na cristalização por vapor-difusão. Como modelo de estudo foi utilizada a lisozima de clara de ovo de galinha. Através de imagens de microscopia de força atômica foi possível confirmar a estrutura organizada destes filmes e, por espectroscopia de infra-vermelho por transformada de Fourier foram verificadas pequenas alterações na estrutura secundária da proteína diante da aplicação do campo elétrico. Essa alterações, contudo, não comprometeram a estrutura final da proteína, permitindo um aumento no número de cristais formados, e, em alguns casos, uma melhora da morfologia e aumento do tamanho destes cristais. A análise por difração de raios-X indicou uma melhoria na qualidade da estrutura cristalina, sobretudo em condições nas quais tradicionalmente não se obtêm bons cristais de lisozima. Palavras-chave: cristalização de proteínas, filme organizado de proteína, lisozima, nucleação. / Abstract: Structural analysis of proteins is a tool of great importance in modern biology, since it allows the study of the mechanism of action of several diseases and the design of new drugs. Nowadays, the main technique used in the study of the three-dimensional structure of proteins is X-ray crystallography, being responsible for the resolution of about 90% of the structures deposited in the Protein Data Bank (PDB). However, X-ray diffraction requires a protein crystal of high quality. The protein crystallization is a process that demands specific conditions involving a transition phase in which protein molecules are no longer soluble and start to form organized nuclei. Thus, this process is limited by nucleation, which requires ordered shock of protein molecules to initiate crystal growth. This, in turn, needs to achieve supersaturation of proteins in solution. In order to reach this condition, the technique of vapor diffusion is used, in which an increase of protein concentration in the drop occurs through the slow diffusion of water to a reservoir with higher salt concentration. When the supersaturation condition is reached very quickly, an amorphous precipitate is formed instead of ordered crystals. In addition, a very high saturation level can lead to the formation of numerous nuclei, disfavoring the growth of crystals and prevailing small and low quality crystals. In the literature, several alternatives are proposed to facilitate nucleation and crystal growth, requiring lower protein concentrations and less time. A common alternative is the so-called heterogeneous nucleation, where the crystallizing medium is seeded with mineral or organic materials, such as microcrystals of the protein itself. Another alternative is the use of an electric, magnetic or electromagnetic field to promote the organization of molecules in the protein solution. However, many of these methods still have limitations, especially regarding to the quality of the crystals formed. In this context, the present work presents a new approach to promote nucleation, employing the application of an external electric field during the formation of a protein film and the use of this organized film as nucleation center in the vapor diffusion crystallization. The chicken egg white lysozyme was used as the study model. Through atomic force microscopy images it was possible to confirm the organized structure of these films, and with Fourier transform infrared spectroscopy were observed small changes in protein secondary structure when the electric field was applied. These changes, however, did not compromise the final structure of the protein, allowing an increase in the number of crystals formed, and, in some cases, an improvement in the morphology and size increase of these crystals. The X-ray diffraction analysis indicated an improvement in the quality of the crystalline structure, especially under conditions in which good crystals of lysozyme are traditionally not obtained. Keywords: protein crystallization, protein organized film, lysozyme, nucleation.

As proteínas 14-3-3 formam uma família altamente conservada, expressas em todos os organismos eucariotos já estudados. Através da interação com seus alvos, as proteínas 14-3-3 participam de importantes processos celulares, como controle do ciclo celular, apoptose, transdução de sinal e diferenciação celular. Neste trabalho, essa família gênica foi estudada em Echinococcus granulosus e em Echinococcus multilocularis, as espécies de maior importância do gênero Echinococcus. E. granulosus e E. multilocularis, na fase larval, são agentes etiológicos da hidatidose cística e da hidatidose alveolar, respectivamente, zoonoses associadas a grandes prejuízos na área da pecuária e a gastos no tratamento de pacientes humanos. Por meio da análise dos bancos de dados disponíveis e comparação com os dados genômicos, neste estudo, seis potenciais genes codificadores de proteínas 14-3-3 foram identificados para ambas as espécies, sendo denominados Eg14-3-3 e Em14-3-3 para E. granulosus e E. multilocularis, respectivamente. Análises filogenéticas das sequências preditas de aminoácidos codificadas por esses genes demonstram que as proteínas Eg14-3-3 e Em14-3-3 retêm características ancestrais, não se agrupando claramente com proteínas ortólogas de outros organismos quanto ao tipo de isoforma (zeta e épsilon), como ocorre, por exemplo, em mamíferos. A fim de caracterizar funcionalmente as proteínas Eg14-3-3, o padrão de expressão das isoformas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 foi avaliado. A identificação dessas isoformas em componentes do metacestódeo de E. granulosus que representam interfaces parasito-hospedeiro sugere a possível participação dessas proteínas em mecanismos de interação com o hospedeiro. Estudos para a identificação dos ligantes protéicos que interagem com as proteínas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 também foram realizados. Entre os ligantes identificados estão chaperonas, proteínas associadas à conversão de energia, citoesqueleto, e transporte e metabolismo de carboidratos. Essas interações apontam o envolvimento da família proteica 14-3-3 em mecanismos que promovem o estabelecimento e sobrevivência de E. granulosus. A caracterização das interações identificadas neste estudo poderá auxiliar na elucidação de aspectos biológicos básicos do parasito, e mecanismos moleculares utilizados para o desenvolvimento e manutenção do metacestódeo nas vísceras do hospedeiro intermediário por longo período de tempo. / The 14-3-3 proteins form a highly conserved family, and have been shown to be actively expressed in all eukaryotic organisms studied so far. Through interaction with their targets, the 14-3-3 proteins participate in some of the major eukaryotic cellular processes, such as cell cycle regulation, apoptosis, signal transduction, and cell differentiation pathways. In the present work, this gene family has been studied in two species of the genus Echinococcus, namely Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, which, in their larval stage, are the causative agents of the cystic hydatid disease and the alveolar hydatid disease, respectively, two economically relevant zoonotic diseases associated with livestock production losses and human health care expenditures. Through analysis and comparison of available database, and searches in Echinococcus sequencing genome data, six candidate genes encoding 14-3-3 proteins were identified in both species, being named Eg14-3-3 and Em14-3-3 to E. granulosus and E. multilocularis, respectively. Interestingly, the phylogenetic analyses of deduced amino acid sequences encoded by these genes showed that Eg14-3-3 and Em14- 3-3 proteins retain more ancestral characteristics, and do not group clearly with orthologous proteins from other organisms relative to isoform types (zeta and epsilon), as occurs, for example, in mammals. In order to functionally characterize the Eg14-3-3 proteins, the expression patterns of the Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 isoforms were analyzed. The identification of both isoforms in E. granulosus metacestode components, that represent host–parasite interface, suggests a possible participation of these proteins on mechanisms of interaction with the host. Additionally, studies aiming the identification of proteins able to bind to Eg14-3-3ζ2 and Eg14-3-3ζ3 isoforms were carried out. Among the ligands identified, chaperones, proteins associated with energy production and conversion, cytoskeleton and carbohydrate transport and metabolism, were present, suggesting the involvement of 14-3-3 protein family in mechanisms that promote the establishment and survival of E. granulosus. Further characterization of the interactions identified in this study can help to elucidate basic biological aspects of these parasites, as well as molecular mechanisms involved in the development and maintenance of hydatid cyst in within intermediate host tissues for long time.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-31T21:08:28Z No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-31T21:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T21:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum de tumor cerebral primário em seres humanos adultos, representando aproximadamente 55% dos casos. O processo tumoral desenvolve-se de maneira agressiva e as opções terapêuticas são limitadas. O protocolo de tratamento padrão inclui radioterapia em combinação com temozolomida (TMZ), combinado com excisão cirúrgica quando possível. Apesar de alguns avanços no tratamento de GBM, o tempo de sobrevida dos pacientes diagnosticados com esse tipo de glioma é de aproximadamente 14,5 meses. A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento de genes e está entre as abordagens promissoras para a terapia do câncer. Assim, utilizou-se a metodologia de RNAi para supressão do canal de potássio Ether à go-go 1 (Eag1) em células de glioblastoma da linhagem U-87 MG. Este alvo molecular tem papel relevante na tumorigênese de vários tipos de câncer, auxiliando na proliferação celular e metástases. O estudo realizado na presente dissertação examinou o papel de Eag1 na viabilidade das células de glioma tratadas com TMZ. Inicialmente, realizaram-se ensaios experimentais com concentrações de TMZ (125, 250 ou 500 µM) e pontos temporais (24h, 48h, ou 72h). A viabilidade celular do glioma foi determinada via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). No ponto temporal de 72h e concentração de 250 µM, o fármaco TMZ diminuiu a viabilidade das células em aproximadamente 50%. Com base nesse resultado da curva dose-resposta, estabeleceu-se a concentração do quimioterápico para a execução dos ensaios seguintes. Testaram-se, também, os efeitos do bloqueador de canal de potássio astemizol (ATZ 2,5 µM, 5 µM e 10 µM) ou vetor de expressão de shRNA denominado pKv10.1-3 (0,2 μg) sobre a viabilidade do glioma nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Este vetor expressa grampos curtos de RNA (shRNA) direcionados à sequência de RNAm de Eag1 5'-GTCCACTTGGTCCATGTCCAG-3'. Além disto, avaliou-se os efeitos causados por ATZ 5 µM ou por pKv10.1-3 (0,2μg) em combinação com TMZ 250 µM, no tempo de 72 horas. O tratamento com pKv10.1-3 potencializou, de maneira significativa, a redução na viabilidade celular causada por TMZ sobre células de glioma (77,2% versus 47,9%). Verificou-se, ainda, que a inibição de Eag1 por astemizol (5 µM) ou pKv10.1-3 aumenta a taxa de apoptose causada por TMZ, conforme ensaio de citometria de fluxo. pKv10.1-3 (0,2 µg) reduziu significativamente o conteúdo de RNAm de Eag1, para 0,57 vezes em relação ao valor observado no grupo controle negativo pScramble (0,2 µg), conforme resultado de RT-qPCR. Quanto à proteína Eag1, esta mostrou-se elevada nas células de glioblastoma humano da linhagem U-87 MG. Os tratamentos experimentais causaram redução do conteúdo desta proteína, detectada por imunocitoquímica. Portanto, os dados do presente estudo revelam que Eag1 desempenha papel na viabilidade das células de glioma, além disso, mostraram que a supressão desse canal potencializa a ação da TMZ em células U-87 MG de glioblastoma multiforme. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain tumor in human adults, accounting for about 55% of cases. Tumorigenesis develops aggressively and the therapeutic alternatives remain limited. The standard treatment includes radiotherapy in association with chemotherapy with temozolomide (TMZ) and the surgical excision of tumor tissues. Despite some advances in GBM treatment, the survival time of patients diagnosed with GBM is nearly 14.5 months. RNA interference (RNAi) is a strategy for gene silencing considered a promising approach for cancer treatment. The present study used RNAi to suppress the Ether à go-go 1 (Eag1) potassium channel in U-87 MG glioblastoma cells. Eag1 is an oncological target which plays an important role in tumorigenesis of various cancers, improving cell growth and metastasis. The aim of this study was to examine the role of Eag1 in glioma cells treated with TMZ. First, we tested the effects of TMZ on glioma cell viability, examining drug concentrations (125, 250 and 500 µM) at three time points (24h, 48h and 72h). Cell viability was determined by the 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. At 72h and concentration of 250 µM, TMZ decreased the cell viability in about 50%. Based on this dose-response curve, the drug concentration for the following tests was set up. We also evaluated the effects of astemizole (ATZ, an Eag1channel blocker) at 2.5 µM, 5 µM and 10 µM or a shRNA expression vector named pKv10.1-3 (0.2 µg). This vector expresses short-hairpin RNA (shRNA) targeting the Eag1 mRNA sequence 5'-GTCCACTTGGTCCATGTCCAG-3'. Cell viability was determined at 24, 48 and 72 hours. In addition, we evaluated the effects caused by ATZ 5 µM or by pKv10.1-3 (0.2 µg) in association with TMZ 250 µM, at 72 hours. The vector pKv10.1-3 increased the effect of TMZ on glioma cells (77.2% vs. 47.9%). Also, the Eag1 inhibition by atemizole (5 µM) or pKv10.1-3 increased the apoptosis rate caused by TMZ, as determined by flow cytometry. pKv10.1-3 (0.2 µg) significantly decrease Eag1 mRNA content to 0.57 times in comparison with the value found in pScramble (0,2 µg) control group, as determined by RT-qPCR. Indeed, GBM cells present a high expression of Eag1 protein. The experimental treatments reduced this protein content, as revealed by immunocytochemistry results. In conclusion, the results of this study reinforce that Eag1 plays a role in glioma cell viability. In addition, they show the channel suppression improves TMZ effects on U-87 MG GBM cells.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pos-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:19:24Z : No. of bitstreams: 1 251558.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Elétrica, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-02T16:33:09Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HigordeSRodrigues.pdf: 5051689 bytes, checksum: 15aa9b75d481623dcb07bc2f132b089a (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-12T16:44:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HigordeSRodrigues.pdf: 5051689 bytes, checksum: 15aa9b75d481623dcb07bc2f132b089a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-12T16:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HigordeSRodrigues.pdf: 5051689 bytes, checksum: 15aa9b75d481623dcb07bc2f132b089a (MD5) / Um dos papéis mais importantes da Bioinformática proteômica pode ser descrito como o tratamento do conjunto de dados gerado a partir do sequenciamento de proteínas, construindo de forma eficaz e organizada, informações inteligíveis para os pesquisadores dessa área. Existem diversos bancos de dados de seqüências, como o EMBL, o SwissProt e o UniProt, bem como diferentes programas para realizar buscas por similaridades nestes bancos de dados, como o Mascot, o Fasta, o Blast e AACompIdent. O objetivo deste estudo foi construir um sistema inédito que apresente de maneira probabilística a similaridade entre proteínas que constituem os bancos de dados pré-existentes e os dados experimentais fornecidos pelos pesquisadores. A partir da inserção dos dados, o sistema, chamado Protein Locator, busca as seqüências similares nos programas já existentes, e utiliza o algoritmo QFAST de combinação de pvalores e também o algoritmo PLscore, uma nova versão do QFAST proposto por este estudo, para a combinação de todos os resultados obtidos. Os algoritmos realizam a combinação das probabilidades dos resultados fornecidos pelos programas de identificação e o Protein Locator apresenta ao usuário os valores originais de cada programa e o valor consolidado pela combinação dos resultados, sendo formado pelo identificador da proteína e a probabilidade de erro do match. Para a validação do método de combinação de resultados e do algoritmo PLscore, foram realizadas pesquisas de identificação de 18 conjuntos de dados de experimentos teóricos com proteínas que simularam seu seqüenciamento, análise de composição de aminoácidos e obtenção da lista de massa de peptídeos. Em 9 desses experimentos, foram incluídos desvios laboratoriais e nos outros 9 foram utilizadas as informações completas. Em 14 dos 18 resultados, a combinação dos dados possibilitou o aumento na acurácia do resultado; em 4 casos, não houve mudanças nas conclusões das pesquisas e em nenhum caso houve piora dos resultados. O tempo entre o armazenamento de informações das pesquisas e a espera pelos resultados combinados foi de aproximadamente 30 minutos, bastante inferior ao tempo medido para se realizar um experimento semelhante de forma manual, cerca de 3 horas. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The analysis of protein sequencing data is one of the most important roles of proteomic bioinformatics. In addition, bioinformatics organizes data in an optimized way to be used by researches in this area. There are some protein databases, such as EMBL, SwissProt and Uniprot with software to search for sequencing similarities such as Mascot, Fasta, Blast and AACompIdent. The aim of this study was to create a new system to calculate statistical similarity degree between proteins described in databases and experimental data. The system, called Protein Locator, compares experimental data with sequences through the preexisting software and uses both the QFAST p-value combination algorithm and the PLscore algorithm (a new version of QFAST proposed by this study) to combine results. The algorithms combine probability between the results from the sequences search software and Protein Locator shows the original pvalues from each software, the p-value obtained from results combination, and also the protein identifier and the probability of match. To evaluate the results combination method and the PLscore algorithm, we have used 18 data collections from theoretical experiments in which protein sequencing, analysis of amino acids composition and peptides mass were simulated. In 9 of these experiments, we have included the laboratory error and in the other 9 we have used the complete data. In 14 out the 18 results, data combination method increased accuracy; in the other 4, results were equivalent to those found without combination. Combination of results and protein identification required 30 minutes from laboratory data insertion while manual search would usually require approximating 3 hours.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-04T19:03:56Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 1916877 bytes, checksum: d700ddf73df00f0f92fbe08e9c73d637 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-16T14:49:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 1916877 bytes, checksum: d700ddf73df00f0f92fbe08e9c73d637 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-16T14:49:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 1916877 bytes, checksum: d700ddf73df00f0f92fbe08e9c73d637 (MD5) / A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de peptídeos que exercem sua atividade modulando canis iônicos de membranas biológicas. O presente projeto teve como objetivo central realizar a análise proteômica da peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus. Tal espécie é capaz de produzir acidentes moderados e graves em humanos, no entanto existe pouca informação disponível relacionada aos componentes desta peçonha. A peçonha foi obtida por estimulação elétrica aplicando-se 5 impulsos de 50 V em cada escorpião, liofilizada e armazenada a -20oC. Diferenças significativas na produção de peçonha entre machos e fêmeas e também entre fêmeas grávidas e não-grávidas foram observadas. A peçonha bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC usando coluna C8 (4.6 x 250 mm) e 43 frações foram eluídas, coletadas e secadas a vácuo. Todas essas frações foram analisadas por MALDI-TOF/MS e detectou-se 91 componentes com massas moleculares distintas. A peçonha de C. margaritatus apresenta 54% de suas toxinas no intervalo de massas moleculares de 2,5 a 6,0 kDa, no qual estão incluídas as toxinas de cadeia curta bloqueadoras de canais para potássio; 13% do total encontram-se no intervalo de 6,5 até 8,0 kDa que corresponde ao grupo das toxinas moduladoras de canais para sódio voltagem-dependentes. Finalmente, 33% dos componentes presentes na peçonha de C. margaritatus são pequenos compostos com 2,0 kDa que fazem parte de um grupo de moléculas raramente descrito nas peçonhas de escorpiões. Também foram isolados e caracterizados quimicamente dois novos peptídeos: a margatoxina 2 (MgTx2), com 24 resíduos de aminoácidos (MM = 2,6 kDa) e três pontes dissulfeto, pertencente à família das das -KTx e a margatoxina 3 (MgTx3) com 30 resíduos de aminoácidos (MM = 3,38 kDa) e três pontes dissulfeto. Trata-se de uma molécula inédita, sem similaridade com outras descritas na literatura. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Scorpion venoms are a complex mixture of peptides that exert their action via ion-channel modulation in biological membranes. The central objective of this project was to perform the proteomic characterization of the venom from the Colombian scorpion Centruroides margaritatus. This species is capable of producing moderate accidents and serious complications in humans, but little information is available related to its components. The venom was obtained by mild electrical stimulation method, applying 5 impulses of 50 V in each scorpion. It was observed differences in the production of the venom between males and females and also between pregnant and not-pregnant females. The crude venom was fractioned by RP-HPLC using a C8 column (4.6 x 250 mm) and 43 fractions were collected and vacuum dried. All these fractions were analyzed by MALDI-TOF/MS and 91 distinct compounds had their molecular masses characterized. The venom of C. margaritatus exhibits 54% of their toxins in the molecular mass range from 2.5 to 6.0 kDa that probably includes short-chain K+ channel blockers; 13% of the total are in the range from 6.5 to 8.0 kDa and may include long-chain Na+ channel toxins. Finally, 33% of the components present in C. margaritatus venom are peptides smaller than 2.0 KDa, a group rarely described in scorpions venoms. Two novel peptides were purified and chemically characterized: margatoxin 2 (MgTx2), 24 amino acids long (MM = 2,6 kDa) and three disulfide bridges, belonging to the -KTx family and margatoxin 3 (MgTx3), 30 amino acids long (MM = 3,38 kDa) and three disulfide bridges, with no significant similarities to other scorpion neurotoxins described.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-09-11T20:09:07Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) / Approved for entry into archive by Luis Felipe Souza Silva(luis@bce.unb.br) on 2009-09-21T17:29:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-21T17:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os neutrófilos huμanos são celulas já diferenciadas do sangue periférico, constituindo 40−70% dos leucócitos na circulação em condições normais. É o o primeiro tipo celular a atingir o local da infecção. Eles possuem 3 fenótipos diferentes: quiescente, estimulado e ativado. Várias moléculas pró−inflamatórias podem causar estimulação e ativação dos neutrófilos, incluíndo o mediador lipídico pró−inflamatório PAF. O PAF tem potentes efeitos diretos sobre o neutrófilo e pode induzir quimiotaxia, polimerização de actina, produção de ROS em pouca quantidade e agregação, além de outras ações de estimulação. Nesse estudo, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico de voluntários sadios, obtidos após centrifugação do sangue total pelo gradiente de percoll (pureza > 97% e viabilidade > 98%). 107 células foram estimuladas com 20 nM de PAF por 30 minutos. As análises citométricas mensuraram a explosão respiratória, viabilidade e pureza dos neutrófilos. Foram preparados géis bidimensionais de extratos de neutrófilos quiescentes e estimulados por PAF, comparados seus mapas proteômicos e identificadas proteínas por PMF e MS/MS. A análise comparativa dos géis 2D entre as condições revelou 108 spots com expressão diferencial, sendo que 66 spots representam um aumento na expressão protéica após estimulação pelo PAF e 42 representam diminuição (p•0,05). Além disso, 114 spots foram considerados como pertencentes apenas ao mapa do gel quiescente e 129 spots exclusivos do mapa neutrofílicos estimulados por PAF. Forμa identificados 50 proteínas, sendo 3 coμ auμento de expressão após estiμulação, 2 coμ diμinuição de expressão, 1 exclusiva da condição quiescente e 42 sem expressão diferencial. Proteínas coμ aumento de expressão foraμ: vimentina, filamento interμediário, uμ coμponente do citoesqueleto; tubulina beta, uμa proteína presente nos μicrotúbulos, também considerada uμ componente do citoesqueleto e SNAP− , uma proteína envolvida no processo de fusão dos grânulos à μeμbrana plasμática. Proteínas que diμinuíraμ a expressão: subunidade 5 da Arp 2/3, proteína que muda a direção da polimerização da actina e proteína S10A9−humana com possível função quimiotática. Proteína exclusiva: anexina A5 inibe a ação da fosfolipase A2. O presente estudo representa uma importante etapa para se coμpreender as vias de estimulação dos neutrófilos durante o processo inflamatório. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Human neutrophils are differentiated cells in peripheral blood, which constitute 40 70% of circulating white blood cells, counted under normal conditions. Neutrophils are the first cells recruited froμ the bloodstream to sites of infection. These cells exhibit three different phenotypes: quiescent, priμed and activated. Several proinflammatory molecules can induce the primed and activated state, including the PAF. The PAF, a proinflammatory lipid mediator, has potent direct effects on eutrophils and can induce chemotaxis, actin polymerization, production of small amount of ROS and aggregation, and other priming−type actions. In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (> 97% purity, > 98% viability) and were obtained by density centrifugation on Percoll gradient. 107 cells were stimulated with 20 nM PAF for 30 minutes. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity of neutrophils. Quiescent and PAF stimulated neutrophils were submitted to two−dimensional electrophoresis to, compare their proteomic map and to identify proteins by PMF and MS/MS. The comparison between the two conditions revealed 108 spots differentially expressed, among which 66 spots were upregulated after PAF stimulation and 42 were downregulated in this condition (p•0,05). Moreover, 114 spots were regarded as belonging only to quiescent gels, and 129 spots were exclusive of the PAF stimulated neutrophil map. We identified 50 proteins, 3 with increased expression after stiμulation, 2 with decreased expression, 1 exclusive of the quiescent condition and 42 without differential expression. Proteins with increased expression were: vimentin, the intermediate filament, classified as a coμponent of the cytoskeleton; tubulin beta, present in μicrotubules, also a component of the cytoskeleton; and SNAP− , involved in the fusion of granules to the plasma membrane. Proteins that decreased expression: complex Arp2/3 subunit 5, a protein that changes the direction of polymerization of the actin and S10A9−Human, a protein with a possible chemotactic function. Protein exclusive: annexin A5, that inhibits the action of phospholipase A2. This study presents a further step towards the understanding of stiμulation pathways in neutrophils during an inflammatory process.

A hiperamonemia é o principal elemento na patogênese da encefalopatia hepática e a neurotoxicidade da amônia envolve um efeito no sistema de neurotransmissão glutamatérgica. Os astrócitos são intimamente relacionados com a transmissão glutamatérgica e, de fato, muitas alterações gliais específicas têm sido relatadas devido à exposição à amônia. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como um parâmetro de ativação glial em diversas situações de injúria cerebral. Entretanto, existe pouca informação sobre essa proteína na toxicidade da amônia e nada se sabe sobre a sua secreção por astrócitos durante uma exposição à amônia. Nesse trabalho, nós investigamos a secreção de S100B em astrócitos corticais de ratos expostos de forma aguda à amônia, bem como a morfologia astrocítica, o imunoconteúdo da proteína fibrilar ácida glial (GFAP) e a atividade da enzima glutamina sintetase (GS). Além disso, investigamos um possível efeito da creatina nesses parâmetros gliais, devido a esse composto ter um suposto papel contra a toxicidade da amônia em culturas celulares. Encontramos um aumento da secreção de S100B em astrócitos expostos por 24 h à amônia, acompanhado de uma redução do imunoconteúdo de GFAP e da atividade da GS. Como elevados e persistentes aumentos extracelulares de S100B têm um efeito tóxico em células neuronais, a secreção alterada de S100B induzida pela amônia pode contribuir para o dano cerebral observado na encefalopatia hepática. A adição de creatina não impediu esse aumento na secreção de S100B, mas foi capaz de impedir a redução da concentração de GFAP e da atividade da GS induzidas pela exposição à amônia. / Hyperammonemia is a major element in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) and ammonia neurotoxicity involves an effect on the glutamatergic neurotransmitter system. Astrocytes are intimately related to glutamatergic neurotransmission and, in fact, many specific glial alterations have been reported due to ammonia exposure. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury. However, there is little information about this protein in ammonia toxicity and none about its secretion in astrocytes under ammonia exposure. In this study we investigated S100B secretion in rat cortical astrocytes acutely exposed to ammonia, as well astrocyte morphology, glial fibrillary acidic protein (GFAP) content and glutamine synthetase (GS) activity. Moreover, we studied a possible effect of creatine on these glial parameters, since that this compound has a putative role against ammonia toxicity in cell cultures. We found an increase in S100B secretion by astrocytes exposed to ammonia for 24 h, accompanied by a decrease in GFAP content and GS activity. Since elevated and persistent extracellular S100B plays a toxic effect on neural cells, altered extracellular content of S100B induced by ammonia could contribute to the brain impairment observed in HE. Creatine addition did not prevent this increment in S100B secretion, but was able to prevent the decrease in GFAP content and GS activity induced by ammonia exposure.