Orientadora : Profª. Drª. Elaine Machado Benelli / Coorientadora : Profª. Drª. Cecília Fabiana da Gama Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/03/2017 / Inclui referências : f. 33-34 / Resumo: A análise estrutural de proteínas é uma ferramenta de grande importância na biologia moderna, uma vez que possibilita o estudo do mecanismo de ação de diversas doenças e o desenvolvimento de novos medicamentos. Atualmente, a principal técnica utilizada no estudo da estrutura tridimensional de proteínas é a cristalografia de raios-X, sendo responsável pela resolução de cerca de 90% das estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB). Contudo, a difração de raios-X requer a obtenção de um cristal de proteína de alta qualidade. A cristalização de proteínas é um processo que exige condições específicas, envolvendo uma transição de fase na qual as moléculas de proteína deixam de ser solúveis e passam a formar núcleos organizados. Assim, esse processo é limitado pela nucleação, que requer o choque ordenado das moléculas de proteína para dar início ao crescimento do cristal. Esta, por sua vez, necessita que seja atingida a supersaturação das proteínas em solução. Para atingir essa condição utiliza-se mais comumente a técnica de difusão de vapor, na qual ocorre um aumento de concentração de proteína na gota por meio da difusão lenta de água para um reservatório com maior concentração salina. Quando a condição de supersaturação for atingida muito rapidamente, forma-se um precipitado amorfo em vez de cristais ordenados. Além disso, um nível de saturação muito alto pode levar a formação de inúmeros núcleos, desfavorecendo o crescimento dos cristais e prevalecendo cristais pequenos e de baixa qualidade. Na literatura são propostas diversas alternativas para facilitar a nucleação e crescimento dos cristais, que demandam concentrações menores de proteína e menos tempo. Uma alternativa comum é a chamada nucleação heterogênea, em que o meio cristalizante é semeado com materiais minerais ou orgânicos, como micro-cristais da própria proteína. Outra alternativa é a utilização de um campo elétrico, magnético ou eletromagnético para promover a organização das moléculas na solução de proteína. No entanto, muitas dessas metodologias ainda apresentam limitações, sobretudo com relação a qualidade dos cristais formados. Neste contexto, o presente trabalho apresenta uma nova abordagem para promover a nucleação, empregando a aplicação de um campo elétrico externo durante a formação de um filme protéico e a utilização deste filme organizado como centro de nucleação na cristalização por vapor-difusão. Como modelo de estudo foi utilizada a lisozima de clara de ovo de galinha. Através de imagens de microscopia de força atômica foi possível confirmar a estrutura organizada destes filmes e, por espectroscopia de infra-vermelho por transformada de Fourier foram verificadas pequenas alterações na estrutura secundária da proteína diante da aplicação do campo elétrico. Essa alterações, contudo, não comprometeram a estrutura final da proteína, permitindo um aumento no número de cristais formados, e, em alguns casos, uma melhora da morfologia e aumento do tamanho destes cristais. A análise por difração de raios-X indicou uma melhoria na qualidade da estrutura cristalina, sobretudo em condições nas quais tradicionalmente não se obtêm bons cristais de lisozima. Palavras-chave: cristalização de proteínas, filme organizado de proteína, lisozima, nucleação. / Abstract: Structural analysis of proteins is a tool of great importance in modern biology, since it allows the study of the mechanism of action of several diseases and the design of new drugs. Nowadays, the main technique used in the study of the three-dimensional structure of proteins is X-ray crystallography, being responsible for the resolution of about 90% of the structures deposited in the Protein Data Bank (PDB). However, X-ray diffraction requires a protein crystal of high quality. The protein crystallization is a process that demands specific conditions involving a transition phase in which protein molecules are no longer soluble and start to form organized nuclei. Thus, this process is limited by nucleation, which requires ordered shock of protein molecules to initiate crystal growth. This, in turn, needs to achieve supersaturation of proteins in solution. In order to reach this condition, the technique of vapor diffusion is used, in which an increase of protein concentration in the drop occurs through the slow diffusion of water to a reservoir with higher salt concentration. When the supersaturation condition is reached very quickly, an amorphous precipitate is formed instead of ordered crystals. In addition, a very high saturation level can lead to the formation of numerous nuclei, disfavoring the growth of crystals and prevailing small and low quality crystals. In the literature, several alternatives are proposed to facilitate nucleation and crystal growth, requiring lower protein concentrations and less time. A common alternative is the so-called heterogeneous nucleation, where the crystallizing medium is seeded with mineral or organic materials, such as microcrystals of the protein itself. Another alternative is the use of an electric, magnetic or electromagnetic field to promote the organization of molecules in the protein solution. However, many of these methods still have limitations, especially regarding to the quality of the crystals formed. In this context, the present work presents a new approach to promote nucleation, employing the application of an external electric field during the formation of a protein film and the use of this organized film as nucleation center in the vapor diffusion crystallization. The chicken egg white lysozyme was used as the study model. Through atomic force microscopy images it was possible to confirm the organized structure of these films, and with Fourier transform infrared spectroscopy were observed small changes in protein secondary structure when the electric field was applied. These changes, however, did not compromise the final structure of the protein, allowing an increase in the number of crystals formed, and, in some cases, an improvement in the morphology and size increase of these crystals. The X-ray diffraction analysis indicated an improvement in the quality of the crystalline structure, especially under conditions in which good crystals of lysozyme are traditionally not obtained. Keywords: protein crystallization, protein organized film, lysozyme, nucleation.

Resumo: A cristalização da lisozima sobre a superfície de grade de cobre revestida com filme fino de carbono bacteriano(GC) para microscopia de transmissão foi analisada por microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A lisozima é uma proteína globular, que atua como enzima antibacteriana, hidrolisando uma porção da parede celular de algumas bactérias, sendo assim conhecida como um antibiótico natural. A solução da lisozima foi depositada por diferentes métodos sobre a superfície de GC. Além da deposição da solução de lisozima, foram também utilizadas nano partículas (NP) de ouro como nucleantes. Os cristais formados com e sem NP de Au e em diferentes concentrações, foram analisados por MET e por MFA. As imagens topográficas de MFA não mostram diretamente as NP de Au, devido a irregularidade da superfície da GC, comprometendo o uso do MFA nesta análise. A análise de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL) da solução de lisozima mostra aglomerados com dimensões comparáveis com unidades protéicas, sugerindo que não ocorre cristalização antes da deposição na GC. A análise das imagens de difração de elétrons obtidas por MET sugerem que houve formação de cristais de lisozima com parâmetros de rede a=3,1nm, b= 5,25nm e c= 8,9 nm. O maior número de cristais tanto na forma monocristalina, quanto policristalina ocorreu nos filmes preparados com NP de Au e com baixas concentrações (10 M) de proteína e menores tempo de incubação.

Orientadores: Marcelo Cristianini, Gil Eduardo Serra / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-01T10:29:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franchi_MarkAlexandrow_M.pdf: 26438409 bytes, checksum: 7cf5137e23516bd055c4308d791b2964 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Foi testada a ação dos bioprotetores nisina (Novasin), lisozima (Novagard), e Microgard 400 (produto comercial obtido de fermentação de bactérias láticas) sobre bactérias contaminantes da indústria sucro-alcooleira e sobre a levedura Saccharomyces cerevisiae. Utilizou-se o método de concentração mínima inibitória (MIC) em meio líquido ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: The inhibition by bioprotectants, nisin (Novasin), lysozyme (Novagard), and Microgard 400 (commercial product obtained by lactic fermentation), was tested over contaminant bacteria and yeast (Saccharomyces cerevisiae) ftom ethanol distilleries and sugar mills. The method used was the minimum inhibitory concentration test (MIC) in broth ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Telma Teixeira Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-25T10:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MariaEstelada_D.pdf: 6869313 bytes, checksum: e25d368e00276aa7116f957184aa768c (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Este trabalho visou estudar o emprego de ligantes de afinidade para extração e purificação de diferentes enzimas por partição em sistemas de duas fases aquosas (SDF A). O emprego de ligantes específicos em um estágio inicial de um processo extrativo visa reduzir o número de etapas do mesmo, pois ao aumentar a seletividade e especificidade de uma operação, as próximas são diretamente beneficiadas pela redução de carga do material contaminante. Inicialmente foram investigados métodos de ativação química do polietilenoglicol (PEG) com o intuito de torná-lo mais reativo para o acoplamento da molécula do ligante. Foram usados dois métodos de ativação deste polímero: com cloreto de tresila e com cloreto de tionila. Para ativação com cloreto de tresila, o rendimento obtido foi de 74%, determinado pela análise do enxofre elementar, enquanto que para a ativação com cloreto de tionila, o rendimento obtido foi de 86% (p/p) (capítulo 7). Um estudo para extração e recuperação da f3-galactosidase de diferentes origens microbianas: Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae e Escherichia co/i foi então realizado (capítulo 3) e foi observado que somente a 13galactosidase de Escherichia coli era coletada na fase superior em sistema formado por PEG 4000 15% e fosfato 13,6% (coeficiente de partição, K = 52). As demais 13galactosidases eram sempre particionadas em direção à fase inferior salina juntamente com as principais proteínas contaminantes, impossibilitando a separação e purificação. Com o objetivo de separar a f3-galactosidase das outras proteínas, um processo específico de partição por afinidade foi desenvolvido, o qual consistiu de duas etapas: acoplamento específico da enzima ao ligante e rompimento desta interação. Para eficiente separação entre a f3-galactosidase de Kluyveromyces fragilis e os contaminantes protéicos foi desenvolvido um processo em duas etapas, aonde a primeira utiliza o ligante APGP (paminofenil-f3-D-tiogalactopiranosídeo). Os sistemas usados foram formados, na primeira etapa (acoplamento da enzima), por PEG 4000-APGP 6% e dextrana 505.000 8% e na segunda etapa (desacoplamento da enzima) por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. Na primeira etapa de purificação, o K da ?-galactosidase teve um aumento de aproximadamente 2.800 vezes com o uso do PEG-APGP, apresentando recuperação de 55% da enzima na fase polimérica do sistema PEG-APGP/dextrana e a segunda etapa da purificação da enzima foi realizada em sistema formado por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. mostrando-se altamente eficiente na reversão do K da enzima ?-galactosidase para a fase oposta. O valor do coeficiente de partição foi de 2,2 x 10-5 com 39% de recuperação da enzima na fase salina (capítulos 3 e 4). Com o intuito de investigar a capacidade do polímero de afinidade PEG-IDA-CU2+ em extrair proteínas nos SDF A, a partição da lisozima proveniente de clara de ovo e da peroxidase de soja foi investigada (capítulos 5 e 6). A lisozima de clara de ovo de galinha foi utilizada como enzima modelo nos estudos preliminares em sistemas de afinidade contendo o complexo PEG-IDA-Cu2+. Esta enzima possui um resíduo de histidina disponível na sua superfície, tornando viável sua extração neste tipo de sistema, já que um resíduo de histidina é suficiente para formar o complexo enzima-metalo-ligante. As concentrações empregadas foram de PEG 4000 13% e fosfato de potássio 9% (p/p), pH 7,0 nos SDF A sem o ligante. Em sistemas de afinidade, as concentrações do PEG-IDA-Cu2+ foram de 1, 5 e 10% e as concentrações de PEG 4000 foram de 12, 8 e 3%, respectivamente, sendo que a concentração do fosfato permaneceu em 9%. O valor do coeficiente de partição, K, foi aumentado 9 vezes quando PEG-IDA-Cu2+ foi usado nos SDF A de afinidade, sendo possível recuperar 51 % da lisozima. Para recuperação da peroxidase de soja, Glycine max, o metalo-ligante cobre (Cu2l foi acoplado ao complexo PEG-IDA, formador da fase polimérica do sistema. Duas etapas foram suficientes para a recuperação da peroxidase usando sistemas de afinidade. Na primeira etapa da extração, o sistema foi composto por PEG-IDA-CU2+ 14% e sulfato de sódio 8% para o acoplamento da enzima e na segunda etapa, um sistema constituído de PEG-IDA-CU2+ 14% e fosfato 10% foi usado para o desacoplamento da enzima, a qual foi recuperada na fase salina. Obteve-se um aumento de K de 24 vezes e recuperação maior que 109% da enzima, quando o sistema de afinidade foi usado. Na etapa de desacoplamento da enzima obteve-se 64% de recuperação. A fase polimérica foi recic1ada e usada num sistema contendo PEG-IDA-Cu2+ 14% e sulfato de sódio 8%, obtendo-se um K = 23, com recuperação de 85% da peroxidase / Abstract: In this work the extraction and purification of f3-galactosidase from different species and soybean peroxidase (Glycine max) in aqueous two-phase systems (ATPS) by bioaffinity were studied. The synthesis of affinity polymers to recover this enzyme was also studied. Initially the extraction of f3-galactosidase from Kluyveromyces Iactis, from Kluyveromyces fragi/is, from Aspergillus oryzae and from Escherichia co/i was compared. It was observed that only the f3-galactosidase from Escherichia colí partitioned to the top phase in. a system formed of 15% PEG 4000 and 13.6% phosphate (partition coefficient, K = 52). f3-galactosidases from other sources partition into the bottom salt-rich phase, together with the main contaminant proteins, preventing separation and purification. The specific ligand APGP (p-aminophenyl 1-thio-f3-D-galactopyranoside) is an inhibitor of f3-galactosidase, and it was attached to polyethylene glycol (pEG). Two methods of activation were used: activation with tresyl chloride and with tionyl chloride. The yield for activation of tresyl chloride was 74%, determined by elementary sulphur analysis, and the yield for activation with tionyl chloride was 86%. A new two-step method for extraction and purification of the enzyme f3-galactosidase from Kluyveromyces fragilís was then developed. In the first step, an affinity system composed of 6% PEG 4000-APGP and 8% dextran 505 was used, where f3-galactosidase primarily partitioned toward the top phase (K 2,330). In the second step, a system formed of 13% PEG-APGP and 9% phosphate salt was used to revert the value of the partition coefficient, K, of f3-galactosidase to 2 x 10-5, thereby achieving the purification and recovery of39% of the enzyme in the bottom salt-rich phase. The extraction of the model protein lysozyme from chicken egg white was studied by affinity in systems with the complex PEG-IDA-CU2+. This enzyme has a histidine residue available on its surface, making possible its recovery in this system. Metal affinity partitioning in ATPS is a useful tool to extract the proteins which have accessible histidine, cysteine or tryptophan on their surfaces. Partitioning of lysozyme in a PEG 4000/phosphate system, pH 7.0, was studied in the presence and in the absence of PEG-IDA-CU2+. The composition of systems without ligands was 13% PEG 4000 + 9% phosphate, and the affinity systems had correspondent amounts of PEG 4000 replaced by 1%, 5% and 10% of PEG-IDA-CU2+. The partition coefficient, K, of the lysozyme increased ninefold when 5% PEG-IDA-CU2+ was used, and 45% of the enzyme was recovered in the top ligand-rich phase of the system. This is a pioneer work on liquid-liquid extraction of lysozyme in ATPS with PEG-IDA-CU2+. Then the extraction of peroxidase from a crude extract of defatted soybean peroxidase (Glycine max) by metal affinity in an ATPS was studied. A two-step liquid liquid extraction process using metalligand was developed aiming to purify the peroxidase. In the first purification step, the system was composed of 14% PEG 4000-IDA-CU2+ and 8% Na2S04and the peroxidase partitioned mainly to the top phase (K = 24). In the second step, a system formed of 14% PEG 4000 and 10% phosphate was used to revert the value of the partition coefficient of peroxidase to the bottom salt-rich phase (K = 0.05), providing the purification and recovery of 64% of the enzyme. The top PEG 4000-IDA-CU2+ -rich phase was washed by ultrafiltration in order to remove the sulphate salt and reused in another cycle of peroxidase purification. Only two steps were enough to recover the enzymes f3-galactosidase and peroxidase in the ATPS by bioaffinity / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La administración de biomacromoleculas ha tomado gran importancia en el último tiempo, haciendo necesaria nuevas formas de administración. Como vehículos para estas nuevas estrategias, nanoemulsiones y nanocapsulas han dado resultados prometedores, pudiendo entregar y proteger diversas biomacromoleculas. Sin embargo, aún falta un estudio sistemático de formulaciones para comprender los efectos de las distintas variables de formulación. En esta tesis se han estudiado diferentes formulaciones en cuanto a sus características fisicoquímicas, estabilidad y capacidad de carga de una enzima modelo (lisozima). Formulaciones seleccionadas fueron caracterizadas en cuanto a sus propiedades de liberación de la enzima, y su actividad e integridad posterior a la liberación fue caracterizada Condiciones para la obtención de formulaciones estables, con tamaño de partícula y polidispersidad aceptables fueron definidas. En formulaciones seleccionadas, se pudo aumentar la capacidad de carga con alta eficiencia de encapsulación y con una variedad de perfiles de liberación. Sólo algunas formulaciones lograron mantener niveles de actividad y configuración secundaria adecuados. Finalmente, se identificaron la cantidad de lecitina y la presencia del recubrimiento polimérico como los factores más importantes dentro de las variables de formulación que permitieron una formulación optimizada / Biomacromolecule administration has gained importance over past years raising the need for new administration strategies. As such, nanoemulsions and nanocapsules have given promising results, being able to carry and protect diverse biomacromolecules. However, the field still lacks a systematic study of formulations in order to optimize their use. In this thesis, a variety of formulations have been studied in terms of physicochemical properties, stability and loading capacity of a model enzyme. Selected formulations were then characterized for their lysozyme release properties, activity and enzyme integrity was also characterized after release. Conditions for achieving stable formulations with adequate size and polydispersity properties were determined. Lysozyme loading was enhanced with high encapsulation efficiency and a variety of release profiles. Only some formulations were able to maintain their activity and secondary structure after release. Finally, the amount of lecithin and the use of a polymeric coating were identified as the most important formulation variables leading to an optimized formulation

Tesis para optar al grado de Ingeniera Agrónoma. Tesis para optar al grado de Magister en enología y vitivinicultura / Esta investigación tuvo por objetivo establecer si el uso de lisozima afectaba las características químicas, físicas y sensoriales en un vino Carménère. Este vino en estudio contó con la aplicación de microoxigenación y guarda con duelas de roble americano como parte de su elaboración. Se quiso establecer si al utilizar lisozima ésta aumentaba la estabilidad colorante y además la polimerización de taninos. Las muestras de vino del cv. Carménère, provenientes de la Bodega Patacón del Consorcio Surandino, se almacenaron en cubas de acero inoxidable de 1000 litros. Se utilizó un testigo tratado con una dosis de anhídrido sulfuroso y otras dos muestras a las cuales se les aplicó dos dosis diferentes de lisozima (30 y 60 g/hL respectivamente) realizando análisis básicos como: acidez titulable, pH, acidez volátil, anhídrido sulfuroso libre y total y azúcares reductores; análisis de polifenoles tales como: fenoles totales, antocianos totales, taninos totales, índice de gelatina, fraccionamiento de taninos; y análisis de la fracción colorimétrica como: intensidad colorante, matiz, espacio Cielab y copigmentación. Se observó que el vino tratado con la menor dosis de lisozima, efectivamente aumenta la estabilidad del color. Esto se demostró por la correlación positiva entre el análisis de intensidad colorante y el análisis de copigmentación (r= 0,62; p-valor<0,05). La aplicación de microxigenación complementada con el uso de duelas de roble genera una disminución de antocianos totales, pero a su vez permite aumentar la estabilidad de éstos, ya que ayuda a incrementar el porcentaje de antocianos combinados a taninos. Esto se ve reflejado en el tratamiento 2, que fue el que presentó un mayor porcentaje de la fracción polimérica, es uno de los tratamientos en donde se utilizó una dosis de lisozima de 30 g/hL lo que llevaría a concluir que esta dosis sería la adecuada para su uso en bodega. Por otra parte el uso de lisozima, que conlleva a una mayor formación de estructuras de polímeros pigmentados, no afecta la calidad sensorial del vino tratado con éste producto respecto al tratamiento testigo (con adición de anhídrido sulfuroso). / This research aimed to establish whether use of lysozyme affected the chemical, physical and sensory features in a Carménère wine. This wine had studied the application of microoxygenation and aging with American Oak staves as part of their elaboration. It was intended establish whether using lysozyme increased colorant stability and also the tannins polymerization. The wine samples of cv. Carménère from the Patacón Winery of Surandino Consortium were stored in stainless steel tanks of 1000 liters. It was used a control sample treated with a dose of sulfur dioxide and another two samples which were applied two different doses of lysozyme ( 30 and 60 g/hL respectively) making basics analyses such as: titratable acidity, pH, volatile acidity, free and total sulfur dioxide and residual sugars; phenolic analyses such as: total phenols, total anthocyanins, total tannins, gelatine index, tannin fractionation; and colorimetric fraction analyses such as: color intensity, hue, Cielab space and copigmentation. It was observed that the wine treated with lower dose of lysozyme, in fact increases the color stability. This was demonstrated by the positive correlation between the color intensity and copigmentation analyses (r= 0,62; pvalue< 0,05). The microoxygenation application complemented with the use of oak staves contributes to the decrease in total anthocyanins, but allows the stability of these because it helps to increase the percentage of anthocyanins combined with tannins. This has shown in treatment 2, which was the one who presented the highest polymeric fraction percentage, it is one of the treatments where it was used a 30 g/hL lysozyme dose, thereby leading to conclude that this dose would be appropriate for use in winery. On the other hand the lysozyme use, which leads to increased formation of pigmented polymer structures, it doesn’t affect the sensory quality of wine treated with this product than the control (with sulfur dioxide addition).

Orientador : Oswaldo E. S. Godinho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-16T16:17:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaimundoJunior_IvoMilton_M.pdf: 3578327 bytes, checksum: 005ed43688101e128c8f4be9bc35d173 (MD5) Previous issue date: 1989 / Mestrado

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-08-15T04:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347193.pdf: 1701462 bytes, checksum: 4cd6598364a47d68d0095f13199c3a91 (MD5) Previous issue date: 2017 / As enzimas, são catalisadores biológicos de várias reações bioquímicas por possuírem natureza principalmente proteica e apresentam uma grande especificidade pelo substrato. A lisozima é de particular interesse para o uso em sistemas alimentares, uma vez que é uma enzima que ocorre naturalmente com atividade antimicrobiana, possui ampla disponibilidade e um conhecimento detalhado de suas propriedades, moleculares, incluindo sequência e estrutura. Tratamento de enzimas com base em mudanças de temperatura e pressão, aplicação de ultrassom e de pulsos elétricos podem ser responsáveis por modificações nas suas propriedades e o resultado dessa mudança geralmente é um impedimento ou dificuldade de fixação do substrato na enzima. A aplicação de campos magnéticos, uma tecnologia de simples operação, baixo custo e mínimo impacto ambiental, vem sendo testado como meio de intensificar processos enzimáticos, uma vez que trabalhos na literatura relatam um aumento da atividade e estabilidade de certas enzimas tratadas por campos magnéticos. No entanto, estes trabalhos ainda são escassos e limitados, contemplando poucas enzimas, sendo que a maioria avalia apenas a atividade catalítica da enzima alvo sem estudar os mecanismos de ação do campo magnético e as possíveis alterações estruturais após o tratamento. Neste contexto, nesse trabalho teve-se por objetivo avaliar o efeito do campo magnético e das condições operacionais na atividade catalítica da lisozima da clara de ovo, uma proteína bastante utilizada como modelo pela ampla disponibilidade e conhecimento detalhado sobre sua estrutura nativa. Foram avaliados os efeitos do pH, forca iônica e densidade de fluxo magnético sobre a atividade catalítica desta enzima. O pH e o campo magnético apresentaram efeito significativo sobre a atividade da lisozima, sendo que, o uso do pH na faixa alcalina mais extrema (13,7) e de campo magnético de maior densidade de fluxo magnético (1,34 T) permitiram uma atividade específica residual de 212%, ou seja, um incremento de três vezes a atividade específica da enzima. Os resultados sugerem que a ativação de lisozima causada pelo tratamento magnético pode estar relacionada com as alterações no teor de a-hélice na estrutura secundária, e com o incremento do tamanho de partícula médio, facilitando o acesso do substrato ao sítio ativo da enzima. As modificações do estado natural da lisozima, função do pH e força iônica nas soluções, resultaram num aumento do tamanho de partícula médio e pequenas alterações do potencial zeta.<br> / Abstract : Enzymes are biological catalysts involved in many biochemical reactions due mainly to their protein nature and because they present a great specificity for the substrate. The lysozyme is of particular interest for the use in food systems, once it is an enzyme with antimicrobial activity, it possesses a wide availability and detailed knowledge of its molecular properties, including sequence and structure. Enzymes treatment involving temperature and pressure changes, applications of ultrasound and electrical pulses can be responsible for modifications in its properties and the result of such changes are usually associated with stereo impediment or difficulty in substrate - enzyme interaction. The application of magnetic fields, a technology of simple operation, low cost and minimal environmental impact, is being tested as a way to intensify enzymatic processes, since literature reports an increase in activity and stability of certain enzymes treated by magnetic fields. However, these papers are still scarce and limited, contemplating few enzymes, and the majority evaluates only the catalytic activity of the target enzyme without studying the mechanisms of action and the possible structural changes after the treatment. In this context, this work aims to evaluate the effects of the magnetic field and the operational conditions on the catalytic activity of the egg white lysozyme, a protein very used as a model for its wide availability and detailed knowledge about its native structure. The pH and the magnetic field showed a significant effect on lysozyme activity at the highest pH value for the most strongly alkaline range (13.7) and a magnetic field with the highest magnetic flux density (1.34 T) allowed to achieve a residual specific activity of 212%, i.e. an increase of three times the original specific activity of the enzyme. The results suggest that the activation of lysozyme caused by the magnetic treatment may be related to the changes of the a-helix content in the secondary structure, and with the average particle size increase, facilitating the substrate access to the enzyme active site. As changes in the natural state of lysozyme pH function and the ionic strength in the solutions resulted in an increase of the average particle size and small changes on the zeta potential.

Orientadores: Everson Alves Miranda, Carlos Eduardo Calmanovici / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T03:20:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernardo_Andre_M.pdf: 2864644 bytes, checksum: f4f594dd6e89725fcb4c67d65b5ec1c1 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A cristalização de proteínas tem sido tradicionalmente aplicada como uma técnica de apoio a estudos cristalográficos, sendo referida muitas vezes como uma arte mais do que uma ciência. A cristalização como uma operação de recuperação e purificação de bioprodutos (RPB) tem sido sub-utilizada devido principalmente à carência de parâmetros cinéticos e termo dinâmicos que auxiliem no projeto adequado de processos industriais. Neste contexto, o tempo de indução, definido como o tempo transcorrido desde o estabelecimento da supersaturação até a formação e crescimento a um tamanho detectável dos núcleos, medido em diferentes níveis de supersaturação e temperatura, é um parâmetro relativamente fácil de se obter e permite a inferência da cinética de nucleação e da tensão interfacial. O presente trabalho apresenta medidas do tempo de indução pela variação da absorbância no comprimento de onda de 320 nm da insulina suína e da lisozima de clara de ovo de galinha, os resultados de ensaios de dissolução dessas proteínas em diferentes níveis de pH e temperatura, a partir dos quais foram determinados a solubilidade e o calor de dissolução Os ensaios de medida do tempo de indução em diferentes concentrações permitiram inferir a influência do pH na cinética de nucleação e na tensão interfacial. Dos ensaios de dissolução, pôde-se observar a existência de polimorfismo nas proteínas estudadas - confirmado por análises de raios- X - e que a insulina tem solubilidade retrógrada. Também, a partir desses resultados, foi possível estimar a cinética de crescimento da insulina. Das medidas de tempo de indução, observou-se que as interações eletrostáticas são preponderantes na nucleação de proteínas e que a resistência à nucleação diminui exponencialmente com o aumento da carga superficial das proteínas / Abstract: The crystallization of proteins has been traditionally applied as an auxiliary technique to crystallographic studies, and is often referred as an art more than a science. Crystallization as an operation of recovery and purification of bioproducts (RPB) has been underused main1y because of the lack of kinetic and thermodynamic parameters that allow the adequate design of industrial processes. Therefore, the induction time, defined as the period of time elapsed since the establishment of super saturation until the appearing and growth to a detectable size of nuclei, is an easily obtainable parameter and allows to infer nuc1eation kinetics and interfacial tension, when it is measured in different temperatures and super saturation degrees. The present work presents induction time measurements by absorbance in 320 nm of porcine insulin and hen egg white lysozyme, the results of dissolution assays of these proteins in different pH and temperature levels, ITom which were determined the solubility and the heat of dissolution. The induction time measurements in different concentration allowed inferring the influence of pH in the nucleation kinetics and in the interfacial tension. From dissolution assays, it could be observed protein polymorphism - which was confirmed by X-ray analyses. Moreover, it was determined that insulin has retrograde solubility, besides insulin growth kinetics. It was observed ITom induction time measurements that the electrostatic interactions are preponderant in protein nucleation and that the resistance to nucleation decreases exponentially as the surface charge of proteins mcreases / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Rubens Maciel Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T20:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribas_AlessandroMarra_D.pdf: 5049782 bytes, checksum: 4be66e5d3e2547e77bf9a5c8bfe56056 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Enzimas e proteínas vêm sendo utilizadas em inúmeros produtos nas mais diversas áreas, tais como em indústrias farmacêuticas, alimentícias, e de detergentes. No processo de produção de enzimas e proteínas estas são obtidas em meio a impurezas que precisam ser separadas para que as enzimas tenham as especificações necessárias para cada tipo de aplicação. Os processos de purificação e extração de proteínas e enzimas além de estar diretamente ligado a qualidade final do produto correspondem a uma importante parcela nos gastos de produção. Este trabalho teve como objetivo estudar computacionalmente o desempenho de diferentes configurações de sistemas de purificação de proteínas contínuos. Foram propostas e estudadas diferentes configurações derivadas do sistema CARE (Continuous Adsorption Recyc1e Extraction) de purificação de proteína que tiveram seu desempenho comparado com o desempenho do leito móvel simulado (LMS). Estudou-se também o desempenho do sistema de purificação proposto neste trabalho, o tanque de mistura móvel simulado (TMMS), que consiste da substituição das colunas do leito móvel simulado por tanques de mistura com membrana. Os modelos matemáticos de cada sistema de purificação foram obtidos a partir de um balanço de massa de enzimas e impurezas e os parâmetros cinéticos de adsorção utilizados são das enzimas lisozima e lipase. Para os diferentes sistemas de purificação obteve-se equações diferenciais ordinárias e equações diferenciais parciais que foram discretizadas em dez partes e resolvidos pelo método de Runge-Kutta de quarta ordem. Entre os sistemas de purificação estudados o que apresentou melhor desempenho foi o leito móvel simulado, seguido pelo tanque de mistura móvel simulado e finalmente os sistemas derivados do sistema CARE. O leito móvel simulado apresentou um tempo de troca ótimo no qual obteve-se alto rendimento e alto fator de purificação que são requisitos essenciais a um processo de purificação. O tanque de mistura móvel simulado foi o segundo melhor sistema de purificação pois apesar de apresentar um baixo rendimento teve um bom fator de purificação. Os sistemas derivados do sistema CARE apresentaram os menores fatores de purificação e consequentemente a menor capacidade de purificação / Abstract: Enzymes and proteins have been used in countless products in a great variety of several areas, such as in phannaceutical, nutrition, and detergent industries. In the enzymes and proteins production process these are obtained with impurities that need to be separated so that the enzymes have the necessary specifications for each application type. The protein and enzyme purification and extraction processes, besides being directly tied up to the final quality of the product, correspond to an important portion in the production expenses. The objective ofthis work was to study by computer simulations the performance of different configurations of continuous systems of protein purification. Different configurations were proposed and studied. They were derived from the CARE system (Continuous Adsorption Recycle Extraction) of protein purification that had its performance compared with the performance of the simulated moving bed (SMB). The performance of the purification system proposed in this work was also studied: the simulated moving stirred tank (SMST), which consists of the substitution of the columns of the simulated moving bed by stirred tanks with membrane. The mathematical models of each purification system were obtained from a mass balance of enzymes and impurities and the kinetic parameters of adsorption used are from the lisozima and lipase enzymes. In the different purification systems ordinary differential equations and partial differential equations were obtained. They were subsequently discretizated in ten parts and solved by the Runge-Kutta of fourth order method. Among the purification systems studied, that presented better performance was the simulated moving bed, followed by the simulated moving stirred tank and finally the derived systems of the CARE system. The simulated moving bed presented an optimum time of change (time of valve rotation) in which high yield and high purification factor, which are excellent characteristic in a purification process, were obtained. The simulated moving stirred tank was the second best purification system because, in spite of presenting a low yield it showed a good purification factor. The derived systems of the CARE system presented the smallest purification factors and consequently the smallest purification capacity / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química