Orientador: Augusto Ducati Luchessi / Banca: Alice Cristina Rodrigues / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) caracteriza-se por ser a única proteína conhecida que apresenta o aminoácido hipusina, formado a partir de uma modificação pós-traducional chamada hipusinação. Apesar de originalmente eIF5A ter sido denominado como fator de início de tradução, a função de eIF5A têm sido relacionada principalmente com a etapa de elongação da tradução. Desde 2013, trabalhos importantes apresentaram evidências de que eIF5A hipusinado possui um papel fundamental na tradução de mRNAs específicos de proteínas que contém consecutivos resíduos de aminoácidos prolina (PPP ou PPG). Tendo em vista estas informações, o objetivo principal deste trabalho consiste no estudo da dependência de eIF5A na tradução da proteína ribosomal S6 kinase 2 (S6K2), pois a mesma apresenta em sua extremidade C-terminal uma região contendo cinco resíduos consecutivos de prolinas. Neste contexto, por meio da produção de uma proteína mutante (S6K2∆Pro), substituindo a região de poli-prolina de S6K2 pela sequência correspondente da proteína homóloga ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), foram avaliadas a produção e habilidade fosforilativa da proteína mutante em comparação com S6K2 selvagem. Observou-se que S6K2ΔPro é produzida e sua superexpressão aumenta o conteúdo da proteína ribossomal S6 fosforilada, principal alvo de fosforilação das proteínas S6Ks, assim como a superexpressão das proteínas S6K1 e S6K2. Análises de silenciamento gênico em células HeLa, utilizando moléculas de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A), which is highly conserved among eukaryotes, contain the unusual amino acid hypusine, synthesized by a posttranslational modification called hypusination. Even though eIF5A was first denominated as an initiation factor, it has been related to elongation step of the translation process. Since 2013, many studies proposed that eIF5A acts on rescue the ribosome stalling promoted by synthesis of poly-proline motifs containing PPP or PPG sequences. The aim of this study is to evaluate the eIF5A dependence on Ribosomal S6 kinase 2 protein (S6K2) translation, once S6K2 contains a poly-proline stretch on its C-terminus with five consecutive prolines (PPPPP). By producing a mutant protein (S6K2Pro), replacing the polyproline motif on S6K2 for the same region found on homologous protein Ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), the content and phosphorylation activity were evaluated. It was observed that S6K2ΔPro is produced by HeLa cells and its RPS6 phosphorylation ability, which is the mainly target of S6Ks phosphorylation, is maintained. Analyzes using siRNA molecules for eIF5A gene silencing in HeLa cells have shown that the endogenous S6K2 protein does not have its content altered as a function of the depletion of the eIF5A content, under the conditions evaluated. Furthermore, by regulating the TIF51A gene expression (homologous of the human EIF5A gene) in Saccharomyces cerevisiae it was observed that the translation of S6K2 was only sli... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os ameloblastomas são tumores odontogênicos, de origem epitelial, que demonstra crescimento lento e comportamento invasivo e altamente recidivante. No entanto os mecanismos moleculares e as vias de sinalização celulares envolvidas na progressão desse tumor não estão claros. Estudos relatados na literatura indicam que aberrações nas vias de sinalização similares as encontradas durante o desenvolvimento dentário, incluindo a via Wnt1 e as proteínas GSK3 ß, APC e Axina1, que formam o complexo de degradação da ß-catenina podem estar alteradas nos ameloblastomas, levando a proliferação e progressão tumoral. O objetivo deste trabalho foi analisar a relação da expressão das proteínas Wnt1, GSK3 ß, APC e Axina1 com a proliferação tumoral dos ameloblastomas por meio de reações de imuno-histoquímicas. Para este estudo foram selecionados 40 casos com o diagnóstico de ameloblastoma, pertencentes aos arquivos do Serviço de Patologia da Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP e utilizada a técnica imunohistoquimica da estreptavidina-biotina em blocos parafinados destes casos selecionados. Nos resultados foram observados marcações positivas para a proteína Wnt1 em 25 (62,5%) casos, Axina1 em 23(57,5%), APC de 26(65%) casos e GSK3 ß em 34(85%) casos. / Ameloblastomas is an odontogenic tumors of epithelial origin, which shows slow-growing, highly invasive and recurrent behavior. Nevertheles the molecular mechanisms and cellular signaling pathways involved in the progression of this tumour are not yet clear. Reported studies in leterature indicates that aberrations in signaling pathways similar to those found during tooth development, including Wnt1 and GSK3 ß pathways, APC and Axin1 proteins which form the ß-catenin degradation complex may be altered in ameloblastoma, leading to proliferation and tumour progression. The aim of this study was to analyze the relationship between the expression of Wnt1, GSK3 ß, APC and Axin1 proteins with the tumour proliferation in ameloblastomas by immunohistochemical reactions. For this study, 40 cases were selected with the diagnosis of ameloblastoma, from the Oral Pathology department archives, Dental School, University of São Paulo and the immunohistochemistry technique of streptavidin-biotin in paraffin blocks of these selected cases was perfomed. Positive results to the Wnt protein were observed in 25 (62.5%) cases, Axina1 in 23 (57.5%), APC of 26 (65%) cases and GSK3 ß in 34 (85%) cases.

Os ameloblastomas são tumores odontogênicos, de origem epitelial, que demonstra crescimento lento e comportamento invasivo e altamente recidivante. No entanto os mecanismos moleculares e as vias de sinalização celulares envolvidas na progressão desse tumor não estão claros. Estudos relatados na literatura indicam que aberrações nas vias de sinalização similares as encontradas durante o desenvolvimento dentário, incluindo a via Wnt1 e as proteínas GSK3 ß, APC e Axina1, que formam o complexo de degradação da ß-catenina podem estar alteradas nos ameloblastomas, levando a proliferação e progressão tumoral. O objetivo deste trabalho foi analisar a relação da expressão das proteínas Wnt1, GSK3 ß, APC e Axina1 com a proliferação tumoral dos ameloblastomas por meio de reações de imuno-histoquímicas. Para este estudo foram selecionados 40 casos com o diagnóstico de ameloblastoma, pertencentes aos arquivos do Serviço de Patologia da Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP e utilizada a técnica imunohistoquimica da estreptavidina-biotina em blocos parafinados destes casos selecionados. Nos resultados foram observados marcações positivas para a proteína Wnt1 em 25 (62,5%) casos, Axina1 em 23(57,5%), APC de 26(65%) casos e GSK3 ß em 34(85%) casos. / Ameloblastomas is an odontogenic tumors of epithelial origin, which shows slow-growing, highly invasive and recurrent behavior. Nevertheles the molecular mechanisms and cellular signaling pathways involved in the progression of this tumour are not yet clear. Reported studies in leterature indicates that aberrations in signaling pathways similar to those found during tooth development, including Wnt1 and GSK3 ß pathways, APC and Axin1 proteins which form the ß-catenin degradation complex may be altered in ameloblastoma, leading to proliferation and tumour progression. The aim of this study was to analyze the relationship between the expression of Wnt1, GSK3 ß, APC and Axin1 proteins with the tumour proliferation in ameloblastomas by immunohistochemical reactions. For this study, 40 cases were selected with the diagnosis of ameloblastoma, from the Oral Pathology department archives, Dental School, University of São Paulo and the immunohistochemistry technique of streptavidin-biotin in paraffin blocks of these selected cases was perfomed. Positive results to the Wnt protein were observed in 25 (62.5%) cases, Axina1 in 23 (57.5%), APC of 26 (65%) cases and GSK3 ß in 34 (85%) cases.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa la diversidad genética a partir del polimorfismo de las proteínas de almacenamiento seminal (se extraen en base al criterio de solubilidad de Osborne (1924), lográndose extraer las cuatro fracciones proteicas denominadas como albúmina, globulina, prolamina y glutelina) en tres poblaciones cultivadas de Physalis peruviana “Aguaymanto” distribuidas en las provincias de San Pablo, Celendín y Cajabamba del departamento de Cajamarca. / Tesis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-10Bitstream added on 2014-06-13T20:29:48Z : No. of bitstreams: 1 santos_ma_me_araiq.pdf: 1654932 bytes, checksum: 6a8607912411fc8812340494300f0501 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os organismos pertencentes ao reino dos fungos têm exercido um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos moleculares de organismos eucariotos devido as suas facilidades de manipulação e o conhecimento das características genéticas e bioquímicas envolvidas em seu ciclo de vida. Neurospora crassa é um fungo cujos mecanismos genéticos e bioquímicos básicos são bem definidos, e por isso tem sido muito usado como um sistema modelo em pesquisas que visam à elucidação de processos celulares complexos. Em trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório foram identificadas algumas proteínas que se ligam à região promotora do gene gsn que codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória no processo de síntese de glicogênio. O presente trabalho teve como objetivo estudar algumas dessas proteínas, anotadas como hipotéticas, numa tentativa de entender melhor as suas participações no mecanismo de regulação. Para isto linhagens mutantes nos genes que codificam as referidas proteínas foram adquiridas junto ao Fungal Genetics Stock Center. Análises de determinação do conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes foram realizadas tanto em condições normais de crescimento (30º C) como em situações de choque térmico (45º C). Todas as linhagens mutantes avaliadas apresentaram um perfil de acúmulo de glicogênio semelhante ao da linhagem selvagem, isto é, todas apresentaram uma queda nas quantidades de glicogênio após o choque térmico. Entretanto a linhagem mutante na ORF NCU06679 apresentou o conteúdo de glicogênio mais reduzido, em ambas as situações ambientais (antes e depois do choque térmico). Com o objetivo de verificar o envolvimento das proteínas estudadas na expressão do gene gsn, experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que na situação de estresse térmico, os níveis do transcrito gsn diminuem semelhantemente... / The organisms belonging to the kingdom of fungi have played a key role in advancing the understanding of the molecular mechanisms of eukaryotic organisms due to their easy handling and the genetic and biochemical mechanisms involved in their life cycle. Neurospora crassa is a fungus whose basic biochemical and genetic mechanisms are well defined, and therefore has been widely used as a model system in studies aimed to elucidate complex cellular processes. In a previous work developed in our laboratory we identified some proteins that bind to the promoter region of the gsn gene that encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in the glycogen synthesis. This work aimed to start studying these proteins, annotated as hypothetical proteins, in an attempt to better understand their roles in the regulation of glycogen metabolism. For this, mutant strains in genes encoding the proteins were purchased from the Fungal Genetics Stock Center. Analysis of glycogen determination were performed in the mutant strains both under normal growth (30º C) and under heat shock condition (45º C). All mutant strains showed a glycogen content profile similar to the wild type strain, that is, all showed a decrease in the amounts of glycogen after heat shock. However the mutant strain in the ORF NCU06679 presented lower glycogen content compared to the wild type strain, in both environmental condition (before and after heat shock). To verify the participation of the proteins in the gsn gene expression, Northern blot experiments were performed and showed that under heat stress the gsn transcript levels decreased similarly to that observed in the wild type strain. However the reduction in the gene expression was higher in the mutant strain containing the ORF NCUO6679 knocked out

Orientador: Cesar Costapinto Santana, Ruben G. Carbonell / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T17:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_PaulodeTarsoVieirae_D.pdf: 5559825 bytes, checksum: 2e9db03cedef2cd6e85f793ab6861ea6 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: o fracionamento com espuma foi utilizado para o enriquecimento e recuperação de soluções de albumina do soro bovino (BSA). A coluna de fracionamento foi operada em contínuo e em semi-batelada. Na operação contínua obteve-se enriquecimentos de 2 a 40 vezes e recuperações de 60 a 98%. Nestes experimentos foram investigados as influências da vazão e concentração de proteína na alimentação, da velocidade superficial do gás, das alturas das coluna de líquido e de espuma e da posição da alimentação sobre a eficiência do processo. O enriquecimento apresentou maiores valores para baixas concentrações e vazões de alimentação, não sendo muito sensível a variações da velocidade superficial do gás. A recuperação aumenta tanto com a diminuição da vazão de alimentação quanto com o aumento da velocidade superficial do gás. Na operação semi-batelada os valores médios do enriquecimento ficaram entre 1,3 e 3,1. A recuperação total de proteína variou de 73 a 90%. O enriquecimento aumentou com a diminuição da velocidade superficial do gás enquanto que a recuperação aumentou com a elevação dos valores da concentração inicial de proteína e da velocidade superficial do gás...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Foam ti'actionation ofproteins was studied using BSA as a model protein. The fractionation column was operated in semi-batch and continuous mode. Enrichment varied from 2 to 40 folds in the continuous operation and the protein recovery was in the range from 60 to 98%. The influence of feed flow rate, feed protein concentration, superficial gas velocity, liquid pool height, foam column height, and feed position on the process efficiency was evaluated. The enrichment increases decreasing either feed protein concentration or feed flow rate. The enrichment was almost constant with variations on superficial gas velocities. Enrichment values were between 1.3 and 3.1 and the total protein recovered was between 73 and 90 % in the semi-batch process. The enrichment increases decreasing the feed flow rate, while the total protein recovered increased either the superficial gas velocity or the initial protein concentration...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

En la producción de proteínas una de las etapas más importantes es la de purificación, por lo que muchos estudios se enfocan en modificar esta etapa de manera de mejorar la pureza de la proteína de interés. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico corto (tag) a una xilanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para el estudio se escogieron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P) para formar la secuencia del extremo, y se realizaron mutaciones en la proteína para adicionar esta secuencia en el extremo C terminal de la misma por medio de la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las mutantes Xilanasa-(WP)2, Xilanasa-(YP)2Y, Xilanasa-Y3 y Xilanasa-(YP)3. Las cepas de la proteína modificada con estos extremos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo de la fracción periplasmática de la célula, se midió actividad enzimática y proteína total, y actividad específica. Para la cepa nativa y las mutantes, se observó una baja producción de proteína, como se indica en los resultados de proteína y actividad total. Debido a esto se sugiere hacer un estudio de las condiciones óptimas de crecimiento e inducción tanto para la proteína nativa como para las modificadas. En el caso de la xilanasa mutada con la secuencia (YP)3, se observó que en la fracción periplasmática obtuvo la menor cantidad de proteína total, pero la mayor actividad xilanolítica total, mientras que para el resto de las mutantes, se obtuvo una mayor actividad total en la fracción extracelular. Por esto, se recomienda hacer un estudio para analizar las causas de esta forma de expresión de la xilanasa en estudio. Las fracción periplasmática de la cepa nativa y las 4 cepas mutadas se analizó por HIC utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa y se calculó gráficamente los tiempos de retención adimensional (DRT) de a cuerdo a la fracción en que eluyó la proteína en cada caso. Para la xilanasa nativa y las 4 mutadas se observó una tendencia similar en los cromatogramas, y los DRT presentaron un aumento porcentual promedio respecto de la xilanasa nativa de 46,17 % y 31,82 % para las mutantes Xilanasa-(WP)2 y Xilanasa-(YP)2Y respectivamente, mientras que para la Xilanasa-Y3 se observó una disminución de la hidrofobicidad en un 16,6 %. El aumento de los DRT coincide con la presencia de prolinas en el extremo adicionado, mientras que la disminución del mismo se observa en ausencia de este aminoácido. La Xilanasa-(YP)3 se excluyó del estudio de los DRT, debido a que no presentó actividad en medio sólido en las fracciones de la cromatografía, por lo que no se pudo determinar en qué fracción eluyó dicha proteína. Esto se debe probablemente a la baja cantidad de proteína presente en el periplasma de esta cepa. Se calculó la hidrofobicidad superficial de la xilanasa nativa, y el aporte de cada cola a ella. Sin embargo, para esto se utilizó un modelo de xilanasa cuya secuencia posee aproximadamente un 38% de parecido, por lo que no es confiable, y se recomienda buscar un modelo que tenga un mayo porcentaje de similitud con la proteína de trabajo o modelar la misma. Es posible concluir que el aumento de hidrofobicidad superficial de la proteína xilanasa debida a la adición de una secuencia corta de aminoácidos hidrofóbicos, permite un aumento del DRT de las proteínas para el caso de las extremos que contienen prolina como la (WP)2 e (YP)2Y. En el caso del extremo que no tiene prolina (Y3), se observa una disminución de los tiempos de retención adimensional, por lo que se recomienda continuar el estudio de extremos hidrofóbicas sin prolinas, para confirmar la importancia de la presencia de este aminoácido en la secuencia de estos extremos.

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Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La topología de una proteína, definida como el camino tridimensional que sigue la cadena polipeptídica en el espacio, impone restricciones naturales al conjunto de movimientos que esta puede realizar para alcanzar su estado nativo. Por esta razón esta propiedad define el mecanismo de plegamiento de una proteína. Sin embargo, en los últimos años se han descrito proteínas que obligan a la cadena polipeptídica a buscar su camino de plegamiento a través de intrincados y complejos movimientos, es el caso de las proteínas anudadas. Estas proteínas suponen un desafío para las teorías de plegamiento actuales y han abierto nuevas interrogantes respecto al mecanismo de plegamiento de las proteínas. La primera proteína anudada fue identificada en el año 2000, desde entonces se han descrito muchas otras llegando a representar del 2% del Protein data bank (PDB). Esta baja abundancia relativa de proteínas anudadas contrasta con lo observado en simulaciones de modelos de polímeros que indican que la probabilidad de formar este tipo de estructuras es alta. Esto hace pensar que las proteínas evitan la formación de nudos. No obstante no se conoce la tendencia natural de una proteína a anudarse. Otra interrogante que nace del estudio de proteínas anudadas tiene relación con la función que cumplen estas estructuras en las proteínas que las presentan y cómo estas proteínas logran plegarse. Se ha demostrado que algunos motivos anudados se conservan en distintas familias y superfamilias a pesar de su baja identidad de secuencia. Esta evidencia sugiere que dichos motivos podrían aportar alguna ventaja comparativa a las proteínas que los presentan. En este aspecto, estudios teóricos y evidencias experimentales indican que la topología anudada podría aumentar la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, ninguno de dichos estudios explica cómo la topología anudada confiere estabilidad. En este trabajo tratamos de determinar las consecuencias que tiene sobre el mecanismo de plegamiento de una proteína el obligar a su cadena polipeptídica a anudarse. Para ello se comparó el proceso de plegamiento de una proteína anuda con la de su contraparte no-anudada. Experimentalmente esto sugiere dos desafíos importantes: primero, es necesario que la formación del nudo no altere significativamente la estructura de la proteína. Segundo, es indispensable poder controlar la topología del estado desplegado para asegurar la homogeneidad de los estados termodinámicos estudiados. El primer desafío fue abordado utilizando como modelo de estudio la proteína mARC de la superfamilia de factores de transcripción RHH. Esta es una versión monomérica del represor ARC del fago p22 generada al unir el extremo carboxilo de una subunidad con el extremo amino de la siguiente utilizando un péptido conector de 15 aminoácidos rico en glicina. Modelos por homología de mARC muestran que el péptido conector puede formar un lazo flexible que no genera contactos con el centro hidrofóbico de la proteína. De esta manera, dependiendo de la posición de dicho lazo se pueden generar dos conformaciones de mARC, una conformación anudada y otra no-anudada. El segundo desafío experimental fue abordado caracterizando el mecanismo de plegamiento de mARC utilizando pinzas ópticas. Esta aproximación permite estirar la proteína desde sus extremos y aplicar una fuerza sobre ella, de esta forma se puede controlar la topología del estado desplegado y con ello poder comparar la diferencia de energía libre entre el estado desplegado anudado y no-anudado de mARC. Por otra parte, mediante un rearreglo de los elementos de estructura secundaria de mARC puede generarse una permutante no circular de ella, pARC. Esta proteína presenta la misma arquitectura y estabilidad al equilibrio que mARC pero su topología le impide formar nudos. Así, esta permutante fue utilizada como control del efecto topológico del anudamiento de mARC. Los resultados obtenidos al estirar mARC a velocidad constante permitieron identificar dos tipos de moléculas con largos de contorno (L0 largo de una molécula completamente estirada) diferentes. Un grupo de moléculas presentó un L0 de 37 ± 7 nm, que coincide con lo esperado para la conformación anudada de mARC. El otro grupo mostró un L0 de 43 ± 7 nm, esperado para la conformación no-anudada de esta proteína. Al contrario, pARC sólo mostró un tipo de moléculas con un L0 de 22 ± 7 nm. De estos resultados se concluye que mARC está presente en dos conformaciones, una anudada y otra no anudada. De los experimentos de estiramiento a velocidad constante se obtuvo el trabajo irreversible, realizado fuera del equilibrio, asociado a las transiciones de desplegamiento y replegamiento de mARC y pARC. Utilizando el teorema de Crooks fue posible calcular, a partir de estos datos, el ΔG en condición de equilibrio para el desplegamiento de las conformaciones anudada (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol) y no-anudada (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) de mARC así como también de pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). Estos resultados indican que mARC anudado es más estable que mARC no-anudado por 8,9 ± 0,9 kcal/mol, este valor corresponde al costo energético de anudar una cadena polipeptídica de 120 residuos en su estado desplegado. Esta es la primera vez que es posible determinar experimentalmente este valor. Además, esta diferencia de energía explica, cómo es que la topología anudada confiere estabilidad en esta proteína. Para caracterizar cinéticamente las proteínas se realizaron experimentos a fuerza constante. Sólo fue posible estudiar dos moléculas de mARC las cuales, a pesar de las diferencias que muestran en sus parámetros cinéticos calculados, corresponden a la conformación no-anudada de la proteína. No fue posible realizar estudios cinéticos con pARC / The topology of a protein, defined as the tridimensional path of the polypeptide chain in space, restricts the moves that the chain can perform for searching its native state. For this reason this property defines the folding mechanism of a protein. However, in recent years has been discovered some proteins that seek their native states through complex and intricate movements. Such is the case of knotted proteins which topology challenge current theories of protein folding and have opened new questions about protein folding mechanisms. The first knotted structure was identified in 2000, since then many others have been discovered reaching the 2% of the structures in the Protein data bank (PDB). The low relative abundance of the knotted structures contrast with simulation of polymer models showing that knotted structures are easy to exist in those systems. This suggests that proteins somehow have avoided knotted topologies. Another interesting thing to investigate about knotted proteins is the function that may have the knotted topology on this proteins and how that structures may fold. It has been determined that some knotted motifs are conserved in families and superfamilies despite of the low sequence identity. These results suggest that knotted motifs could provide some comparative advantage with respect to normal proteins. In this regard some theoretical and experimental evidence show that knotted topologies could enhance the stability of proteins. Nevertheless, none of these studies explain how this topologies does it. In this work we seek to elucidate the energetic consequence that brings the knotting of a polypeptide chain to its folding mechanism. For this, we compare the folding process of a knotted protein with their unknotted counterpart. In terms of experimental approach this problem impose two challenges, the first one is that the knot formation should don’t disturb the structure of the protein. The second one is that we must control de topology of the unfolded state in order to ensure the homogeneity of the thermodynamic species under experimentation. The first challenge was archived using the mARC protein from the RHH superfamily of transcription factors. This protein is a monomeric version of the ARC repressor from the p22 phage and it was constructed connecting the C terminus of the first subunit to the N terminus of the next one using a 15 residue glycine-rich polypeptide linker. Structural models mARC shows that the linker forms a flexible loop that doesn’t form contacts with hydrophobic core of the protein. Moreover, homology models indicate that the loop can move around the protein generating two conformations: a knotted and an unknotted one. The second challenge was addressed by characterizing the folding mechanism of mARC using optical tweezers. This approximation allows us to pull the protein from its C and N-terminal ends to control the topology of the unfolded state and thus to compare the energy differences between the knotted unfolded state and the unknotted unfolded state of mARC. In the other hand, by a rearrangement of the secondary structure of mARC it is possible to generate a non-cyclic permutant, pARC. This protein is reported to have the same architecture and folding stability of mARC but, its topology prevents knotting. So, pARC was used as a topological control of the effect of knotting the mARC protein. We found that mARC can be captured in two conformations characterized by different contour length (L0, total extension of a polymer chain). One group of molecules has a L0 of 43 ± 7 nm and corresponds to the expected for the unknotted conformation of mARC. The other group of molecules shows a L0 of 37 ± 7 nm and corresponds to the expected for the knotted conformation. On the contrary pARC only shows one type of molecules characterized by a L0 of 22 ± 7 nm. All together these results support the hypothesis that mARC is present in two conformations, one knotted and other unknotted. Moreover, applying Crook’s theorem to the irreversible work associated to the unfolding and refolding transitions of mARC and pARC allowed to determine the free energy (ΔG) at equilibrium required to the unfold the knotted (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol), unknotted (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) conformations of mARC and pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). These results indicate that knotted mARC is more stable than their unknotted counterpart by 8,9 ± 0,9 kcal/mol mainly due to the energetic cost to tie the unfolded state of the protein. This value corresponds to the energetic cost of knotting a polypeptide chain of 120 residues in its unfolded state and explains the source of the stabilizing effect of the knotted topology in mARC. For the kinetic characterization we performed constant force experiments. It was only possible to study two molecules of mARC. Despite of the differences between the kinetic parameters calculated for them, both corresponds to the unknotted conformation of the protein / Fondecyt

Memoria para optar el título de Bioquímico / La migración celular es un proceso esencial en organismos pluricelulares, cobrando gran importancia durante la embriogénesis y en la respuesta inmune. Para migrar las células deben ser capaces de generar protrusiones fuera del margen celular. Los principales tipos de protrusiones generados por la polimerización de actina son lamelipodios y filopodios, siendo los primeros generados a través del complejo Arp2/3 (Actin related protein). Se ha reportado que la polimerización de actina es regulada por varias GTPasas pequeñas, entre ellas Rab35, la cual recluta a Rac1 y Cdc42 a sitios de formación de protrusiones modulando la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente. PRPK (p53 related protein kinase) es una quinasa atípica, altamente conservada perteneciente al complejo KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size), el cual modula la eficiencia del reconocimiento de codones de tipo ANN. En Drosophila se ha visto que PRPK es necesario para la integración de las señales de la vía PI3K/TOR, las cuales se traducen en crecimiento celular y proliferación. Sin embargo, hemos visto que la pérdida de función de PRPK altera la forma celular en hemocitos-células inmunes homólogas a los macrófagos-, generando un fenotipo estrellado, similar a la pérdida de función del complejo Arp2/3. Este fenotipo es suprimido al co-expresar Rab35. También se ha reportado la interacción física entre PRPK y Rab35 en células humanas. Con estos antecedentes me propuse determinar si PRPK posee un rol fuera del complejo KEOPS, participando en la dinámica de protrusiones de membrana y el patrón de migración de hemocitos en Drosophila melanogaster. Para ello manipulamos los niveles de PRPK en tiempos y tejidos específicos a través del sistema Gal4/UAS. Se analizó la dinámica del citoesqueleto de actina y los parámetros de migración celular mediante microscopía confocal, en contextos particulares de migración y cultivo celular. Finalmente se realizaron co-inmunoprecipitaciones para determinar la interacción física entre PRPK-Kae1 (otro miembro del complejo KEOPS) y PRPK-Rab35. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que la pérdida de función de PRPK altera la dinámica del citoesqueleto de actina in vitro, el patrón de migración de hemocitos en estadios embrionarios, disminuye el reclutamiento de hemocitos en larvas en respuesta a un daño tisular y disminuye la velocidad de migración de hemocitos en estadío pupal. También se corroboró la interacción física entre PRPK y Rab35 y, aún cuando PRPK interactúa con Kae1, se concluyó que el rol de PRPK en la determinación de la forma celular se debe a un rol no canónico fuera del complejo KEOPS. Estos resultados sugieren que PRPK posee dos roles: Integración de señales de crecimiento y migración celular / Cell migration is an essential process in multicellular organisms, gaining great importance during embryogenesis and in the immune response. To migrate the cells must be able to generate protrusions outside the cell margin. The main types of actin protrusions are lamellipodia and filopodia, both generated by actin polymerization through the Arp2/3 (Actin related protein) complex. It has been reported that the activation of numerous small GTPases complex including Rab35, which recruits Rac1 and Cdc42 to the site of protrusions formation, where the latter are involved in the formation of lamellipodia and filopodia respectively. p53-related protein kinase (PRPK) is a highly conserved atypical kinase. It is a member of the KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size) complex, which modulates the efficiency of recognition of ANN codons. In Drosophila PRPK is necessary for the translation of PI3K/TOR growth signals, which lastly support cell growth and proliferation. However, we observed that loss of function of PRPK alters cellular shape in haemocytes -macrophage-like cells-, generating a star-like phenotype which is also observed in loss of function of the Arp2/3 complex. The phenotype is suppressed by co-expressing Rab35. Also, it has been reported physical interaction between PRPK and Rab35 in human cells. With all this evidence I decided to determine if PRPK has a function independent of the KEOPS complex participating in the dynamics of membrane protrusions and migration pattern of haemocytes in Drosophila melanogaster. To do this, we manipulated PRPK levels in tissues and times specific through the Gal4 / UAS system. In particular contexts, migration and cell cultures, the actin cytoskeleton dynamics and cell migration's parameters were analyzed by confocal microscopy. Finally co-immunoprecipitations were performed to determine the physical interaction between PRPK-kae1 (another member of the complex KEOPS) and PRPK-Rab35. The results obtained in this study show that the loss of function of PRPK alters the dynamics of membrane protrusions in vitro and the migration pattern of embryonic haemocytes, reduces the recruitment of larval haemocytes in response to tissue damage and decreases haemocyte migration rate in pupal stage. We confirmed the physical interaction between PRPK and Rab35 and even when PRPK interacts with kae1, it was concluded that the role of PRPK in determining cell shape is due to a non-canonical role independent of the KEOPS complex. These results suggest that PRPK has two roles: Integration of growth signals and cell migration / Fondecyt