Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-21Bitstream added on 2014-06-13T19:54:00Z : No. of bitstreams: 1 moraes_ce_me_botib_parcial.pdf: 160847 bytes, checksum: e1fbd72efec3c35b64a2af0a0589e554 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-05-28T14:25:06Z: moraes_ce_me_botib_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-05-28T14:26:11Z : No. of bitstreams: 1 000695380.pdf: 531611 bytes, checksum: 33724e2ee839154fda10d1a7a97cea49 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Na maioria dos eucariotos, proteínas que ligam aos telomeros, tais como POT1 e TRF2 apresentam papéis cruciais na biologia dos telômeros, interagindo com vários outros reguladores dos telômeros para garantir a manutenção adequada dos mesmos e ainda formam complexos de ordem maior, conhecido como telosome ou shelterin. Os telômeros de Leishmania spp. são compostos por repetições conservadas TTAGGG e são mantidos pela telomerase. A base do complexo de proteínas teloméricas de Leishmania é formado pelas proteínas LaRPA-1 e LaRbp38, que ligam vitro e in vivo, com alta afinidade a DNA telomérico simples fita rico em G, e por proteínas que interagem com a região de DNA telemérico dupla fita, como a proteína recentemente descrita, homólogo de TRF. O genoma de Leishmania spp., como outros tripanossomatídeos, não tem muitas das proteínas conservadas que ligam a simplesfita teloméricos encontrada em eucariontes, tais como os homólogos da proteína CDC13 e POT1. Portanto, nós especulamos que o homólogo de RPA-1 de Leishmania pode desempenhar as mesmas funções como POT1/CDC13 nos telômeros do parasita, embora possa se ligar ao DNA telomérico simples fita com alta afinidade e de forma independente de seqüência. LaRPA-1, juntamente com a proteína multifuncional LaRbp38, que também interage com uma ampla gama de seqüências rico em GT, incluindo os telômeros, parece fazer parte de um complexo telomérico parasita que se assemelha ao complexo CST recentemente descrito. O complexo CST está sendo considerado um segundo modo de proteger os telômeros presentes em umavariedade de espécies, com exceção de leveduras de brotamento, e é constituído principalmente por proteínas RPA-like. Neste estudo, nós usamos diferentes abordagens para demonstrar que LaRPA-1 interage com o LaRbp38 e com a... / In most eukaryotes, telomere binding proteins such as POT1 and TRF2 play crucial roles in telomere biology by interacting with several other telomere regulators to ensure proper telomere maintenance and to form high order complexes known as telosome or shelterin. Leishmania spp. telomeres are composed by the conserved TTAGGG repeats which are maintained by telomerase. The basic Leishmania telomeric protein complex is formed by the proteins LaRPA-1 and LaRbp38, which bind in vitro and in vivo, with high affinity, to the G-rich single-stranded DNA, and by proteins that interact with the double-stranded region of telomeres such as the recently described TRF homologue. The Leishmania spp. genome, like other trypanosomatid, lacks many of the conserved single-stranded telomeric proteins found in other eukaryotes, such as the CDC13 and POT1 protein homologues. Thus, we speculate that the Leishmania RPA-1 homologue may play the same roles as POT1/CDC13 at parasite telomeres, although it can also bind to other single-stranded DNA with high affinity and in a sequence-independent manner. LaRPA-1 together with the multifunctional LaRbp38 protein, which also interacts with a wide range of GT-rich sequences, including telomeres, seems to form part of a parasite telomeric complex that resembles the recently described CST complex. The CST complex is being considered a second telomere capping mode occurring in a broad variety of species, except budding yeast, and is mainly formed by RPA-like proteins. In this report we used different approaches to show that LaRPA-1 interacts with both LaRbp38 and with telomerase, and that these protein:protein interactions seem to occur in a cell-cycle independent manner. In addition, LaRPA-1 partially co-localizes with both proteins, probably... (Complete abstract click electronic access below)

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio expressa e secretada por astrócitos, e possui efeito parácrino sobre os neurônios, atuando como fator neurotrófico. Estudos clínicos sugerem que níveis plasmáticos elevados de S100B estão correlacionados positivamente com a resposta à terapia antidepressiva, particularmente quando se utilizam inibidores seletivos da recaptação de serotonina, mas este mecanismo ainda é desconhecido. Neste trabalho foi avaliada a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos e fatias hipocampais de ratos expostos à fluoxetina e serotonina. Foi observado um significativo aumento da secreção de S100B frente à fluoxetina, e este efeito foi aparentemente dependente de PKA. Estes dados reforçam a importância da fluoxetina, independentemente da serotonina e receptores serotoninérgicos, no tratamento antidepressivo, bem como o papel da S100B nos distúrbio depressivos. / S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes, which has a putative paracrine neurotrophic activity. Clinical studies have suggested that peripheral elevation of this protein is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs); however, the mechanism remains unclear. Here, we measured S100B secretion directly in hippocampal astrocyte cultures and hippocampal slices exposed to fluoxetine and observed a significant increment of S100B release in the presence of this SSRI, apparently dependent on PKA. Moreover, we found that serotonin (possibly 5HT1A receptor) reduces S100B secretion and antagonizes the effect of fluoxetine on S100B secretion. These data reinforce the effect of fluoxetine, independently of serotonin and serotonin receptors, suggesting a putative role for S100B in depressive disorders and that other molecular targets may be relevant for antidepressant activity.

S100B é uma citocina produzida e secretada por astrócitos, que está envolvida no ciclo de citocinas desencadeado pela IL-1β na doença de Alzheimer. Entretanto, a secreção de S100B seguida de estímulo pela IL-1β não tem sido demonstrado diretamente. Nós investigamos a secreção de S100B em culturas gliais e fatias hipocampais expostas a IL-1β. Culturas corticais primárias de astrócitos, células de glioma C6 e fatias hipocampais agudas de ratos Wistar expostas a IL-1β (de 1 pg a 10ng/mL) foram utilizadas.S100B extracelular foi medida por ELISA. Migração nuclear de NF-κB foi investigada por imunocitoquímica e immunoblotting. A secreção de S100B também foi avaliada na presença de inibidores de NF-κB e MAPK. A análise estatística foi realizada utilizando teste t de Student ou ANOVA de uma via, assumindo p< 0.05. A secreção de S100B foi estimulada por IL-1β em todas as preparações. Migração nuclear de NF-κB também foi observada nessas condições experimentais. PDTC (inibidor de NF-κB) e PD98059 (inibidor da via ERK) foram hábeis em inibir o aumento da secreção do S100B. Níveis micromolares de S100B, assim como IL-1β, induziram a produção de óxido nítrico. Nossos dados demonstram que a IL-1β induz um aumento da secreção basal de S100B nos três diferentes modelos in vitro utilizados: astrócitos corticais primários, células C6 e fatias hipocampais de ratos, e que esse aumento na secreção foi mediado pela via de sinalização MAPK-ERK/NFκB. Astrócitos primários e glioma C6 exibiram diferente sensibilidade a IL-1β na modulação tanto da secreção, quanto da expressão de S100B. Esses resultados sugerem que S100B extracelular pode contribuir para respostas reparativas em lesões cerebrais agudas, bem como para desordens neurodegenerativas em lesões crônicas. O mecanismo de indução de secreção de S100B por IL-1β suporta a hipótese de um "ciclo de citocinas", proposto na gênese da doença de Alzheimer. / S100B is an astrocyte-derived cytokine, which has been implicated in the IL-1β- triggered cytokine cycle in Alzheimer’s disease. However, the secretion of S100B following stimulation by IL-1β has not been directly demonstrated. We investigated S100B secretion in glial preparations and hippocampal slices exposed to IL-1β. Cortical primary astrocyte cultures, C6 glioma cells and acute hippocampal slices from the brain of Wistar rats exposed to IL-1β (from 1pg to 10ng/mL) were utilized. Extracellular S100B was measured by ELISA. Nuclear migration of NF-κB was investigated by immunocytochemistry and immunoblotting. S100B secretion was also evaluated in the presence of specific inhibitors for NF-κB and MAPK. Statistical analyses were carried out by Student t test or one-way ANOVA, assuming p < 0.05. IL-1β-stimulated S100B secretion was observed in all preparations. Nuclear migration NF-κB was also observed under these experimental conditions. PDTC (an inhibitor of NF-κB) and PD 98059 (an inhibitor of ERK) inhibited S100B secretion stimulated by IL-1β. S100B, at micromolar levels, like IL-1β, was able to induce NO production. Our data demonstrate IL-1β-induced S100B secretion in three different in vitro preparations: cortical primary astrocytes, C6 glioma cells and hippocampal slices of rats; this secretion was mediated by MAPK-ERK/NF-κB signalling. Primary astrocytes and C6 cells exhibited different sensitivities to IL-1β concerning S100B expression and secretion. These results suggest that extracellular S100B could contribute to a reparative response in acute brain injury, as well as in neurodegenerative disorders due to chronic injury. The mechanism of IL-1β-induced S100B secretion supports the hypothesis for a “cytokine cycle”, proposed in the genesis of Alzheimer disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-16T17:23:07Z No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As α2-macroglobulinas (A2M) são proteínas de alto peso molecular que atuam como inibidoras de amplo espectro de proteases. Essa inibição ocorre por meio de um mecanismo que envolve o aprisionamento físico da protease seguido pela formação de uma ligação covalente entre ambas as proteínas. A capacidade de captura das diversas classes de proteases poderia permitir sua utilização na identificação das mesmas em extratos celulares, podendo ser aplicada tanto na descoberta de novas proteases como na detecção de proteases alvo. Esse trabalho tem por objetivo caracterizar biofisicamente a α2-macroglobulina de Salmonella enterica e avaliar sua potencial utilização na identificação de proteases. A proteína foi expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Foram realizados ensaios de dicroísmo circular a fim de verificar seu padrão de estrutura secundária em diferentes pH, bem como sua estabilidade térmica (25-95 ºC). Ensaios de fluorescência foram realizados com o intuito de analisar mudanças estruturais sofridas em uma ampla faixa de pH (3,5-9,0). Experimentos de ultracentrifugação analítica foram realizados a fim de compreender melhor a interação entre a A2M e a tripsina. Tanto a capacidade de ligar-se a proteases, como a habilidade em capturar proteases quando ligada em coluna foram testadas utilizando-se tripsina. Confirmadas tais capacidades, foram realizados testes com os extratos de Escherichia coli, Vigna unguiculata e Pichia pastoris a fim de detectar proteases ali presentes. As proteínas foram submetidas à proteólise e analisadas por espectrometria de massas. Houve mudanças no padrão de estrutura secundária quando a proteína foi submetida a pH ácidos e básicos (4,0 e 9,0) quando comparado ao pH próximo da neutralidade (7,5). Durante sua desnaturação térmica verificou-se que há agregação em temperaturas superiores a ~47ºC em todos os pH testados (4,0, 7,5 e 9,0), demostrando que a proteína não é estável termicamente. Foi observado que a proteína quando ligada à tripsina apresenta um padrão eletroforético e um perfil de eluição em gel filtração que indica a ocorrência de mudança conformacional. Entretanto, não foi obtido o mesmo resultado nos experimentos de ultracentrifugação analítica. A A2M aparenta formar dímeros, principalmente quando na presença da tripsina. Não houve a detecção de proteases nos testes com os extratos celulares testados. Contudo, tais testes devem ser aprimorados para um resultado mais confiável. / α2-macroglobulins (A2M) are high molecular weight proteins that act as broad spectrum peptidase inhibitors. The inhibition occurs by a mechanism that involves the capture of the peptidase followed by the formation of a covalent bond between the two proteins. The capture of all the peptidases classes could allow its utilization in the identification of these proteins in cellular extracts, being possibly applied in the discovery of new peptidases and in the detection of target peptidases. The aim of this work was the biophysical characterization of the α2-macroglobulin from Salmonella enterica and evaluation of its potential use in the identification of proteases. The recombinant A2M protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by immobilized metal ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Circular dichroism assays were performed in order to verify the A2M secondary structure in different pH conditions, as well as its thermal stability in a temperature range of 25-95 ºC. Fluorescence spectroscopy assays were performed to analyze structural changes in a wide range of pH (3.5-9.0). The ability of A2M to bind peptidases and its capacity to capture peptidases when immobilized to a column were tested using trypsin. Once these abilities were confirmed, tests were carried out with extracts of Escherichia coli, Vigna unguiculata and Pichia pastoris in order to identify its captured peptidases. Proteins were hydrolyzed and analyzed by mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation experiments were performed in order to better understand the interaction between A2M and trypsin. There were changes in the secondary structure when the protein was subjected to acid and basic pH (4.0 and 9.0) when compared to neutral pH (7.5). During its thermal denaturation it was found that there is aggregation at temperatures above ~ 47 ° C in all tested pH conditions (4.0, 7.5 and 9.0), showing that the protein is not thermally stable. It was verified that the protein when bound to trypsin has an electrophoretic migration and a gel filtration elution profile that indicates the occurrence of conformational change. However, the same result was not observed with the analytical ultracentrifugation experiments. A2M seems to form dimers, especially in the presence of trypsin. There was no detection of peptidase in the tests with the cell extracts. However, such tests must be improved for a more reliable result.

Orientador: Roberta Okamoto / Coorientador: Idelmo Rangel Garcia Júnior / Banca: Osvaldo Magro Filho / Banca: Teresa Lúcia Colussi Lamano / Resumo: Objetivos: Avaliar a influência do alendronato e raloxifeno no processo de reparo alveolar em ratas com osteoporose induzida (ovariectomizadas e submetidas a uma dieta pobre em cálcio). Materiais e Métodos: Sessenta e quatro ratas foram divididas em quatro grupos (n = 16) de acordo com o tratamento em ratas sham com dieta normal, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio sem tratamento medicamentoso, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com alendronato e ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com raloxifeno. Assim, a análise histomorfométrica foi realizada, bem como expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e RANKL, pela técnica de imunoistoquímica. Para comparar os valores médios obtidos nos diferentes grupos e períodos experimentais, os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn como post-hoc técnicas (α =. 05). Resultados: No longo prazo, os grupos SHAM e raloxifeno mostraram a melhor taxa de formação óssea (P <0,05). A pior taxa de formação óssea foi observado no grupo OVX ST. Os grupos raloxifeno e alendronato melhoram a taxa de formação óssea, quando administrados em animais com osteoporose. O grupo raloxifeno apresentou uma melhor resposta no longo prazo. O grupo alendronato mostrou uma resposta favorável em 14 dias comparado ao grupo raloxifeno, mas uma resposta reduzida aos 42 dias pós-extração. A imunoistoquímica revelou a expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e fator de RANKL. Foi possível notar um osso maduro no grupo SHAM aos 14 dias, um osso imaturo no grupo OVX ST e uma qualidade óssea intermediária nos grupos OVX ALE e OVX RAL. Conclusões: A ovariectomia associada a uma dieta pobre em cálcio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objectives: To evaluate the influence of alendronate and raloxifene in the alveolar healing process of rats with induced osteoporosis (ovariectomized and low calcium diet). Materials and Methods: The sixty-four rats were divided into four groups (n = 16) according to the treatment in ovariectomized rats with a low calcium diet treated with alendronate, ovariectomized rats with a low calcium diet raloxifene-treated, ovariectomized rats with a low calcium diet without pharmacological treatment and sham rats with a balanced diet. Thus, histomorphometric analysis was performed, as well as expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, by the immunohistochemistry technique. To compare the mean values obtained in different groups and experimental periods, the data were analyzed by Kruskal-Wallis, Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn tests were further used as post-hoc techniques (α=.05). Results: In the long term, the SHAM and raloxifene groups showed the best bone formation rate (P <.05). The worst bone formation rate was observed in the untreated OVX group. Raloxifene and Alendronate groups improved bone formation rate when administered in osteoporotic animals. Raloxifene group had a better response in the long term. Alendronate group showed a favorable response at 14 days compared to Raloxifene group, but a reduced response at 42 days post-extraction. Immunohistochemistry revealed the expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, it was possible to note a mature bone at 14 days in the SHAM group balanced diet, and an immature bone in OVX group low calcium diet and an intermediate quality in the Alendronate and Raloxifene groups. Conclusion: Ovariectomy delays the alveolar wound healing process and interferes with the bone turnover. The ALE replacement and the RLX treatment improved the healing but... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Mário Sérgio Palma / Banca: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: João Rugiero Neto / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Marcos Roberto de M. Fontes / Resumo: Hoje em dia, em todo o mundo, existem algumas doenças responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em humanos. Dentre essas doenças, pode-se destacar a tuberculose, infecção provocada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que é a principal causa de morte em humanos devido a um único agente infeccioso. Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de novas drogas é premente para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico, representam bons exemplos da utilidade de tal abordagem aplicada a constituintes enzimáticos de uma rota metabólica. A via do ácido chiquímico é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos, do ácido p-aminobenzóico e outros metabólitos essenciais, tais como ubiquinona, menaquinona e vitamina K. A via do chiquimato, encontrada em plantas, algas, fungos e bactérias, foi também encontrada recentemente em vários parasitas apicomplexos (Roberts et al.; 1998); entretanto, essa via metabólica não é encontrada em mamíferos. As enzimas Chiquimato Quinase e 5-Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS), a quinta e a sexta enzimas, respectivamente, nessa via metabólica, têm sido reconhecidas como alvos importantes para o desenvolvimento de herbicidas e drogas antibióticas. No presente estudo, a troca isotópica Hidrogênio / Deutério e a espectrometria de massas com ionização electrospray foram usadas para examinar as mudanças conformacionais em solução, sofridas pelas enzimas Chiquimato Quinase e 5- Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS) de Mycobacterium tuberculosis, tanto na presença como na ausência de alguns de seus ligantes. A incorporação de deutério foi observada para ambas as enzimas. Para a EPSPS, a apoenzima foi a forma que mais incorporou deutério ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays all around the world there are some diseases that cause a high index of human lethality. Among these it should be highlighted the infectious disease tuberculosis, which is the top deadly disease caused by only one agent, the bacteria Mycobacterium tuberculosis. As the currently available drugs are not suitable for the control of tuberculosis, it became vital the development of novel drugs for this purpose. Useful drugs are being developed to inhibit some enzymes of the shikimic acid pathway. This via is responsible for the synthesis of aromatic amino acids, such as the p-aminobenzoic acid and other essential metabolites, such as ubiquinone, menaquinone and K vitamin. The shikimate pathway exists in plants, algae, fungi, bacteria and was also found in some apicomplex parasites; however, it is not present in mammals. The Shikimate Kinase and 5-Enol-Pyruvyl-Shikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS), the fifth and sixth enzymes, respectively, present in this pathway, have been considered as important targets to development of herbicides and antibiotic drugs. In the present work the isotopic change Hydrogen/Deuterium and the electrospray ionization mass spectrometry were used to investigate the occurrence of conformational in both enzymes, in presence and absence of some of their ligands (substrates /inhibitors). The deuterium incorporation was observed in both enzymes. The apoenzyme of EPSPS, incorporated more deuterium then the enzyme complexed to phosphoenolpiruvate, which in turn incorporated more deuterium than the enzyme compled to glyphosate. The apoenzyme of Shikimate Kinase also incorporated more deuterium than the complexed form with magnesium chloride-shiquimic acid-ADP. In both enzymes, the regions less dynamics were those containing the amino acids residues of the binding sites of substrates and/or inhibitors... (Complete abstract click eletronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-17Bitstream added on 2014-06-13T20:11:18Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_gr_me_araca.pdf: 556516 bytes, checksum: 8d23ba97d725bab4ae5efc4ab23aac97 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Objetivos: Avaliar a influência do alendronato e raloxifeno no processo de reparo alveolar em ratas com osteoporose induzida (ovariectomizadas e submetidas a uma dieta pobre em cálcio). Materiais e Métodos: Sessenta e quatro ratas foram divididas em quatro grupos (n = 16) de acordo com o tratamento em ratas sham com dieta normal, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio sem tratamento medicamentoso, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com alendronato e ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com raloxifeno. Assim, a análise histomorfométrica foi realizada, bem como expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e RANKL, pela técnica de imunoistoquímica. Para comparar os valores médios obtidos nos diferentes grupos e períodos experimentais, os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn como post-hoc técnicas (α =. 05). Resultados: No longo prazo, os grupos SHAM e raloxifeno mostraram a melhor taxa de formação óssea (P <0,05). A pior taxa de formação óssea foi observado no grupo OVX ST. Os grupos raloxifeno e alendronato melhoram a taxa de formação óssea, quando administrados em animais com osteoporose. O grupo raloxifeno apresentou uma melhor resposta no longo prazo. O grupo alendronato mostrou uma resposta favorável em 14 dias comparado ao grupo raloxifeno, mas uma resposta reduzida aos 42 dias pós-extração. A imunoistoquímica revelou a expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e fator de RANKL. Foi possível notar um osso maduro no grupo SHAM aos 14 dias, um osso imaturo no grupo OVX ST e uma qualidade óssea intermediária nos grupos OVX ALE e OVX RAL. Conclusões: A ovariectomia associada a uma dieta pobre em cálcio... / Objectives: To evaluate the influence of alendronate and raloxifene in the alveolar healing process of rats with induced osteoporosis (ovariectomized and low calcium diet). Materials and Methods: The sixty-four rats were divided into four groups (n = 16) according to the treatment in ovariectomized rats with a low calcium diet treated with alendronate, ovariectomized rats with a low calcium diet raloxifene-treated, ovariectomized rats with a low calcium diet without pharmacological treatment and sham rats with a balanced diet. Thus, histomorphometric analysis was performed, as well as expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, by the immunohistochemistry technique. To compare the mean values obtained in different groups and experimental periods, the data were analyzed by Kruskal-Wallis, Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn tests were further used as post-hoc techniques (α=.05). Results: In the long term, the SHAM and raloxifene groups showed the best bone formation rate (P <.05). The worst bone formation rate was observed in the untreated OVX group. Raloxifene and Alendronate groups improved bone formation rate when administered in osteoporotic animals. Raloxifene group had a better response in the long term. Alendronate group showed a favorable response at 14 days compared to Raloxifene group, but a reduced response at 42 days post-extraction. Immunohistochemistry revealed the expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, it was possible to note a mature bone at 14 days in the SHAM group balanced diet, and an immature bone in OVX group low calcium diet and an intermediate quality in the Alendronate and Raloxifene groups. Conclusion: Ovariectomy delays the alveolar wound healing process and interferes with the bone turnover. The ALE replacement and the RLX treatment improved the healing but... (Complete abstract click electronic access below)

Orientadora : Profª Drª Adriana Frolich Mercadante / Coorientador : Prof. Dr.Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 21/03/2017 / Inclui referências : f. 93-97 / Resumo: A proteína prion celular, ou PrPC, é uma proteína ancorada externamente à membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol. Sua conversão de uma forma fisiológica para uma isoforma mal dobrada e infecciosa, denominada scrapie, é responsável pelo aparecimento das doenças priônicas, também conhecidas como Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis. Para elucidar as funções fisiológicas de PrPC, são realizados estudos para se descobrir seus possíveis parceiros moleculares. Recentemente, resultados obtidos por nosso grupo identificaram dez possíveis ligantes para PrPC, dentre os quais destaca-se a vimentina, uma proteína de filamento intermediário. Em células com quantidade excessiva de proteína mal dobrada ou com inibição de proteassoma, há a formação de agressomos, estruturas pericentriolares com agregados de proteínas em seu centro e envoltos por uma gaiola de filamentos intermediários compostos principalmente por vimentina. Para esmiuçar a relação entre as proteínas PrPC e vimentina, verificar a formação de agressomos e suas possíveis consequências para as células, fizemos experimentos de Pull-Down, imunofluorescência, Western Blot, solubilidade em metanol e MTT em células HeLa e N2a. Foram testados tratamentos com DMSO, MG132 e Ciclosporina A (CsA), e transfecções com plasmídeos expressando GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, e mutantes de PrPC P104L e V179I. A interação entre as proteínas prion celular e vimentina pôde ser confirmada in vitro pela técnica de Pull-Down nas células HeLa. Inesperadamente, a viabilidade celular de HeLa e N2a não pareceu ser afetada por nenhum dos tratamentos testados. Nas imunofluorescências com ambas as células foi possível observar a formação de agressomos, principalmente nos tratamentos com MG132 e CsA, sendo o primeiro um inibidor de proteassoma e o segundo um inibidor da via das ciclofilinas. A formação desses agressomos parece estar ligada a uma redução na expressão de vimentina de ambas às células, e a um aumento da insolubilidade da proteína prion nas células N2a, mas não nas células HeLa. Palavras chave: Prion. Vimentina. Agressomos. Scrapie. / Abstract: The cellular prion protein, or PrPC, is a protein anchored to the external leaflet of the plasma membrana by a glycophosphatidylinositol molecule. Its conversion from a physiological isoform to a misfolded and infeccious one, named scrapie, is responsible for the prionic diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies. To elucidate the physiological functions of PrPC, studies are conducted to discover its possible molecular partners. Recently, studies done by our group found ten possible ligants for PrPC, among of them is the vimentin, a intermediate filament protein. In cells showing high levels of misfolded proteins or with proteasome inhibition, there is the formation of aggresomes, pericentriolar structures with protein aggregates on its center wrapped by a cage of intermediate filaments composed mostly by vimentin. To deeply investigate the relation between PrPC and vimentin proteins, to verify the formation of aggresomes and its possible consequences to the cells, we did Pull-Down, immunofluorescence, Western Blot, methanol solubility and MTT experiments in HeLa and N2a cells. We tested treatments with DMSO, MG132 and Cyclosporine A (CsA), and transfections with plasmids expressing GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, and PrPC mutants P104L and V179I. The interaction between cellular prion protein and vimentin could be confirmed in vitro by the Pull-Down technique in HeLa cells. Unexpectedly, the HeLa and N2a cell viability was not affected by none of the tested treatments. Immunofluorescence with both cells showed the formation of aggresomes, mainly in MG132 and CsA treatments, the first being a proteasome inhibitor and the second a cyclophilins route inhibitor. The formation of these aggresomes seems to be linked to a reduction in vimentin expression in both cells, and to an increase in insolubility of prion protein in N2a cells, but not in HeLa cells. Keywords: Prion. Vimentin. Aggresomes. Scrapie.

Workflows científicos são projetados para realizar experimentos in silico com o intuito de processar e analisar uma grande quantidade de dados usando simulação computacional. Os experimentos são organizados como uma sequência de etapas que caracterizam um fluxo de execução, onde em cada etapa utilizam-se diferentes softwares. Estes softwares não possuem um modelo de representação de dados comum. Por isto, quando um workflow científico é construído com o objetivo de integrar e processar dados, cada etapa precisa analisar a estrutura dos dados, processá-los e preparar os mesmos de acordo com a estrutura necessária para a execução da próxima etapa do workflow. Desta maneira, os workflows científicos usam diferentes algoritmos provenientes das áreas da matemática e da ciência da computação, os quais são capazes de processar, armazenar e transformar os dados utilizados em informação útil para diferentes análises de pesquisadores de biologia. Adicionalmente, a biologia de sistemas é uma subárea da bioinformática que ajuda a compreender as interações observadas entre populações de moléculas, células e organismos resultantes do aumento da complexidade biológica. Assim, nesta tese de doutorado, buscou-se desenvolver workflows científicos utilizando-se ferramentas de bioinformática e biologia de sistemas para comparar processos biológicos através da geração de redes de interação proteínaproteína. Para tanto, o programa Dis2PPI foi gerado por meio de um workflow científico que possibilitou integrar os bancos de dados de doenças monogênicas OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) com o programa de metabuscas STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins). O objetivo desta integração foi gerar uma rede de interação proteína-proteína associada com doenças de natureza monogênica. Como prova de conceito, o programa Dis2PPI foi utilizado para a obtenção de redes de interação para as síndromes xeroderma pigmentosa e de Cockayne, duas doenças monogênicas raras e cujos fenótipos estão associados com acúmulos de danos de DNA, câncer, progeria e neurodegeneração. Uma vez geradas, estas redes foram avaliadas com o uso ferramentas de biologia de sistemas para análise de ontologia gênica e de centralidade no programa Cytoscape. Da mesma forma, o programa Net2Homology foi gerado através de um desenho de um workflow científico que possibilitasse integrar o resultado de um alinhamento de sequências de proteínas, usando o programa NCBI PSI-BLAST, com o programa de metabuscas STRING. Neste sentido, o programa Net2Homology possibilitou recuperar duas redes de interação proteína-proteína associada a dois organismos diferentes. Este mesmo programa foi utilizado para a obtenção de redes de interação para a doença xeroderma pigmentosa e para a enzima ciclo-oxigenase-1 cruzando as informações dos organismos Homo sapiens e Mus musculus. As redes de interação obtidas foram comparadas visando obter os processos biológicos evolutivamente conservados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-17T12:38:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Daniel Luis Notari.pdf: 7846140 bytes, checksum: ebfd645042f867b8840d5ab9083411bc (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-17T12:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Daniel Luis Notari.pdf: 7846140 bytes, checksum: ebfd645042f867b8840d5ab9083411bc (MD5) / Scientific workflows can be used to design in silico experiments to process and analyse a great amount of data using computational simulation. In this sense, all in silico experiments are organized as a sequence of steps that characterize an execution flow, where each steps employ different softwares. It is important to note that these softwares do not employ a common structure or model to represent data. Thus, taking into account the diversity of softwares and data representation, a scientific workflow should be built to integrate and process data, where each step must be able to analyse the data structure, to process these data and finally generate a new data structure that provide the requirements needed to execute the next step of the workflow. It is important to note that scientific workflows use mathematics and computer sciences methods capable to process, storage, and transform these data into useful information. In addition, a subarea of Bioinformatics termed Systems biology helps to understand the interactions observed between populations of molecules, cells and organisms as the result of the increase of biological complexity. Thus, the purpose of this work was to develop scientific workflows using bioinformatics and system biology softwares with the purpose to compare different biological processes from the generation of proteinprotein interaction (PPI) networks. In this sense, the Dis2PPI software was design as a scientific workflow to integrate OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) database with metasearch program STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) in order to retrieve protein-protein interaction networks associated to monogenic diseases. The Dis2PPI was used to generate PPI networks for xeroderma pigmentosum and cockayne syndromes, two rare monogenic diseases associated with DNA damage, cancer, progeria, and neurodegeneration. The PPI networks generated were analyzed with Cytoscape program and specific plugins that evaluate gene ontologies and centrality analysis. By its turn, Net2Homology program was designed as a scientific workflow to integrate NCBI PSI-BLAST sequence alignments with STRING metasearch program to recovery PPI networks associate with two different species. In this sense, Net2Homology was used to obtain PPI network for xeroderma pigmentosum disease and cyclooxigenase-1 enzyme by crossing Homo sapiens and Mus musculus information. A comparison between these networks was realized to verify the major evolutively conserved biological process.