Orientador: Roberta Okamoto / Coorientador: Idelmo Rangel Garcia Júnior / Banca: Osvaldo Magro Filho / Banca: Teresa Lúcia Colussi Lamano / Resumo: Objetivos: Avaliar a influência do alendronato e raloxifeno no processo de reparo alveolar em ratas com osteoporose induzida (ovariectomizadas e submetidas a uma dieta pobre em cálcio). Materiais e Métodos: Sessenta e quatro ratas foram divididas em quatro grupos (n = 16) de acordo com o tratamento em ratas sham com dieta normal, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio sem tratamento medicamentoso, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com alendronato e ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com raloxifeno. Assim, a análise histomorfométrica foi realizada, bem como expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e RANKL, pela técnica de imunoistoquímica. Para comparar os valores médios obtidos nos diferentes grupos e períodos experimentais, os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn como post-hoc técnicas (α =. 05). Resultados: No longo prazo, os grupos SHAM e raloxifeno mostraram a melhor taxa de formação óssea (P <0,05). A pior taxa de formação óssea foi observado no grupo OVX ST. Os grupos raloxifeno e alendronato melhoram a taxa de formação óssea, quando administrados em animais com osteoporose. O grupo raloxifeno apresentou uma melhor resposta no longo prazo. O grupo alendronato mostrou uma resposta favorável em 14 dias comparado ao grupo raloxifeno, mas uma resposta reduzida aos 42 dias pós-extração. A imunoistoquímica revelou a expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e fator de RANKL. Foi possível notar um osso maduro no grupo SHAM aos 14 dias, um osso imaturo no grupo OVX ST e uma qualidade óssea intermediária nos grupos OVX ALE e OVX RAL. Conclusões: A ovariectomia associada a uma dieta pobre em cálcio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objectives: To evaluate the influence of alendronate and raloxifene in the alveolar healing process of rats with induced osteoporosis (ovariectomized and low calcium diet). Materials and Methods: The sixty-four rats were divided into four groups (n = 16) according to the treatment in ovariectomized rats with a low calcium diet treated with alendronate, ovariectomized rats with a low calcium diet raloxifene-treated, ovariectomized rats with a low calcium diet without pharmacological treatment and sham rats with a balanced diet. Thus, histomorphometric analysis was performed, as well as expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, by the immunohistochemistry technique. To compare the mean values obtained in different groups and experimental periods, the data were analyzed by Kruskal-Wallis, Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn tests were further used as post-hoc techniques (α=.05). Results: In the long term, the SHAM and raloxifene groups showed the best bone formation rate (P <.05). The worst bone formation rate was observed in the untreated OVX group. Raloxifene and Alendronate groups improved bone formation rate when administered in osteoporotic animals. Raloxifene group had a better response in the long term. Alendronate group showed a favorable response at 14 days compared to Raloxifene group, but a reduced response at 42 days post-extraction. Immunohistochemistry revealed the expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, it was possible to note a mature bone at 14 days in the SHAM group balanced diet, and an immature bone in OVX group low calcium diet and an intermediate quality in the Alendronate and Raloxifene groups. Conclusion: Ovariectomy delays the alveolar wound healing process and interferes with the bone turnover. The ALE replacement and the RLX treatment improved the healing but... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-17Bitstream added on 2014-06-13T20:11:18Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_gr_me_araca.pdf: 556516 bytes, checksum: 8d23ba97d725bab4ae5efc4ab23aac97 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Objetivos: Avaliar a influência do alendronato e raloxifeno no processo de reparo alveolar em ratas com osteoporose induzida (ovariectomizadas e submetidas a uma dieta pobre em cálcio). Materiais e Métodos: Sessenta e quatro ratas foram divididas em quatro grupos (n = 16) de acordo com o tratamento em ratas sham com dieta normal, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio sem tratamento medicamentoso, ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com alendronato e ratas ovariectomizadas com uma dieta pobre em cálcio tratadas com raloxifeno. Assim, a análise histomorfométrica foi realizada, bem como expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e RANKL, pela técnica de imunoistoquímica. Para comparar os valores médios obtidos nos diferentes grupos e períodos experimentais, os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn como post-hoc técnicas (α =. 05). Resultados: No longo prazo, os grupos SHAM e raloxifeno mostraram a melhor taxa de formação óssea (P <0,05). A pior taxa de formação óssea foi observado no grupo OVX ST. Os grupos raloxifeno e alendronato melhoram a taxa de formação óssea, quando administrados em animais com osteoporose. O grupo raloxifeno apresentou uma melhor resposta no longo prazo. O grupo alendronato mostrou uma resposta favorável em 14 dias comparado ao grupo raloxifeno, mas uma resposta reduzida aos 42 dias pós-extração. A imunoistoquímica revelou a expressão da proteína TRAP, osteocalcina, osteoprotegerina (OPG) e fator de RANKL. Foi possível notar um osso maduro no grupo SHAM aos 14 dias, um osso imaturo no grupo OVX ST e uma qualidade óssea intermediária nos grupos OVX ALE e OVX RAL. Conclusões: A ovariectomia associada a uma dieta pobre em cálcio... / Objectives: To evaluate the influence of alendronate and raloxifene in the alveolar healing process of rats with induced osteoporosis (ovariectomized and low calcium diet). Materials and Methods: The sixty-four rats were divided into four groups (n = 16) according to the treatment in ovariectomized rats with a low calcium diet treated with alendronate, ovariectomized rats with a low calcium diet raloxifene-treated, ovariectomized rats with a low calcium diet without pharmacological treatment and sham rats with a balanced diet. Thus, histomorphometric analysis was performed, as well as expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, by the immunohistochemistry technique. To compare the mean values obtained in different groups and experimental periods, the data were analyzed by Kruskal-Wallis, Nemenyi-Damico-Wolfe-Dunn tests were further used as post-hoc techniques (α=.05). Results: In the long term, the SHAM and raloxifene groups showed the best bone formation rate (P <.05). The worst bone formation rate was observed in the untreated OVX group. Raloxifene and Alendronate groups improved bone formation rate when administered in osteoporotic animals. Raloxifene group had a better response in the long term. Alendronate group showed a favorable response at 14 days compared to Raloxifene group, but a reduced response at 42 days post-extraction. Immunohistochemistry revealed the expression of TRAP protein, osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and RANKL, it was possible to note a mature bone at 14 days in the SHAM group balanced diet, and an immature bone in OVX group low calcium diet and an intermediate quality in the Alendronate and Raloxifene groups. Conclusion: Ovariectomy delays the alveolar wound healing process and interferes with the bone turnover. The ALE replacement and the RLX treatment improved the healing but... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Pedro de Magalhães Padilha / Coorientador: Luís Artur Loyola Charduto / Banca: Luciana Francisco Fleury / Banca: Angélica Simone Cravo Pereira / Resumo: O presente trabalho retrata estudo metaloproteômico no tecido muscular de bovinos da raça Nelore (Bos indicus) contrastantes para a característica de maciez da carne baseado em métodos de separação de proteínas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), identificação dos íons cálcio nos spots proteicos por fluorescência de raio-X (SR-XRF) e caracterização das proteínas por espectrometria de massas (ESI-MS). Os animais selecionados para compor o grupo M (carne macia) expressaram valores de força de cisalhamento (FC) entre 3,39 e 3,98 kg, já os animais selecionados para o grupo D (carne dura) expressaram valores de FC entre 7,11 e 7,45 kg. Foi incluído um terceiro grupo (P) de animais da raça Piemontês (Bos taurus) como modelo comparativo do grau de maciez da carne. O número médio de spots proteicos encontrados nas repetições dos géis dos grupos M, D e P foram de 186 ± 20, 146,5 ± 16,5 e 175 ± 15, respectivamente. As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína. A maior detecção (56%) qualitativa de cálcio por SR-XRF nos spots proteicos de animais com carne macia é um indicativo da ocorrência da atividade proteolítica no tecido muscular durante o período post mortem. A 2D-PAGE foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes em amostras de tecido muscular (Longissimus dorsi). As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína / Abstract: The present article describes a metalloproteomics study of bovine muscle tissue with different grades of meat tenderness from animals of the Nellore breed (Bos indicus) based on protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), the identification of calcium ions in protein spots by Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence (SR-XRF) and the characterization of proteins by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The meat from the animals selected to form the Te group (tender meat) expressed shear force (SF) values ranging from 3.39 to 3.98 kg, and the meat from the animals selected for the To group (tough meat) expressed values ranging from SF 7.11 to 7.45 kg. A third group (P) of Piedmontese animals (Bos taurus) was included as a comparative model for the level of meat tenderness. The mean number of protein spots found in the gel replicates of the Te, To and P groups were 186 ± 20, 146.5 ± 16.5 and 175 ± 15, respectively. The correlations found in the gel replicates indicated that the total protein extraction procedures were efficient and preserved the metal-protein structure. The higher qualitative detection of calcium (56%) by SR-XRF in the protein spots of animals with tender meat was indicative of the occurrence of proteolytic activity in the muscle tissue during the post mortem period. The 2D-PAGE was efficient fractionation of proteins present in muscle tissue samples (Longissimus dorsi). The correlations obtained in repetitions of the gels indicated that the procedures for extraction of total protein were efficient and preserved the structure metal-protein / Mestre

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-13Bitstream added on 2015-05-14T16:59:00Z : No. of bitstreams: 1 000829164.pdf: 1229097 bytes, checksum: c02b3e98095839e2ebc9ba29eeeeba97 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-14Bitstream added on 2014-06-13T20:08:43Z : No. of bitstreams: 1 000754514.pdf: 1170892 bytes, checksum: 2e07af1d94d3f5fbc4f47fea88dd613c (MD5) / O presente trabalho retrata estudo metaloproteômico no tecido muscular de bovinos da raça Nelore (Bos indicus) contrastantes para a característica de maciez da carne baseado em métodos de separação de proteínas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), identificação dos íons cálcio nos spots proteicos por fluorescência de raio-X (SR-XRF) e caracterização das proteínas por espectrometria de massas (ESI-MS). Os animais selecionados para compor o grupo M (carne macia) expressaram valores de força de cisalhamento (FC) entre 3,39 e 3,98 kg, já os animais selecionados para o grupo D (carne dura) expressaram valores de FC entre 7,11 e 7,45 kg. Foi incluído um terceiro grupo (P) de animais da raça Piemontês (Bos taurus) como modelo comparativo do grau de maciez da carne. O número médio de spots proteicos encontrados nas repetições dos géis dos grupos M, D e P foram de 186 ± 20, 146,5 ± 16,5 e 175 ± 15, respectivamente. As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína. A maior detecção (56%) qualitativa de cálcio por SR-XRF nos spots proteicos de animais com carne macia é um indicativo da ocorrência da atividade proteolítica no tecido muscular durante o período post mortem. A 2D-PAGE foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes em amostras de tecido muscular (Longissimus dorsi). As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína / The present article describes a metalloproteomics study of bovine muscle tissue with different grades of meat tenderness from animals of the Nellore breed (Bos indicus) based on protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), the identification of calcium ions in protein spots by Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence (SR-XRF) and the characterization of proteins by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The meat from the animals selected to form the Te group (tender meat) expressed shear force (SF) values ranging from 3.39 to 3.98 kg, and the meat from the animals selected for the To group (tough meat) expressed values ranging from SF 7.11 to 7.45 kg. A third group (P) of Piedmontese animals (Bos taurus) was included as a comparative model for the level of meat tenderness. The mean number of protein spots found in the gel replicates of the Te, To and P groups were 186 ± 20, 146.5 ± 16.5 and 175 ± 15, respectively. The correlations found in the gel replicates indicated that the total protein extraction procedures were efficient and preserved the metal-protein structure. The higher qualitative detection of calcium (56%) by SR-XRF in the protein spots of animals with tender meat was indicative of the occurrence of proteolytic activity in the muscle tissue during the post mortem period. The 2D-PAGE was efficient fractionation of proteins present in muscle tissue samples (Longissimus dorsi). The correlations obtained in repetitions of the gels indicated that the procedures for extraction of total protein were efficient and preserved the structure metal-protein

Orientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Andrea Akemi Hoshino / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcos César Gonçalves / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / Abstract: RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ... / Doutor

A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe&#8594;Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp&#8594;Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp &#8594; Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp &#8594; Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe&#8594;Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp&#8594;Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.

A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe&#8594;Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp&#8594;Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp &#8594; Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp &#8594; Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe&#8594;Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp&#8594;Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.