Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-16T17:23:07Z No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As α2-macroglobulinas (A2M) são proteínas de alto peso molecular que atuam como inibidoras de amplo espectro de proteases. Essa inibição ocorre por meio de um mecanismo que envolve o aprisionamento físico da protease seguido pela formação de uma ligação covalente entre ambas as proteínas. A capacidade de captura das diversas classes de proteases poderia permitir sua utilização na identificação das mesmas em extratos celulares, podendo ser aplicada tanto na descoberta de novas proteases como na detecção de proteases alvo. Esse trabalho tem por objetivo caracterizar biofisicamente a α2-macroglobulina de Salmonella enterica e avaliar sua potencial utilização na identificação de proteases. A proteína foi expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Foram realizados ensaios de dicroísmo circular a fim de verificar seu padrão de estrutura secundária em diferentes pH, bem como sua estabilidade térmica (25-95 ºC). Ensaios de fluorescência foram realizados com o intuito de analisar mudanças estruturais sofridas em uma ampla faixa de pH (3,5-9,0). Experimentos de ultracentrifugação analítica foram realizados a fim de compreender melhor a interação entre a A2M e a tripsina. Tanto a capacidade de ligar-se a proteases, como a habilidade em capturar proteases quando ligada em coluna foram testadas utilizando-se tripsina. Confirmadas tais capacidades, foram realizados testes com os extratos de Escherichia coli, Vigna unguiculata e Pichia pastoris a fim de detectar proteases ali presentes. As proteínas foram submetidas à proteólise e analisadas por espectrometria de massas. Houve mudanças no padrão de estrutura secundária quando a proteína foi submetida a pH ácidos e básicos (4,0 e 9,0) quando comparado ao pH próximo da neutralidade (7,5). Durante sua desnaturação térmica verificou-se que há agregação em temperaturas superiores a ~47ºC em todos os pH testados (4,0, 7,5 e 9,0), demostrando que a proteína não é estável termicamente. Foi observado que a proteína quando ligada à tripsina apresenta um padrão eletroforético e um perfil de eluição em gel filtração que indica a ocorrência de mudança conformacional. Entretanto, não foi obtido o mesmo resultado nos experimentos de ultracentrifugação analítica. A A2M aparenta formar dímeros, principalmente quando na presença da tripsina. Não houve a detecção de proteases nos testes com os extratos celulares testados. Contudo, tais testes devem ser aprimorados para um resultado mais confiável. / α2-macroglobulins (A2M) are high molecular weight proteins that act as broad spectrum peptidase inhibitors. The inhibition occurs by a mechanism that involves the capture of the peptidase followed by the formation of a covalent bond between the two proteins. The capture of all the peptidases classes could allow its utilization in the identification of these proteins in cellular extracts, being possibly applied in the discovery of new peptidases and in the detection of target peptidases. The aim of this work was the biophysical characterization of the α2-macroglobulin from Salmonella enterica and evaluation of its potential use in the identification of proteases. The recombinant A2M protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by immobilized metal ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Circular dichroism assays were performed in order to verify the A2M secondary structure in different pH conditions, as well as its thermal stability in a temperature range of 25-95 ºC. Fluorescence spectroscopy assays were performed to analyze structural changes in a wide range of pH (3.5-9.0). The ability of A2M to bind peptidases and its capacity to capture peptidases when immobilized to a column were tested using trypsin. Once these abilities were confirmed, tests were carried out with extracts of Escherichia coli, Vigna unguiculata and Pichia pastoris in order to identify its captured peptidases. Proteins were hydrolyzed and analyzed by mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation experiments were performed in order to better understand the interaction between A2M and trypsin. There were changes in the secondary structure when the protein was subjected to acid and basic pH (4.0 and 9.0) when compared to neutral pH (7.5). During its thermal denaturation it was found that there is aggregation at temperatures above ~ 47 ° C in all tested pH conditions (4.0, 7.5 and 9.0), showing that the protein is not thermally stable. It was verified that the protein when bound to trypsin has an electrophoretic migration and a gel filtration elution profile that indicates the occurrence of conformational change. However, the same result was not observed with the analytical ultracentrifugation experiments. A2M seems to form dimers, especially in the presence of trypsin. There was no detection of peptidase in the tests with the cell extracts. However, such tests must be improved for a more reliable result.

Tesis Magister en Ciencias Odontológicas con Mención en Patología y Medicina Oral / La diabetes tipo 2 (DM2) es la enfermedad metabólica más frecuente del mundo. Si no es rigurosamente controlada por parte del sujeto afectado, puede comprometerse la integridad de sistemas y órganos y consecuentemente, derivar en el desarrollo de alteraciones renales, cardiovasculares, neurológicas, orales aumentar la predisposición a infecciones oportunistas. La medición continua de los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c), es fundamental para prevenir las complicaciones derivadas de la progresión de la enfermedad ya que mide en sangre, el porcentaje de hemoglobina unida a la glucosa en un lapso de 90 días. Este valor en definitiva, representa el grado de control metabólico de la enfermedad. El objetivo de un adecuado control de la DM2, es mantener una HbA1c por debajo de 7% y de esta forma, evitar las complicaciones asociadas. Actualmente los biomarcadores en saliva, son utilizados como método de diagnóstico e indicativos del grado de progresión y control, de diferentes enfermedades tanto orales como sistémicas. Un estudio reciente demostró que los niveles de la proteína α-2-macroglobulina (A2MG) detectados en saliva presentan un incremento significativo en sujetos con DM2 en comparación con aquellos sujetos en estados pre diabético. El objetivo de este estudio fue evaluar la asociación que existe entre A2MG detectada en saliva en sujetos con DM2 y los valores de HbA1. Se reclutaron 120 sujetos con diagnóstico de DM2 a los cuales se les tomó una muestra de saliva para determinar la concentración de A2MG a través de la técnica de ELISA. Posteriormente se correlacionó esta variable con los valores de HbA1 obtenidos en sangre en cada individuo. Además, se asociaron los niveles de A2MG con otras variables, como la velocidad de flujo salival (VFS), pH y concentración de proteínas. El análisis de los resultados muestra una correlación positiva entre A2MG y HbA1. También observamos una correlación positiva entre las variables A2MG y concentración de proteínas en saliva y una correlación negativa entre A2MG y pH salival. Estos resultados sugieren que la determinación de A2MG en saliva es una alternativa de evaluación de control metabólico de la diabetes que eventualmente podría complementar o reemplazar a la HbA1, ya que es un procedimiento más sencillo, no invasivo y de bajo costo que podría favorecer una mayor adherencia a los mecanismos de control de la enfermedad por parte de los sujetos enfermos y mejorar su calidad de vida. / Tesis adscrita a proyecto FIOUCH 13-002