Orientador: Mário Sérgio Palma / Banca: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: João Rugiero Neto / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Marcos Roberto de M. Fontes / Resumo: Hoje em dia, em todo o mundo, existem algumas doenças responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em humanos. Dentre essas doenças, pode-se destacar a tuberculose, infecção provocada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que é a principal causa de morte em humanos devido a um único agente infeccioso. Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de novas drogas é premente para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico, representam bons exemplos da utilidade de tal abordagem aplicada a constituintes enzimáticos de uma rota metabólica. A via do ácido chiquímico é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos, do ácido p-aminobenzóico e outros metabólitos essenciais, tais como ubiquinona, menaquinona e vitamina K. A via do chiquimato, encontrada em plantas, algas, fungos e bactérias, foi também encontrada recentemente em vários parasitas apicomplexos (Roberts et al.; 1998); entretanto, essa via metabólica não é encontrada em mamíferos. As enzimas Chiquimato Quinase e 5-Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS), a quinta e a sexta enzimas, respectivamente, nessa via metabólica, têm sido reconhecidas como alvos importantes para o desenvolvimento de herbicidas e drogas antibióticas. No presente estudo, a troca isotópica Hidrogênio / Deutério e a espectrometria de massas com ionização electrospray foram usadas para examinar as mudanças conformacionais em solução, sofridas pelas enzimas Chiquimato Quinase e 5- Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS) de Mycobacterium tuberculosis, tanto na presença como na ausência de alguns de seus ligantes. A incorporação de deutério foi observada para ambas as enzimas. Para a EPSPS, a apoenzima foi a forma que mais incorporou deutério ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays all around the world there are some diseases that cause a high index of human lethality. Among these it should be highlighted the infectious disease tuberculosis, which is the top deadly disease caused by only one agent, the bacteria Mycobacterium tuberculosis. As the currently available drugs are not suitable for the control of tuberculosis, it became vital the development of novel drugs for this purpose. Useful drugs are being developed to inhibit some enzymes of the shikimic acid pathway. This via is responsible for the synthesis of aromatic amino acids, such as the p-aminobenzoic acid and other essential metabolites, such as ubiquinone, menaquinone and K vitamin. The shikimate pathway exists in plants, algae, fungi, bacteria and was also found in some apicomplex parasites; however, it is not present in mammals. The Shikimate Kinase and 5-Enol-Pyruvyl-Shikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS), the fifth and sixth enzymes, respectively, present in this pathway, have been considered as important targets to development of herbicides and antibiotic drugs. In the present work the isotopic change Hydrogen/Deuterium and the electrospray ionization mass spectrometry were used to investigate the occurrence of conformational in both enzymes, in presence and absence of some of their ligands (substrates /inhibitors). The deuterium incorporation was observed in both enzymes. The apoenzyme of EPSPS, incorporated more deuterium then the enzyme complexed to phosphoenolpiruvate, which in turn incorporated more deuterium than the enzyme compled to glyphosate. The apoenzyme of Shikimate Kinase also incorporated more deuterium than the complexed form with magnesium chloride-shiquimic acid-ADP. In both enzymes, the regions less dynamics were those containing the amino acids residues of the binding sites of substrates and/or inhibitors... (Complete abstract click eletronic access below) / Doutor

Orientador: Ivan de Godoy Maia / Resumo: Proteínas desacopladoras (UCPs; do inglês uncoupling proteins) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial que desacoplam a respiração da síntese de ATP. UCPs geram um fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna, dependente de ácidos graxos e sensível a nucleotídeos purínicos (PN). No presente trabalho, foram realizados vários estudos empregando UCPs de plantas (pUCP). Inicialmente, foi empreendida a caracterização bioquímica de uma UCP de milho (Zea mays; ZmUCP), representativa de espécies monocotiledôneas. Essa proteína, quando expressa em Escherichia coli e reconstituída em lipossomos, foi capaz de induzir um fluxo de prótons dependente de ácido linoléico (LA) e sensível a ATP com valores de Km, Vmax e Ki similares àqueles observados para pUCPs de espécies dicotiledôneas. A ZmUCP foi utilizada para investigar a importância de um par de histidinas presente no segundo loop matricial da UCP1 de mamíferos e ausente nas pUCPs. A introdução do referido par de histidinas na ZmUCP (Lys155His e Ala157His) provocou um aumento na afinidade por LA enquanto que a sua atividade permaneceu inalterada. Em um estudo mais abrangente de estrutura-função, mutações pontuais nos resíduos Lys147, Arg155 e Tyr269, localizados nas chamadas assinaturas das UCPs, e Cys28 e His83, específicos para pUCPs, foram introduzidas na proteína AtUCP1 de Arabidopsis. Os efeitos de tais mutações nas propriedades bioquímicas da AtUCP1 foram examinados usando sistema de reconstituição em lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial para a afinidade da AtUCP1 por LA enquanto que His83 tem importante função na atividade de transporte. Os resíduos Cys28, Lys147, e também Tyr269, são importantes para a correta funcionalidade da AtUCP1, já que suas substituições... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins, which uncouple respiration from ATP synthesis. UCPs mediate a fatty acid (FA)-dependent, purine nucleotide (PN)-inhibitable proton flux across the inner membrane mitochondrial. In the present study, several assays on plant UCPs (pUCP) were performed. Firstly, we biochemically characterized an UCP from maize (Zea mays; ZmUCP), a representative uncoupling protein from monocot species. This protein was expressed in Escherichia coli and reconstituted in liposomes. ZmUCP was fully active and induced a linoleic acid-dependent proton flux that was sensitive to ATP. The obtained Km, Vmax and Ki values were similar to those observed for dicot pUCPs. ZmUCP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the second matrix loop of mammalian UCP1 and absent in pUCPs. ZmUCP with the introduced histidine pair (Lys155His and Ala157His) displayed increased LA-affinity while its activity remained unchanged. In a subsequent study using AtUCP1, point mutations were introduced in amino acid residues Lys147, Arg155 and Tyr269, located inside the so-called UCP-signatures, and Cys28 and His83, specific for pUCPs. The effects of amino acid replacements on AtUCP1 biochemical properties were examined using reconstituted liposomes. Residue Arg155 appears to be crucial for AtUCP1 affinity to LA whereas His83 plays an important role in transport activity. Residues Cys28, Lys147, and also Tyr269 are important for correct AtUCP1 function, as their substitutions affected either the AtUCP1 affinity to LA and its transport activity, or sensitivity to PN inhibitors. Furthermore, we analyzed the expression profiles of the six genes encoding pUCP in Arabidopsis thaliana (AtUCP1-6) in response to salt (NaCl) and osmotic (mannitol)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Coorientador: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Banca: Iran Malavazi / Resumo: Os organismos pertencentes ao reino dos fungos têm exercido um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos moleculares de organismos eucariotos devido as suas facilidades de manipulação e o conhecimento das características genéticas e bioquímicas envolvidas em seu ciclo de vida. Neurospora crassa é um fungo cujos mecanismos genéticos e bioquímicos básicos são bem definidos, e por isso tem sido muito usado como um sistema modelo em pesquisas que visam à elucidação de processos celulares complexos. Em trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório foram identificadas algumas proteínas que se ligam à região promotora do gene gsn que codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória no processo de síntese de glicogênio. O presente trabalho teve como objetivo estudar algumas dessas proteínas, anotadas como hipotéticas, numa tentativa de entender melhor as suas participações no mecanismo de regulação. Para isto linhagens mutantes nos genes que codificam as referidas proteínas foram adquiridas junto ao Fungal Genetics Stock Center. Análises de determinação do conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes foram realizadas tanto em condições normais de crescimento (30º C) como em situações de choque térmico (45º C). Todas as linhagens mutantes avaliadas apresentaram um perfil de acúmulo de glicogênio semelhante ao da linhagem selvagem, isto é, todas apresentaram uma queda nas quantidades de glicogênio após o choque térmico. Entretanto a linhagem mutante na ORF NCU06679 apresentou o conteúdo de glicogênio mais reduzido, em ambas as situações ambientais (antes e depois do choque térmico). Com o objetivo de verificar o envolvimento das proteínas estudadas na expressão do gene gsn, experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que na situação de estresse térmico, os níveis do transcrito gsn diminuem semelhantemente... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The organisms belonging to the kingdom of fungi have played a key role in advancing the understanding of the molecular mechanisms of eukaryotic organisms due to their easy handling and the genetic and biochemical mechanisms involved in their life cycle. Neurospora crassa is a fungus whose basic biochemical and genetic mechanisms are well defined, and therefore has been widely used as a model system in studies aimed to elucidate complex cellular processes. In a previous work developed in our laboratory we identified some proteins that bind to the promoter region of the gsn gene that encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in the glycogen synthesis. This work aimed to start studying these proteins, annotated as hypothetical proteins, in an attempt to better understand their roles in the regulation of glycogen metabolism. For this, mutant strains in genes encoding the proteins were purchased from the Fungal Genetics Stock Center. Analysis of glycogen determination were performed in the mutant strains both under normal growth (30º C) and under heat shock condition (45º C). All mutant strains showed a glycogen content profile similar to the wild type strain, that is, all showed a decrease in the amounts of glycogen after heat shock. However the mutant strain in the ORF NCU06679 presented lower glycogen content compared to the wild type strain, in both environmental condition (before and after heat shock). To verify the participation of the proteins in the gsn gene expression, Northern blot experiments were performed and showed that under heat stress the gsn transcript levels decreased similarly to that observed in the wild type strain. However the reduction in the gene expression was higher in the mutant strain containing the ORF NCUO6679 knocked out / Mestre

Orientador: Marinômio Lopes Cornélio / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Luiz Alberto Colnago / Resumo: Neste trabalho a tripsina pancreática bovina é utilizada como proteína alvo na aplicação da espectroscopia de correlação bidimensional investigando os processos de desenovelamento e re-enovelamento. A espectroscopia de correlação bidimensional generalizada proposta por Noda (Noda, 1993) tem crescido em aplicações e novas técnicas de correlação 2D têm sido desenvolvidas. Assim como em RMN 2D, picos espectrais são espalhados em uma segunda dimensão, simplificando a visualização de espectros complexos, por serem constituídos de bandas sobrepostas ajudando na resolução espectral, de similar modo foi desenvolvido técnicas de analises para o infravermelho. O desenvolvimento de um software para obtenção da correlação generalizada e correlação sample-sample (Sasic, et al., 2000) foi uma etapa importante neste estudo, entretanto a associação entre estes resultados torna a abordagem do problema de desenovelamento e re-enovelamento mais rica em detalhes. A análise de correlação bidimensional sample-sample (2D-SS) indica uma temperatura de desenovelamento em 48°C que é corroborado por DSC (49C). Além dessa, temperaturas de pré-transição em 31°, 37° e 43°C e pós-transição em 54°, 59° e 69°C foram reveladas por 2D sample-sample. O perfil do termograma obtido por DSC indica que o processo de desenovelamento é do tipo múltiplo estado o que valida a descoberta de temperaturas de pré e pós-transição. A análise generalizada revela as estruturas secundárias e os eventos seqüenciais envolvidos em cada uma destas transições. A partir da equação de van't Hoff é obtido o valor da entalpia de desenovelamento 28,1 kcal/mol, já a análise calorimétrica por sua vez fornece um valor para a entalpia aparente de 59,3 kcal/mol. / Abstract: In this work the bovine pancreatic trypsin is used as the target protein in the application of two-dimensional correlation spectroscopy investigating the processes of unfolding and refolding. The two-dimensional generalized correlation spectroscopy proposed by Noda (Noda, 1993) has grown into applications and new 2D correlation techniques have been developed. As well as in 2D NMR spectral peaks are spread across a second dimension, simplifying the complex spectra view because they are made up of overlapping bands increasing the spectral resolution of similar way was developed techniques of analysis to the infrared technique. The development of software for obtaining generalized correlation and correlation sample-sample (Sasic, et al., 2000) was an important step in this study, however the association between these results makes the approach to the problem of unfolding and refolding richer in detail. The two-dimensional sample-sample correlation analysis (2D-SS) indicates a temperature of unfolding at 48 °C which is corroborated by DSC (49 °C). In addition to this, pre transitions temperatures in 31 ° 37° and 43 °C and post transition in 54°, 59° and 69°C were revealed by 2D-SS. The profile of the thermogram obtained by DSC indicates that the process of unfolding is of the type of multiple state that validates the discovery of temperatures of pre and post transition. The generalized analysis reveals the secondary structures and sequential events involved in each of these transitions. From the van't Hoff equation is retrieved a value of the unfolding enthalpy of 28.1 kcal/mol, from the calorimetric analysis the value for the apparent enthalpy was 59.3 kcal/mol. / Mestre

Orientador: Débora Colombi / Banca: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Aparecida Érica Bighetti Ribas / Resumo: Para que a integridade da pele seja mantida é necessário que haja distribuição de água nas camadas epidérmica e dérmica, manutenção das propriedades de barreira da pele, além da manutenção da integridade estrutural, elasticidade e resiliência deste tecido. O objetivo deste estudo foi avaliar se o extrato de Bidens pilosa é capaz de modular a expressão dos genes AQP3, AQP9, AQP10, filagrina, involucrina, fibronectina e se este extrato é capaz de aumentar a quantidade de colágeno, elastina e GAGs. Esta avaliação foi realizada através da técnica de PCR em tempo real, utilizando culturas queratinócitos comerciais incubadas com extrato hidroglicólico de Bidens pilosa (EHBP) na concentração de 5,00 mg/ml nos tempos de 0, 3, 6 e 12 horas e em diferentes concentrações do EHBP (2,50; 5,00 e 10,00 mg/ml) para a análise de expressão dos genes da epiderme, além do p53, importante supressor tumoral. Cultura de fibroblastos foram incubados também com o extrato por 48 horas para análise do EHBP sobre a produção de colágeno, elastina e GAGs. O tratamento das culturas de queratinócitos com EHBP no tempo de 6 horas em diferentes concentrações se mostrou capaz de modular positivamente a expressão dos genes AQP3, AQP9, fibronectina e involucrina, porém não foi possível a análise da expressão gênica da AQP10 e filagrina. A expressão de p53 não foi modulada pelo tratamento com EHBP nas concentrações de 2,50 e 5,00 mg/ml, além disso, o EHBP se mostrou eficaz em aumentar a quantidade proteínas dérmicas em sobrenadante de cultura de fibroblastos. Nosso trabalho sugere que o uso do extrato hidroglicólico de Bidens pilosa pode modular positivamente a expressão dos genes relacionados à hidratação da epiderme e integridade desta camada por modular genes de expressão tardia de diferenciação de queratinócitos, e integridade, elasticidade e resiliência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To maintaining the integrity of the skin, it is necessary water distribution on epidermis and dermis, barrier properties of the skin maintenance, in addition to structural integrity maintenance, elasticity and tissue resilience. The aim of this study was evaluate if Bidens pilosa extract can modulate AQP3, AQP9, AQP10, filaggrin, involucrin, fibronectin expression and if this extract can improve collagen, elastin and GAGs. This evaluation was performed by real time PCR, with commercial keratinocytes incubated with hydroglycolic extract of Bidens pilosa (EHBP) at 5.0 mg/ml in times of 3, 6 e 12 hours and at different concentrations of EHBP (2.50, 5.00 and 10.00 mg/ml) to epidermal genes expression analyze, in addition to p53, a important tumor suppressor. Fibroblasts culture were also incubated with the extract for 48 hours to access the effect of EHBP on collagen, elastin and GAGs production. The culture keratinocytes treatment with EHBP with 6 hours of incubation with different concentrations of extract was capable to up-regulates AQP3, AQP9, fibronectina and involucrin gene expression, but it was not possible AQP10 and filaggrin gene expression analysis. The expression of p53 was not modulated by 2.50 and 5.00 mg/ml concentrations of EHBP, moreover, EHBP can increase dermal proteins amounts in fibroblasts culture supernatants. Our observation suggests that hydroglycolic extract of Bidens pilosa can modulate positively the expression of genes related with epidermal hydration and integrity of this layer because can modulate late expression on keratinocytes differentiation genes, and integrity, elasticity and resilience of skin by increasing amounts of dermal proteins and is unable to modulate p53 expression, suggesting absence of short-term correlation, between EHBP and cancer. Moreover, the lack of expression results to AQP10 puts in doubt the presence of this aquaglyceroporin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo mapear os domínios de interação da proteína LaRbp38 (RNA binding protein 38 KD) de Leishmania amazonensis com ácidos nucléicos e a identificação de proteínas parceiras que formassem possíveis complexos com ela nos telômeros do parasita. LaRbp38 é uma proteína exclusiva de protozoários tripanosomatídeos, entre os quais estão os agentes etiológicos da leishmaniose, uma doença endêmica presente em diversas regiões do Brasil. Novos casos da doença vêm aumentando progressivamente, principalmente entre indivíduos imunocomprometidos e por isso a Organização Mundial da Saúde tem incentivado a busca de novos alvos para desenvolver drogas que eliminem eficazmente o parasita. LaRbp38 é uma proteína codificada por um gene nuclear, que parece exercer diferentes funções nas maquinarias de replicação nuclear e mitocondrial. Foi primeiramente descrita como proteína estabilizadora de RNA mitocondrial e parece estar envolvida com a replicação de DNA mitocondrial. Em Leishmania, LaRbp38 também interage in vivo com DNA mitocondrial, com seqüências ricas em GT e com DNA telomérico simples e dupla fita. A análise estrutural da proteína não indica a presença de nenhum domínio canônico de interação a ácidos nucléicos. Para dar inicio aos experimentos, a primeira estratégia foi desenhar mutantes delecionais da proteína de L. amazonensis (LaRbp38) de forma que cada um representa uma sobreposição do outro. Cada mutante, nomeados mut1, mut2, mut3, mut4 e mut5, foram subclonados em vetor de expressão bacteriano para produção de polipeptídios recombinantes. Em seguida os polipeptídios foram purificados e testados em western blotting, que mostra tanto LaRbp38 quantos os 5 mutantes sendo reconhecidas pelo soro antLLaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA (EMSA), usando DNA telomérico simples fita Te11, dupla fita... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Recent results demonstrated that Rbp38 is a protein exclusively expressed in trypanosomatid parasites, which includes the genus Leishmania. Rbp38 is a multifunctional protein exerting functions in the kinetoplast, such as the stabilization of mitochondrial RNAs and in the nucleus, as a protein that binds in vivo kDNA, the double-stranded (LaTel) and the G-rich telomeric DNAs (Tel1). The trypanosomatid Rbp38 does not share sequénce or functional/structural similarities with any other protein deposited in the public data bank. The present work has the aim of mapping the boundaries of the DNA-binding domain of LaRBP38, since using the available in silico tools, we were not able to define any known nucleic acid binding domain in this protein. Therefore, we constructed truncated overlapping mutants of LaRbp38 in order to map the boundaries of its DNA binding domain. These mutant proteins were expressed in a bacterial system and were produced in high amounts as shown by SDS-PAGE and Western blotting analyses. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were done in order to test the ability of each mutant to bind in vitro the G-rich telomeric DNA, double-stranded telomeric DNA and kDNA. EMSA and competition assays confirmed that LaRbp38 has at least one DNA binding domain (DBD), centrally located, between amino acid residues 141 and 235. This DBD, interacts with distinct affinities with ali DNAs tested. Our results suggested that this binding domain has at least two extensions one towards the N-terminus of mut2 (aa 95 and 141), which showed binding affinity to LaTel and kDNA and other towards the C-terminus of mut3 (aa 235 to283) that strongly interacted with kDNA. However, we can not discard that others parts of the protein may also contribute to these interactions. Other controversial point about LaRbp38 is whether this protein has nuclear and mitochrondrial subcelular localization... (Completo abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Teresa Marques Novo / Coorientador: Oswaldo Garcia Junior / Banca: Sandro Roberto Valentini / Banca: Gilberto Moraes / Banca: Lucio Fabio Caldas Ferraz / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans (A. ferrooxidans) é uma bactéria quimioautotrófica capaz de oxidar íon ferroso ou sulfetos minerais para a obtenção de energia. Bornita e calcopirita são dois sulfetos de cobre que possuem a mesma composição elementar, mas diferem na susceptibilidade para a biolixiviação. Este trabalho teve por objetivo a análise proteômica diferencial de A. ferrooxidans em resposta à mudança do substrato íon ferroso para os sulfetos minerais calcopirita ou bornita. Comparativamente a outras doze linhagens de A. ferrooxidans, a linhagem LR apresentou uma das maiores velocidades de oxidação sobre ambos os minerais em experimentos de respirometria, sendo selecionada para ser utilizada na análise proteômica. Respostas de células de A. ferrooxidans LR à bornita ou calcopirita foram investigadas utilizando-se 2D-PAGE e espectrometria de massas. O perfil de proteínas totais de células livres expostas aos minerais por 24 ou 48 horas foi comparado com o perfil das células não expostas (controle). Para bornita, detectou-se indução na síntese das proteínas chaperonina (groEL), antioxidante da família AhpC/Tsa e aldeído desidrogenase, enquanto que proteína de domínio radical SAM, frutose-1-6-bifosfatase, proteína de choque térmico HslU, carboidrato quinase, ribulose bifosfato carboxilase e proteínas ribossomais S2 e L25 tiveram sua síntese reprimida. Alterações opostas na expressão protéica foram detectadas para duas formas da fructose-bifosfato aldolase, as quais apresentaram valores distintos de ponto isoelétrico, sugerindo o envolvimento de modificações pós-traducionais desta proteína em A. ferrooxidans em resposta à bornita. Todas as alterações detectadas para a bornita não foram observadas na presença de calcopirita, não sendo detectada pela abordagem utilizada qualquer alteração significativa em células expostas a este mineral... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans (A.ferrooxidans) is a chemoautotrophic bacterium able to oxidize ferrous iron or mineral sulfides to obtain energy. Bornite and chalcopyrite are two copper sulfides having the same elemental composition but differ in relation to the susceptibility for bioleaching process. The aim of this work was to perform a differential proteomic analysis of the A. ferrooxidans response to the exchange of ferrous ion as an energetic substrate to the mineral sulfides chalcopyrite or bornite. Among twelve A. ferrooxidans strains, the LR strain presented one of the highest oxidative rates on both minerals by respirometric assays, and was chosen for the proteomic analysis studies. The bacterium responses to bornite or chalcopyrite were investigated by 2D-PAGE and mass spectrometry. The total protein profiles of cells exposed to bornite or chalcopyrite for 24 or 48 hours were compared to the one of control not exposed to minerals. For bornite, were detected an induction for the proteins chaperonin (groEL), AhpC/Tsa family antioxidant and aldehyde dehydrogenase, whereas the proteins radical SAM domain, fructose-1-6- bisphosphatase, carbohydrate kinase, HslU heat shock protein, ribulose bisphosphate carboxylase and the ribosomal proteins S2 and L25 were repressed. For the protein fructosebisphosphate aldolase two forms having distinct isoelectric points were observed suggesting pos-translational modification of this protein in the A. ferrooxidans response to bornite. No significant alteration of the protein expression was detected for cells exposed to chalcopyrite. Therefore, the proteomic analyses show that these minerals lead to distinct cellular responses in A. ferrooxidans. Distinct responses were detected by proteomic analysis of the periplasmic fraction for chalcopyrite-attached cells in relation to non-attached cells. The analysis by 2D showed four proteins that presented... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Heloisa Sobreiro Selistre de Araujo / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Resumo: Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / Abstract: In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation. / Mestre

Resumo: Como alternativa ao controle químico, principal método de controle de pragas agrícolas, a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) é um agente de controle com características tóxicas e ambientais que permitem o controle de insetos-praga de acordo com as premissas do MIP. Com o objetivo de buscar novas linhagens potencialmente tóxicas para Sitophilus oryzae (L., 1763) (Coleóptera, Curculinidae), caracterizou-se molecularmente 1.073 isolados de B. thuringiensis de diferentes partes do Brasil quanto ao conteúdo do gene cry35Ba. O material genético foi extraído através do kit InstaGene Matrix, utilizado para a amplificação das seqüências através da técnica de PCR, sendo os resultados visualizados em gel de agarose 1,5%. A classe do gene cry35Ba foi representada por 60 isolados (5,6%) de Bt, os quais foram submetidos ao bioensaio com larvas de S. oryzae. Dentre os isolados estudados, quatro causaram mortalidade acima de 50% nos testes de patogenicidade, e os isolados 544 e 622 foram os mais virulentos, conforme determinado pela estimativa da CL50. Nos quatro isolados que demonstraram toxicidade, foi detectado através da microscopia eletrônica a presença de cristais esféricos, e um isolado apresentou cristais bipiramidais e cubóides e pôde-se verificar proteínas com 44 kDa, referentes aos genes cry35Ba por SDS-Page. Esses dados demonstram o potencial de Bt no manejo de S. oryzae e estudos são necessários para determinar a melhor forma de utilização desta tecnologia no manejo dessa praga. / Abstract: An alternative to chemical control, which is the major agricultural pest control method, the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis is a control agent with toxic and environmental characteristics that allows the control of pest insects according to the IPM precepts. In order to find new strains, potentially toxic to Sitophilus oryzae Lineu, 1763 (Coleoptera: Curculinidae), 1073 strains of B. thuringiensis from different parts of Brazil were characterized molecularly for the cry35Ba gene. Genetic material was extracted with InstaGene Matrix kit, used for the amplification of sequences in PCR, and viewed in 1,5% agarose gel. The gene cry35Ba class was represented by 60 B. thuringiensis isolates (5.6%), which were then subjected to bioassays with S. oryzae larvae. Among the isolates studied, four caused more than 50% mortality in the pathogenicity tests, and the isolates 544 and 622 were the most virulent, as determined by CL50 estimates. The four isolates the were toxic showed in the electron microscopy the presence of spherical, and isolates one presented crystals bipyramidal and cuboid crystals, and a 44-kDa protein was found in SDS-Page, which correspond to the product of cry35Ba genes. These data demonstrate the potential of B. thuringiensis for the management of S. oryzae larvae. More studies are required to determine the best use of these isolates for pest management. / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Uderlei Donisete Silveira Covissi / Mestre

Orientador: José Ramon Beltran Abrego / Banca: Yvonne Primerano / Banca: Dimas Roberto Vollet / Banca: João Ruggiero Neto / Banca: Johnny Rizzieri Olivieri / Resumo: A técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo - SAXS é uma poderosa ferramenta para a caracterização de macromoléculas biológicas em solução. Aplicando-a de forma correta podemos obter parâmetros físicos à respeito do material de estudo, como raio de giração, máxima dimensão, volume e superfície. Neste trabalho caracterizou-se em solução aquosa a macromolécula heterodimérica crotoxina com a variação do pH em ácido, básico e neutro. Esta proteína foi isolada da serpente sul-americana Crotalus durissus terrificus e seus constituintes crotapotina e fosfolipase A2 também foram caracterizados isoladamente. Os parâmetros físicos obtidos foram confrontados com trabalhos realizados anteriormente. Propô-se um modelo de coordenadas atômicas obtido por modelagem e dinâmica molecular. Realizamos a análise estrutural das macromoléculas homólogas Bothropstoxin - I e Bothropstoxin - II isoladas da serpente sul-americana Bothrops jararacussu, indicando que os estados oligoméricos estão ambos em bom acordo com os resultados obtidos pelo seu estado cristalino. Lotus tetragonolobus lectin (LTA) é uma lectina ligante especifica de açúcar fucose de origem das leguminosas. O estudo do estado cristalino desta proteína revela uma diferente disposição dos monômeros no tetrâmero, este que é composto por dímeros em um novo modo arranjar-se, formando assim uma nova estrutura tetramérica a qual foi confirmado pela investigação da estrutura quaternária da função envelope disposto pela análise das curvas de SAXS, comparadas e sobrepostas à estrutura das coordenadas atômicas determinada por cristalografia. A corismato sintase (CS) é a sétima enzima da via shikimato para a síntese de aminoácidos aromáticos, em fungos, bactérias e parasitas tais como o causador da tuberculose, porém, em mamíferos esta via é ausente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The technique of small angle X-ray scattering - SAXS is a powerful tool for characterization of biological macromolecules in solution. Applying it correctly so we can get physical with respect to materials, such as radius of gyration, maximum size, volume and surface area. This work was characterized in aqueous solution macromolecule heterodimeric crotoxina with the change in pH in acid, basic and neutral. This protein was isolated from the South American snake Crotalus durissus terrificus and its constituents crotapotina and phospholipase A2 were also characterized in isolation. The physical parameters were confronted with work done previously. Propose is a model of atomic coordinates obtained by modeling and molecular dynamics. We performed the structural analysis of macromolecules Bothropstoxin counterparts - and I Bothropstoxin - II isolated from South American snake Bothrops jararacussu, indicating that the states are oligomers both in good agreement with results obtained by its crystalline state. Lotus tetragonolobus lectin (LTA) is a lectin binding specific sugar fucose of origin of legumes. The study of the crystalline state of this protein shows a different arrangement of monomers in the tetramer, that is composed of dimers in a new way get it, thus forming a new tetrameric structure which was confirmed by investigation of the quaternary structure of the envelope function provided by analysis of SAXS curves, and compared to the overlapping structure of atomic coordinates determined by crystallography. The corismato synthase (CS) is the seventh enzyme of shikimato route for the synthesis of aromatic amino acids in fungi, bacteria and parasites such as the cause of tuberculosis, but in mammals this pathway is absent. The structure of the envelope function was determined revealing a structure of tetramer in solution was also verified by crystallographic analysis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor