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Caracterização da interação entre a proteína prion e a vimentina

Raddatz, Bruna Winkert January 2017 (has links)
Orientadora : Profª Drª Adriana Frolich Mercadante / Coorientador : Prof. Dr.Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 21/03/2017 / Inclui referências : f. 93-97 / Resumo: A proteína prion celular, ou PrPC, é uma proteína ancorada externamente à membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol. Sua conversão de uma forma fisiológica para uma isoforma mal dobrada e infecciosa, denominada scrapie, é responsável pelo aparecimento das doenças priônicas, também conhecidas como Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis. Para elucidar as funções fisiológicas de PrPC, são realizados estudos para se descobrir seus possíveis parceiros moleculares. Recentemente, resultados obtidos por nosso grupo identificaram dez possíveis ligantes para PrPC, dentre os quais destaca-se a vimentina, uma proteína de filamento intermediário. Em células com quantidade excessiva de proteína mal dobrada ou com inibição de proteassoma, há a formação de agressomos, estruturas pericentriolares com agregados de proteínas em seu centro e envoltos por uma gaiola de filamentos intermediários compostos principalmente por vimentina. Para esmiuçar a relação entre as proteínas PrPC e vimentina, verificar a formação de agressomos e suas possíveis consequências para as células, fizemos experimentos de Pull-Down, imunofluorescência, Western Blot, solubilidade em metanol e MTT em células HeLa e N2a. Foram testados tratamentos com DMSO, MG132 e Ciclosporina A (CsA), e transfecções com plasmídeos expressando GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, e mutantes de PrPC P104L e V179I. A interação entre as proteínas prion celular e vimentina pôde ser confirmada in vitro pela técnica de Pull-Down nas células HeLa. Inesperadamente, a viabilidade celular de HeLa e N2a não pareceu ser afetada por nenhum dos tratamentos testados. Nas imunofluorescências com ambas as células foi possível observar a formação de agressomos, principalmente nos tratamentos com MG132 e CsA, sendo o primeiro um inibidor de proteassoma e o segundo um inibidor da via das ciclofilinas. A formação desses agressomos parece estar ligada a uma redução na expressão de vimentina de ambas às células, e a um aumento da insolubilidade da proteína prion nas células N2a, mas não nas células HeLa. Palavras chave: Prion. Vimentina. Agressomos. Scrapie. / Abstract: The cellular prion protein, or PrPC, is a protein anchored to the external leaflet of the plasma membrana by a glycophosphatidylinositol molecule. Its conversion from a physiological isoform to a misfolded and infeccious one, named scrapie, is responsible for the prionic diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies. To elucidate the physiological functions of PrPC, studies are conducted to discover its possible molecular partners. Recently, studies done by our group found ten possible ligants for PrPC, among of them is the vimentin, a intermediate filament protein. In cells showing high levels of misfolded proteins or with proteasome inhibition, there is the formation of aggresomes, pericentriolar structures with protein aggregates on its center wrapped by a cage of intermediate filaments composed mostly by vimentin. To deeply investigate the relation between PrPC and vimentin proteins, to verify the formation of aggresomes and its possible consequences to the cells, we did Pull-Down, immunofluorescence, Western Blot, methanol solubility and MTT experiments in HeLa and N2a cells. We tested treatments with DMSO, MG132 and Cyclosporine A (CsA), and transfections with plasmids expressing GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, and PrPC mutants P104L and V179I. The interaction between cellular prion protein and vimentin could be confirmed in vitro by the Pull-Down technique in HeLa cells. Unexpectedly, the HeLa and N2a cell viability was not affected by none of the tested treatments. Immunofluorescence with both cells showed the formation of aggresomes, mainly in MG132 and CsA treatments, the first being a proteasome inhibitor and the second a cyclophilins route inhibitor. The formation of these aggresomes seems to be linked to a reduction in vimentin expression in both cells, and to an increase in insolubility of prion protein in N2a cells, but not in HeLa cells. Keywords: Prion. Vimentin. Aggresomes. Scrapie.
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Avaliação do efeito neurotóxico da proteína prion em linhagens celulares e sua modulação pelas co-chaperonas CHIP/Stub1 e STI1

Santos, Nathly Xavier dos January 2017 (has links)
Orientadora : Profª Drª Adriana Frohlich Mercadante / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 10/03/2017 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: A proteína prion celular (PrPC) e uma glicoproteina extracelular, ancorada na membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol (GPI). A conversão de PrPC em uma isoforma patologica (PrPSc), a partir de modificações estruturais, e responsável pelo desenvolvimento das encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) ou doenças periódicas. Vários trabalhos indicam que formas citosólicas de PrP podem ser formadas durante erros na sua biossintese. Os príons citosólicos (CytPrP) são gerados por meio de duas vias: ERAD (ER-associated Degradation) e ineficiência do peptídeo sinal. Alguns estudos demonstram que estas formas de príons citosólicos exercem função neurotoxica, contribuindo para a manifestação das doenças periódicas. Trabalhos anteriores do nosso grupo, foram capazes de identificar uma interação entre PrPC e CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 e uma proteína citoplasmática o qual funciona como um co-chaperona molecular e apresenta atividade ubiquitina E3- ligase, participando do controle de qualidade das proteínas desde o dobramento ate a fase de degradação. Ainda, CHIP/Stub1 e homologa a proteína STI1/Hop, uma cochaperona e um ligante bem estabelecido de PrPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar em diferentes linhagens celulares se o efeito neurotoxico de PrP citosólico, ja descrito para algumas células, era capaz de ser modulado através dessas co-chaperonas. Em nossos resultados mostramos por diferentes ensaios de viabilidade celular, tais como MTT, vermelho neutro, que CytPrP reduziu de 30-50% a viabilidade celular de três linhagens neuronais testadas: N2a, SH-SY5Y e CF10. Esse mesmo efeito nao foi observado para linhagem renal HEK293T. A expressão das co-chaperonas CHIP e STI-1 foi capaz de reverter a toxicidade do CytPrP em todas linhagens neuronais. Nossos resultados ainda mostraram que mutantes de CHIP e STI-1 com domínios deletados também foram capazes de reverter o efeito neurotoxico causado pela CytPrP. Ensaios utilizando o inibidor MG132 e hidroxicloroquina sugerem que essa reversao do efeito neurotoxico de CytPrP por CHIP e STI-1 parece não ser dependente da via de degradação por proteossomo, nem por lisossoma. Assim, um mecanismo através do qual as co-chaperonas exercem seu efeito de proteção da neuroxicidade ainda esta sendo investigado. Os dados obtidos nesse trabalho poderão contribuir para elucidar os possíveis mecanismos da neurotoxicidade de prions, permitindo um auxilio futuro no desenvolvimento de alvos terapêuticos relacionadas a doenças prionicas. Palavras-chave: PrP citosólico. Neurotoxicidade. CHIP/Stub1. STI1. Prion. / Abstract: The cellular prion protein (PrPC) is an extracellular glycoprotein, anchored to the plasma membrane by a glycophosphatidylinositol (GPI) molecule. The conversion of PrPC to a pathological isoform (PrPSc), through structural modifications, is responsible for the development of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases. Several data indicate that cytosolic forms of PrP can be formed during errors in its biosynthesis. Cytosolic prions (CytPrP) are generated by two pathways: ERAD (ER-associated Degradation) and signal peptide inefficiency. Some studies have shown that these forms of cytosolic prions exert neurotoxic function, contributing to the manifestation of prion diseases. Previous work by our group was able to identify an interaction between PrPC and CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 is a cytoplasmic protein, identified as a co- chaperone with E3 ligase activity, participating in the quality control of proteins, from folding to the degradation phase. Still, CHIP/Stub1 is homologous to STI1 (stress - inducible protein 1 ), a co-chaperone and a well-established PrPC bind protein. The objective of this work was to evaluate in different cell lines whether the neurotoxic effect of cytosolic PrP, already described for some cells, was able to be modulated through these co-chaperones. In our results we showed by different cell viability assays, such as MTT, neutral red, that CytPrP reduced from 30% to 50% the cell viability of three tested neuronal lines: N2a, SH-SY5Y and CF10. This same effect was not observed for HEK293T renal lineage. Our results also show that CHIP and STI-1 mutants with deleted domains were also capable of reversing the neurotoxic effect caused by CytPrP in all neuronal lines. Assays using the proteasome inhibitor MG132 and Hydroxychloroquine suggest that this reversal of the neurotoxic effect does not appear to be dependent of the proteosome or lysosomal degradation pathways. Thus, a mechanism through which co-chaperones exert their protective effect of CytPrP neuroxicity is still being investigated. The data obtained in this work may contribute to elucidate possible mechanisms of neurotoxicity of prions, allowing future aid in the development of therapeutic targets related to prion diseases. Keywords: cytosolic PrP. Neurotoxicity. CHIP/Stub1. STI1. Prion
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Efeito da proteina celular do Prion (PrPc) na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em células vasculares sob estresse oxidativo

Soprana, Hélen Zocche January 2008 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-23T17:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 248604.pdf: 837714 bytes, checksum: 019309fd773e7f81d605fc584437ac7a (MD5) / A proteína celular do prion (PrPC) é expressa em vários tipos celulares, especialmente em neurônios. Sua função fisiológica é desconhecida, no entanto, seu papel no desenvolvimento das doenças neurodegenerativas foi bem descrito, as quais resultam de uma mudança conformacional da PrPC para a forma scrapie (PrPSC). Vários estudos têm mostrado uma associação entre a PrPC, o metabolismo do cobre e a atividade antioxidante da superóxido dismutase (SOD). Contudo, os processos celulares envolvendo a PrPC, neste contexto, permanecem indefinidos. Considerando que o padrão de expressão protéica da SOD em vasos lesados foi similar ao verificado no cérebro de camundongos knockout para a PrPC, a hipótese do presente estudo foi que alterações da expressão da PrPC levariam à anormalidade da regulação do cobre e induziriam sub-atividade da SOD da parede vascular. Assim, nossos objetivos foram estudar se a expressão da PrPC sofre indução por agentes que desencadeiam o estresse do retículo endoplasmático (RE) e determinar seu envolvimento no que se refere à atividade da SOD. Análises de western blotting e RT-PCR foram usadas para determinar a ocorrência de alteração da expressão da PrPC na presença de estresse do RE. Células musculares lisas de aorta de coelho foram cultivadas por diferentes períodos de tempo (4, 8 e 18 horas), com agentes estressores do RE, angiotensina II (AngII, 100 nM), tunicamicina (Tn, 5 g/mL) e 7-cetocolesterol (7kc, 5 g/mL). A atividade da SOD foi determinada pelo método de inibição da redução do citocromo c, e a atividade basal da SOD foi 13,9 1,2 U/mg de proteína. O estresse do RE produziu diminuição significativa na atividade da SOD após incubação por 4 horas com Tn (29%) e 7kc (12%), 8 horas com Tn (37%), bem como, após 18 horas com AngII (42%) e 7kc (32%); inversamente, foi observado um aumento significativo na atividade da SOD nas células expostas a AngII (41%) durante 8 horas. A concentração celular de cobre, determinada através de espectroscopia de absorção atômica, foi cerca de 9 vezes maior nas células estimuladas com AngII por 8 horas. As análises de western blotting para as isoenzimas da SOD mostraram um perfil variado de expressão, em todos os tempos de incubação com os diferentes estímulos, que não se correlacionou com a atividade enzimática. A expressão da PrPC diminuiu após a exposição a todos os estímulos nos diferentes tempos de incubação. Os ensaios de RT-PCR mostraram aumento da expressão do mRNA para PrPC apenas nas células estimuladas durante 8 horas com os diferentes agentes estressores. A expressão do mRNA para PrPC também foi avaliada em fragmentos de artérias ilíacas de coelhos submetidos à lesão por cateter balão, com sobrevida de 7 e 14 dias, bem como logo após a lesão. Neste ensaio, a expressão do mRNA para PrPC apresentou aumento pronunciado no grupo avaliado logo após a lesão. Os resultados obtidos com os modelos de estresse do RE vascular aqui utilizados não demonstraram um perfil de atividade antioxidante para a PrPC. O que não descarta a hipótese desta proteína estar envolvida em outro tipo de resposta celular frente ao estresse oxidativo. Palavras-chave: superóxido dismutase, proteína celular do prion, estresse do retículo endoplasmático, células musculares lisas de aorta de coelho.
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Impacto da superexpressão da proteína Prion Celular sobre o sistema imune correlação com maior susceptibilidade à infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi

Berbert, Luiz Ricardo January 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) luiz_berbert_ioc_mest_2010.pdf: 5652664 bytes, checksum: 7e9002e7c7fc1786ff895512aa437d50 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro,RJ, Brasil / A proteína Príon celular (PrPc) é uma glicoproteína constitutivamente expressa no sistema nervoso, bem como no sistema imune, porém, seu papel fisiológico e em processos infecciosos é pouco compreendido. Dados prévios da literatura sugerem disfunções fisiológicas no sistema imune em modelos murinos transgênicos que superexpressam essa proteína podendo levar os mesmos a um processo de imunodeficiência mediante infecçãos. Para testar essa hipótese, este projeto tem o objetivo de avaliar o impacto da infecção experimental pelo T. cruzi em camundongos que superexpressam (TG20) ou não expressam PrPc (KO), analisando parâmetros de infecção correlacionados com a infiltração linfocitária no tecido cardíaco. Nossos resultados demonstram que a superexpressão de PrPc em camundongos gera inicialmente susceptibilidade do modelo à infecção se comparado ao grupo que não expressa a proteína, conforme observado nas taxas de sobrevida e parasitemia A presença de células T, B, bem como células CD11b+ de infiltrado inflamatório é numericamente maior no grupo TG20, porém, esse evento não parece estar relacionado diretamente com alterações observadas no baço e linfonodos desses animais durane cinética de infecção; em relação à expressão de moléculas de ativação linfócitos nestes modelos, observamos aumento das mesmas nas subpopulações linfocitárias do grupo TG20. Nos timo dos modelos TG20 foram observadas alterações fenotípicas, bem como aumento de espressão de laminina e fibronectina e seus receptores nos timócitos. Os dados deste trabalho demonstram que Prpc tem um grande impacto na fisiologiada infecção pelo T. cruzi no modelo murino que superexpressa essa proteína, correlacionando esse evento a uma imunodeficiência previamente observada no mesmo modelo não infectado / Cellular Príon Protein (PrP c ) is a glycoprotein constitutively expressed in nervous an d immune systems, but its physiological role is not well und erstood. Previous data suggest that murine models which overexpress PrP c show physiological disfunctions that could be related with a possible immunodeficiency, which might lead to poor immune response against infections. To support this hypothesis, this project has the aim to evaluate the impact of experimental T. cruzi infection in mice that overexpress or do not express PrP c , correlating infection parameters to lymphocyte infilt ration on heart tissue. Our results demonstrated that PrP c overexpression in mice leads to animal susceptibility during acute infection when compared to KO group, comp aring survival and parasitemia rates on these groups. Inflammatory infiltrate cells such as T and B lymphocytes, as well as CD11b + cells are present in higher numbers in TG20 model, but it seems to be not correlated with spleen and lymph nodes alteractions duri ng infection kinectics; activation molecules are highly express in TG20 periferical lympho cytes. TG20 mouse thymus showed phenotypic alteractions, as well as higher expressio n of laminin and fibronectin and its receptors in thymocytes, which could be possibily re lated to immature thymocyte exportation and their presence in heart tissue. Those data suggest thar PrP c has an important impact during T. cruzi infection in murine model that overexpress PrP c , correlating these alteractions to previous immunodeficien cy in non infected TG20 murine models

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