Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pos-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:19:24Z : No. of bitstreams: 1 251558.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-24T23:37:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278034.pdf: 787631 bytes, checksum: 4e1a362ea442a16afcf597e48553d44d (MD5) / O objetivo do presente estudo foi investigar os possíveis mecanismos e mediadores envolvidos na hipernocicepção mecânica muscular induzida pela administração intramuscular (i.m.) de IL-6, no músculo gastrocnêmio de camundongos. Foi demonstrado que a injeção i.m. de IL-6 (3, 6 ou 10 ng/sítio) reduziu significativamente o limiar da resposta mecânica de maneira dose e tempo (1 - 6 h) dependentes em camundongos. Este efeito foi associado com aumento do recrutamento de células inflamatórias, como avaliado através da coloração H&E, além das atividades das enzimas MPO e NAG, e também com o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF-?, IL-1? e KC). Além disso, camundongos nocaute para TNFR1-/-, ou ainda os animais pré-tratados com o antagonista seletivo CXCR2, SB225002, ou com os anticorpos anti-macrófago, anti-TNF-? ou anti-KC, e ainda com o antagonista para o receptor para IL-1 (IL-1ra) demonstraram redução significativa da hipernocicepção mecânica induzida pela IL-6. Ademais, o tratamento sistêmico com inibidores de mediadores inflamatórios, como indometacina, celecoxibe, SC560, ou guanetidina, também reduziram a resposta nociceptiva causada pela administração i.m. de IL-6. A participação de diferentes vias de sinalização intracelular também foi observada, uma vez que o pré-tratamento local com inibidores de fosfolipase A2 (PACOCF3), fosfolipase C (U73122), proteína quinase C (GF109203X), proteína quinase A (KT-5720), ou com fosfatidilinositol 3-quinase (AS605204), reduziram significativamente a hipernocicepção muscular induzida pela IL-6. Similarmente, o tratamento i.m. dos inibidores seletivos de p38 (SB203580), ERK (PD98059) ou JNK (SP60015) também inibiram a hipersensibilidade mecânica induzda pela IL-6. Ainda, ERK, JNK e p38 encontraram-se fosforiladas 5 minutos após a administração i.m. de IL-6. Estes resultados forneceram novas evidências que indicam papel relevante da IL-6 no desenvolvimento e na manutenção da hipernocicepção muscular em camundongos. Ainda, a hipersensibilidade mecânica muscular induzida pela parece promover ativação de células residentes, infiltração de células polimorfonucleares, produção de citocinas, prostanóides e liberação de aminas simpaticomiméticas e ativação de vias intracelulares, especialmente MAPKs.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-22T17:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 227250.pdf: 572606 bytes, checksum: 037342679a93e64a70e5cb772463a0d3 (MD5) / A agmatina é uma amina endógena presente no cérebro que apresenta um efeito antidepressivo. Neste trabalho demonstrou-se que o tratamento crônico com agmatina (1 e 3 mg/kg, i.p.) aumentou a expressão de Bcl2 (no cerebelo) e calbindina-28K (no hipocampo e cerebelo), mas não afetou a expressão de BDNF. A redução do tempo de imobilidade causada pela administração aguda de agmatina (10 mg/kg, i.p.) no teste do nado forçado (TNF) em camundongos foi prevenido pelo pré-tratamento (i.c.v.) com PD98059 (inibidor da MAPK/ERK), KN-62 (inibidor da CaMKII) e queleritrina (inibidor da PKC), mas não pelo H-89 (inibidor da PKA). O efeito antidepressivo da fluoxetina (32 mg/kg, i.p.) no TNF foi revertido pelo H-89, PD98059 e queleritrina, mas não pelo KN-62. O teste do campo aberto mostrou que os efeitos não foram devido a alterações na atividade locomotora. Agmatina (100, 300 e 1000 mM) induziu a liberação de glutamato em sinaptossomas corticais de camundongos, de modo dependente da concentração e do tempo. H89, PD98059 e KN-62, mas não queleritrina, estauroporina e LY204002 bloquearam a liberação de glutamato provocada por agmatina (1000 mM).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:40:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290296.pdf: 2092290 bytes, checksum: 0d72e1b88bfccac79bd8102a0d2f0d6c (MD5) / O envolvimento das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) em lesões do sistema nervoso central já foi demonstrado em alguns estudos. Porém, a implicação da ativação dessas proteínas na medula espinhal após a lesão medular traumática necessita de maior esclarecimento. O presente estudo investigou a participação das MAPKs ERK1/2, p38 e JNK no dano espinhal e funcional induzido pela lesão medular traumática em ratos. A compressão da medula espinhal, através da inserção de um cateter de embolectomia no espaço epidural, resultou em uma lesão espinhal caracterizada histologicamente por resposta inflamatória pronunciada, com edema, infiltração de neutrófilos, produção de mediadores inflamatórios e apoptose, associada com comprometimento locomotor significativo. A lesão medular não alterou a expressão protéica total de quaisquer das MAPKs na medula espinhal. Contudo, os níveis de expressão das isoformas fosforiladas de cada MAPK em amostras espinhais de animais lesados apresentaram-se elevadas, em relação às de amostras de animais falso-operados, nos seguintes momentos após indução da lesão: p38 fosforilada em 2 e 6 h, ERK1/2 fosforilada em 2, 6 e 24 h, e JNK fosforilada apresentou uma elevação significativa em 6 e 24 h. Amostras espinhais de animais lesados apresentaram ainda aumento nos níveis das citocinas IL-1ß em 2, 6 e 24 h após a lesão e de TNF-a em 2 h, atividade aumentada da enzima mieloperoxidase (uma medida indireta da infiltração de neutrófilos) em 6, 24 e 72 h, e do número de células apoptóticas em 24 e 72 h após a lesão. A administração intratecal do inibidor seletivo da proteína JNK, o SP600125 (2 injeções de 150 nmol, 1 e 4 h após a lesão medular), reduziu a expressão da proteína JNK fosforilada (mas não de p-38 ou ERK1/2 fosforiladas) e bloqueou a apoptose em 6 h, sem alterar os níveis espinhais de mieloperoxidase. O tratamento com SP600125 acentuou marcadamente a recuperação da atividade locomotora dos animais no transcorrer das primeiras 4 semanas após a lesão, e atenuou os danos histológicos espinhais. Este estudo demonstra o importante envolvimento das MAPKs na lesão medular e aponta a proteína JNK como um importante alvo terapêutico no tratamento da lesão medular traumática, uma vez que um inibidor seletivo desta proteína foi capaz de inibir a apoptose espinhal e potencializar a recuperação da função locomotora. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) have been extensively implicated in injuries of the CNS, however the roles played by spinal cord MAPK activation following spinal cord injury (SCI) still remain elusive. Considering that the therapies currently available for treatment of this condition have limited efficacy, the use of animal models of SCI is still mandatory for development of new more effective approaches. The current study investigates the changes in expression of the three main MAPKs, namely ERK1/2, p38 and JNK following traumatic SCI, as well as the role played by spinal JNK in motor impairment following lesion. SCI induced by inflation of a balloon catheter placed in the epidural space at T9-T10, was associated with a marked spinal inflammatory response, histological changes and a pronounced locomotor impairment which subsided only partially over the first 4 weeks. Spinal expression levels of total p38, ERK1/2 and JNK proteins were unchanged after SCI, but levels of the phosphorylated (phospho) forms of each of the MAPKs were enhanced as follows: phospho-p38 MAPK at 2 and 6 h after SCI, phospho-ERK1/2 at 2, 6 and 24 h after SCI, and phospho-JNK at 6 and 24 h after SCI. SCI also increased IL-1â at 2, 6 and 24 h, TNF-á at 2 h, spinal cord MPO levels at 6, 24 and 72 h and elevated the number of spinal apoptotic cells in the spinal cord at 24 and specially 72 h after the lesion. Notably, intrathecal administration of a specific inhibitor of JNK phosphorylation, SP600125 (2 injections of 150 nmol, given at 1 and 4 h after SCI surgery), reduced the expression of phospho-JNK (but not of phospho-p38 or phospho-ERK1/2) and the number of spinal apoptotic cells at 6 h after SCI, as well as many of the histological signs of spinal injury, but spinal MPO levels were unchanged. Most importantly, restoration of locomotor performance throughout the first 4 weeks following SCI was clearly ameliorated by this same treatment schedule with SP600125. Altogether, the results demonstrate that SCI induces the activation of spinal MAPKs and that, among these, spinal JNK plays a major role in mediating the deleterious consequences of spinal injury, not only at the spinal level, but also those regarding motor function. Moreover, they suggest that inhibition of JNK activation in the spinal cord might hold therapeutic potential for the functional recovery from SCI.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-03-11T16:27:36Z No. of bitstreams: 1 Tese_LuizaFAndrade_CorreçaoPosDefesa.pdf: 6344948 bytes, checksum: 1de902ddabaee335003b09146eee2734 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-11T16:27:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_LuizaFAndrade_CorreçaoPosDefesa.pdf: 6344948 bytes, checksum: 1de902ddabaee335003b09146eee2734 (MD5) Previous issue date: 2012 / Apesar do praziquantel ser uma droga eficiente para o tratamento da esquistossomose, a prevalência da doença não mostrou redução significativa nos últimos anos e, até o momento, não existe uma alternativa eficaz para o tratamento dessa doença. Dessa forma, optamos por utilizar as poderosas ferramentas genômicas para identificar potenciais alvos para o desenvolvimento de um medicamento alternativo. Já que proteínas quinase eucarióticas (ePKs) são consideradas alvos para o desenvolvimento de drogas do ponto de vista médico e químico, e um número crescente de inibidores ePKs foram desenvolvidos e aprovados para o tratamento de diferentes doenças humanas, estas se tornaram o foco de estudo desse trabalho. As ePKs de S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium foram identificadas nos proteomas preditos e classificadas em seus devidos grupos, famílias e subfamílias a partir de abordagens filogenéticas. Utilizando as informações dos ortólogos identificados, foi possível selecionar um grupo de ePKs com função predita essencial nesse parasito. A anotação funcional mostrou ainda que grande parte das ePKs selecionadas são ativadoras/efetoras da via de sinalização MAPK. Dessa forma, proteínas chave da via MAPK (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK e SmCaMK2), foram as escolhidas para validação experimental. Após redução significativa no nível de transcrito dos genes selecionados, nenhuma alteração fenotípica visível foi relatada em cultura de esquistossomulos. Contudo, o efeito da diminuição transcricional dos genes no desenvolvimento dos vermes diante do sistema imune do hospedeiro foi avaliado. Evidenciamos que proteínas MAPK JNK quando silenciada causa efeitos devastadores no tegumento de vermes adultos de S. mansoni que leva a morte dos mesmos. E, ePKs da subfamília ERK1 estão relacionadas com a produção de ovos, já que fêmeas com baixos níveis de transcritos SmERK1 e SmERK2 apresentam ovários pouco desenvolvidos e produção de ovos significativamente baixa. Além disso, foi comprovado que o fator de transcrição c-fos está diferencialmente expresso em parasitos silenciados para as proteínas MAPK SmJNK, SmCaMK2 e SmERK1/2. Dessa forma concluímos que o dado genômico, acoplado a ferramentas computacionais preditoras e abordagem experimental, compõem uma metodologia poderosa para o estudo dessa espécie. As proteínas MAPK, SmERK e SmJNK, são alvos de interesse para o desenvolvimento de drogas para tratamento da esquistossomose já que um inibidor contra essas proteínas provavelmente irá interromper o ciclo de vida de Schistosoma e impedir o progresso da doença. / Although praziquantel is an efficacious drug for schistosomiasis treatment, in recent years problems of resistance have arisen and alternatives don’t exist so far. To contribute to a solution, the important information of the recently sequenced genomes of these parasites was used to identify potential targets for the development of an alternative drug. Since eukaryotic protein kinases (ePKs) are good chemical and medical targets for drug development and an increasing number of ePK inhibitors have been approved for the treatment of different human disease, they have become the focus of this study. The ePKs were identified in the predicted proteomes of S. mansoni, S. japonicum and S. haematobium by Hidden Markov Model searches, the genes were classified in their group, family and subfamily by phylogeny approaches, and some ePKs were selected since they has essential function in the parasite. The functional annotation showed that the most selected ePKs are activators/effectors of MAPK signaling pathway, and key proteins of this pathway (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK, and SmCaMK2), were chosen for experimental validation. Gene silencing by RNA interference was used to elucidate the functional role of MAPK signaling pathways proteins in S. mansoni. After a significant reduction in the transcription level of the selected genes, no visible phenotypic changes were reported in schistosomula in culture. Therefore, mice were infected with the silenced schistosomulas and the development of adult worms was observed. It was showed that SmJNK has an important role in transformation and survival of the parasites as low number of adult worms was recovered and the tegument of survived worms was damaged. Moreover, SmERK1/SmERK2 was related to egg production, as mice infected with silenced schistosomulas, displayed significantly lower egg production and the recovered female worms had underdeveloped ovaries. Furthermore, it was showed that the c-fos transcription factor was overexpressed in parasites with low expression of SmERK1, SmJNK and SmCaMK2. We conclude that the genome contains valuable information and the functional annotation performed had an important role to improve the annotation of S. mansoni, S. haematobium and S. japonicum ePKs. Furthermore, MAPKs proteins, SmERK and SmJNK, are excellent targets for drug development as an inhibitor against these proteins will probably disrupt the life cycle of Schistosoma and prevent disease progression.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:00:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339552.pdf: 1776510 bytes, checksum: da1705c78b546bdd9cc227ab480ba339 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316869.pdf: 2092143 bytes, checksum: f5600ca660b99748d236b4ce50d7fa8a (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário que, embora estreitamente relacionado ao T. cruzi, não é considerado patogênico para o hospedeiro mamífero, no qual sua capacidade de multiplicação é desconhecida. Uma vez que diversos estudos já abordaram esta questão, sem resultados consensuais, o objetivo deste estudo foi investigar marcadores moleculares e estruturais da divisão celular no T. rangeli, como uma estratégia para detectar a multiplicação celular mesmo sem visualização direta do processo. O ciclo celular in vitro das formas epimastigotas proliferativas da cepa Choachí foi estudado, sendo sua duração total calculada em 26,2 horas, sendo 11,91 horas na fase G1, 6,13 horas na fase S, 3,88 horas na fase G2, 1,13 horas na mitose (M) e, por fim, 3,15 horas na citocinese (C). Esta progressão no ciclo pôde ser acompanhada também por citometria de fluxo, por meio da avaliação do conteúdo de DNA, gerando histogramas com um pico referente a parasitos em G1 e outro a parasitos em G2/M/C. Como potenciais marcadores moleculares, foram escolhidos os transcritos para as proteínas Aurora quinase 1, Polo-like quinase, MOB1 e TRACK, as quais já foram associadas à citocinese de outros tripanosomatídeos. Os níveis de transcritos para essas proteínas foram avaliados em epimastigotas em fase exponencial de crescimento por PCR quantitativa em tempo real (qPCR), sendo comparados a parasitos com taxas de multiplicação sabidamente reduzidas - epimastigotas em fase estacionária ou tratados com hidroxiureia - e a parasitos cuja capacidade de multiplicação é desconhecida - os tripomastigotas. Os transcritos para Aurora quinase 1 e, principalmente, Polo-like quinase estiveram fortemente associados a parasitos com altas taxas de divisão celular, ao passo que os transcritos para MOB1 e TRACK tiveram uma variação independente. Em todos os ensaios, Polo-like quinase demonstrou ser o mais promissor marcador molecular da citocinese, apresentando significantes reduções em sua abundância relativa de transcritos nas formas com baixas taxas de multiplicação celular, além de ser detectada como uma proteína de cerca de 70 kDa apenas nas formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento. Assim, este estudo demonstrou o potencial da metodologia de qPCR utilizando Polo-like quinase como marcador molecular, bem como da citometria de fluxo, para estudar o comportamento do T. rangeli em seu hospedeiro mamífero, abrindo novas perspectivas para a compreensão do ciclo biológico deste parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a protozoan parasite closely related to T. cruzi but considered to be non-pathogenic to the mammalian host, in which its ability to proliferate is unknown. Since several studies have addressed this issue without consensual results, the objective of this study was to investigate structural and molecular markers of cell division in T. rangeli, as a strategy to detect cell multiplication even when direct visualization of this process is not possible. The in vitro cell cycle of strain Choachí proliferative epimastigote forms was studied and revealed a duplication time of 26.2 hours, of which 11.91 hours consist in G1 phase, 6.13 hours in S phase, 3.88 hours in G2 phase, 1.13 hours in mitosis (M) and 3.15 hours in cytokinesis (C). This progression in the cell cycle was also followed by flow cytometry through the evaluation of DNA content, generating histograms with two peaks, the first referring to parasites in G1 and the second to parasites in G2/M/C. The transcripts for proteins Aurora kinase 1, Polo-like kinase, MOB1 and TRACK, which have been previously associated with cytokinesis in other trypanosomatids, were chosen as potential molecular markers. The transcript levels for these proteins were evaluated in exponential growth phase epimastigotes through real time quantitative PCR (qPCR) and compared to parasites with known reduced multiplication rates - stationary phase epimastigotes and parasites treated with hydroxyurea - and to parasites whose ability to multiply is unknown - trypomastigotes. The transcripts for Aurora kinase 1 and specially Polo-like kinase were strongly associated with parasites with high cell division rates, whereas the transcripts for MOB1 and TRACK varied independently. Polo-like kinase was the most promising molecular marker for cytokinesis, presenting a significant reduction in its transcripts relative abundance in parasites with low multiplication rates, being also detected as an approximately 70 kDa protein only in exponential growth phase epimastigotes. Therefore, this study has demonstrated the potential of the qPCR methodology using Polo-like kinase as a molecular marker, as well as the flow cytometry methodology, to study the behavior of T. rangeli in its mammal host, opening new perspectives to the comprehension of its biological cycle.