Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T03:29:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kinote_AndrezzaPinheiroBezerradeMenezes_D.pdf: 2061057 bytes, checksum: ec05cb4119a4301a63d35bb8a38a59cc (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientador: Katashi Okoshi / Resumo: A hipertensão arterial está associada à alta morbidade e mortalidade pelas alterações estruturais e funcionais de órgãos alvo e às alterações metabólicas, com elevado risco de eventos cardiovasculares. A sobrecarga de pressão e o estresse oxidativo têm papel importante na remodelação cardíaca. A hipertensão arterial é um fator de risco modificável para as doenças cardiovasculares, onde os fármacos e o exercício físico regular são capazes de reduzir os níveis pressóricos de indivíduos hipertensos. Objetivo: Investigar os efeitos do exercício físico resistido combinado ao aeróbico associado à N-acetilcisteína na remodelação cardíaca em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Os SHR foram divididos nos grupos sedentário (CTL, n=12), submetido ao exercício combinado (EXE, n=13), sedentário submetido à N-acetilcisteína (NAC, n=13), e ratos submetidos ao exercício combinado e à N-acetilcisteína (EXENAC, n=14). Os ratos dos grupos exercício combinado foram treinados três vezes por semana, durante dois meses, em esteira e escada. Os ratos suplementados receberam NAC durante dois meses, na ração. Testes de capacidade física aeróbica e resistido, avaliação da pressão arterial sistólica e o ecocardiograma foram realizados antes e após os protocolos de tratamento. As seguintes análises foram realizadas: morfometria, histomorfometria, estresse oxidativo, expressão gênica do complexo enzimático NADPH oxidase por RT-PCR real time e expressão de proteínas oxidadas por Western blot.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Neospora caninum (Apicomplexa) é o agente causador da neosporose, descrita como a principal causa de aborto parasitário em gado bovino .Parasitos desse filo interagem e invadem as células hospedeiras através da secreção coordenada de proteínas do complexo apical, formado por diversas organelas, dentre elas as roptrias (ROPs), que desempenham papel fundamental no processo de infecção, associado à formação do vacúolo parasitóforo (PV), sobrevivência no ambiente intracelular e virulência do parasito. Essas proteínas podem ser caracterizadas em: proteínas de roptrias de pescoço (RONs), e proteínas de roptrias (ROPs). Além disso, algumas ROPs podem se diferenciar e, dessa maneira, constituem uma grande família de quinases e pseudo-quinases, denominada família de roptrias quinase (ROPKs). O objetivo deste estudo foi caracterizar as proteínas de roptrias NcROP15B (NcLIV_011700) e NcROP55 (NcLIV_031550) de N. caninum. As sequências de NcROP15B e NcROP55 foram alinhadas com homólogos de alguns microrganismos, incluindo apicomplexas, ao BLAST. NcROP15B apresentou identidade de 19% com as sequencias de ROP15 de T. gondii e Hammondia hammondi. NcROP55 mostrou identidade de 14% com a ROP37 de T. gondii e com ROP28 de Hammondia hammondi, e 15% com a ROP28 de Neospora caninum. Foram detectados domínios pertencentes à família de proteínas quinase para NcROP15B e NcROP55, e peptídeo sinal apenas para NcROP15B. Os primers foram delineados para amplificar regiões de cDNA de ambos os genes com diferentes tamanhos, denominados NcROP15B maior, NcROP15B menor, NcROP55 maior e NcROP55 menor. Os insertos foram subclonados (pGEM) e posteriormente ligados em plasmídeo de expressão pET28 em E. coli BL21(DE3) e a expressão recombinante induzida por IPTG. As formas recombinantes foram expressas com 30 kDa e 16 kDa (NcROP15B fragmento Maior e Menor, respectivamente) e NcROP55 Maior e Menor gerou um peso molecular de 19.9 kDa e 15 kDa, respectivamente. Após purificação, NcROP15B e NcROP55 foram utilizadas para obtenção de soros policlonais. Anti-ROP15B e anti-ROP55 reagiram com extrato de N. caninum em Western Blot 1D, tendo NcROP15B sido detectada com 35 kDa, próximo ao predito (32 kDa) e NcROP55 com aproximadamente 35 KDa, porém abaixo do predito (47.9 kDa). Na imunofluorescência confocal, NcROP-15B e NcROP55 exibiram padrão de localização na região perinuclear de taquizoítos de N. caninum. Os anticorpos anti-NcROP15B e anti-NcROP55 apresentaram, individualmente, capacidade limitada para inibir o processo de adesão/invasão de N. caninum, sendo 16% e 6,43% respectivamente. Quando os soros anti-NcROP15B e anti-NcROP55 foram associados, a a inibição da invasão aumentou para 62%. As proteínas NcROP-15B e NcROP55 podem representar quinases importantes no metabolismo de N. caninum, e podem estar relacionadas ao processo de invasão e proliferação do parasito. Dessa maneira, são possíveis alvos para se considerar no estudo de medidas preventivas, sendo necessários mais estudos para avaliar suas funções na sobrevivência intracelular e virulência de N. caninum. / Neospora caninum (Apicomplexa) is the causative agent of neosporosis, described as the main responsible of parasitic abortion in cattle. Parasites of this phylum interact and invade the host cells through a coordinated secretion of proteins of the apical complex, formed by organelles like rhoptries, which play a key role in the infection process, associated to the formation of the parasitophorous vacuole (PV), intracellular survival and parasite virulence. These proteins can be characterized in: neck rhoptry proteins (RONs), and rhoptry proteins (ROPs). Some ROPs can differentiate and thus constitute a large family of kinases and pseudo-kinases, called the kinase rhoptry family (ROPKs). The aim of this study was to characterize N. caninum NcROP15B (NcLIV_011700) and NcROP55 (NcLIV_031550) rhoptry proteins. The amino acid sequences of NcROP15B and NcROP55 were aligned with homologous proteins from some microorganisms, including apicomplexan on BLAST. NcROP15B showed a 19% identity with the ROP15 of T. gondii and Hammondia hammondi. NcROP55 had 14% of identity with ROP37 of T. gondii and with ROP28 of Hammondia hammondi, and 15% with ROP28 of Neospora caninum. Domains were detected belonging to the protein kinase family for NcROP15B and NcROP55, and signal peptide only for NcROP15B. Primers were designed to amplify cDNA regions of both genes, opting for fragments of different sizes, names as NcROP15B major, NcROP15B minor, NcROP55 major and NcROP55 minor. The inserts were subcloned (pGEM) and then ligated into pET28 expression plasmid in E. coli BL21 (DE3) and IPTG-induced recombinant expression. The recombinant forms were expressed with 30 kDa and 16 kDa (NcROP15B Major and Minor, respectively) and Major and Minor NcROP55 had molecular weights of 19.9 kDa and 15 kDa, respectively. After purification, NcROP15B and NcROP55 were used to obtain polyclonal serum. Anti-ROP15B and anti-ROP55 reacted with N. caninum extract in Western Blot 1D, with NcROP15B being detected at 35 kDa, near predicted (32 kDa) and NcROP55 at approximately 35 KDa, but below the predicted (47.9 kDa). At confocal immunofluorescence, NcROP-15B and NcROP55 exhibited a localization pattern at the perinuclear region of N. caninum tachyzoites. Anti-NcROP15B and anti-NcROP55 antibodies had, individually, limited ability to inhibit the N. caninum adhesion/invasion process (16 and 6,43%, respectively). When associated, anti-NcROP15B and anti-NcROP55 sera inhibition of invasion increased to 62%. NcROP-15B and NcROP55 proteins might represent important kinases in the metabolism of N. caninum with a possible role in the parasite invasion and proliferation process. Thus, they represent possible targets for preventive measures, but further studies are necessary to evaluate their functions in intracellular survival and virulence of N. caninum.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Decline cognitive related to neurodegenerative diseases are very commom in patients, probably in function of aging. Since there are few effectives therapeutics approaches to loss memory treatment, but studies about new therapeutics approaches are necessary regarding neuroprotective drugs. Thus, recent works have been showing the efficacy of some neuroprotective compounds like creatine (Cr) in treatment of patients and experimental models with memory defcit. Creatine is a guanidine compound synthesized from glycine, arginine and S-adenosylmethionine in the kidneys, liver and brain that have been presented neuroprotective and neuromodulatory effect in the central nervous systems. Some works suggest that guanidine compounds like Cr could enhance learning by modulation polyamines binding sites at the N-methyl-D-Aspartate (NMDA) receptor and act as energetic buffer intracellular. In these context, the propose of this work was investigate the involvement of Cr transporter (CreaT), cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) signaling pathway in the spatial learning after intrahippocampal injection of Cr. After training on Barnes Maze, Cr and/or 3-GPA (inhibitor CreaT), Cr and/or H-89 (PKA inhibitor), Cr and/or STO-609, (inhibitor of CaMKII) bilateral intrahipocappus administration was performed. The results showed that intrahippocampal administration of 3-GPA, H-89 and STO-609 attenuated the facilitatory effect of Cr on spatial learnig performed on barnes Maze. Therefore, we decide investigate the involvement of the PKA (pPKA), CaMKII (pCaMKII) and CREB (pCREB) activation after intrahippocampus creatine administration in rats trained on Barnes Maze. The results showed that Cr enhanced pCREB levels and pCaMKII levels. Thirty minutes after creatine administration was observed pCREB an pCaMKII levels enhancement, on the other hand, pPKA levels enhancement was not observed. These data suggest that spatial learning enhancement elicited by Cr may be mediated by trans-cellular creatine transports, as well, CaMKII/CREB intracellular pathway in rat hippocampus / O declínio cognitivo associado a doenças neurodegenerativas é um sintoma cada vez mais comum encontrado em pacientes, provavelmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. Dada a escassez de medidas terapêuticas efetivas para o déficit de memória apresentado por pacientes, evidencia-se a importância da busca de novos compostos e do estudo de seus mecanismos de ação. Nesse contexto, recentes estudos mostraram a eficácia de algumas substâncias com ação neuroprotetora, como a creatina (Cr), na terapia de pacientes com déficit de memória e em modelos experimentais. A Cr é um composto guanidínico sintetizado endogenamente nos rins, fígado, pâncreas e cérebro, que apresenta ação neuroprotetora e neuromoduladora no sistema nervoso central. Estudos mostram que a administração de compostos guanidínicos, como a Cr, podem estar relacionados com a melhora da memória devido à interação com o sítio das poliaminas no receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) e por atuar como tampão energético intracelular. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar o envolvimento do transportador de Cr (CreaT), das proteínas quinases dependente de AMPc (PKA) e dependente de Ca2+/calmodulina II (CaMKII) na melhora do aprendizado espacial induzido por Cr no hipocampo de ratos. Após o treino no labirinto de Barnes, os ratos foram injetados no hipocampo, bilateralmente, com Cr e/ou 3-ácido guanidinico propiônico (3-GPA, um inibidor do transportador de creatina); Cr e/ou [N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinoline sulfonamide, Di-HCl Salt] (H-89, um inibidor da PKA); Cr e/ou 1,8-Naphthoylene benzimidazole-3- carboxylic acid (STO-609, um inibidor da CaMKII). A administração de 3-GPA, H-89 e STO-609 diminuiu o efeito facilitatório da Cr na memória espacial de ratos, observado no teste do labirinto de Barnes. De acordo com esses resultados, decidimos investigar o envolvimento da ativação do elemento de ligação responsivo ao AMPc (pCREB), PKA (pPKA) e CaMKII (pCaMKII) após a administração de Cr no hipocampo de animais treinados no labirinto de Barnes. Trinta minutos após a injeção de Cr, foi observado um aumento nos níveis de pCREB e pCaMKII, mas não nos níveis de pPKA no hipocampo de ratos. Estes achados sugerem que a facilitação do aprendizado espacial induzido pela Cr depende do seu transporte para o meio intracelular, assim como, envolve a via de sinalização celular da CaMKII/CREB no hipocampo de ratos.

Orientadores: Licio Augusto Velloso, Marcio Alberto Torsoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T11:00:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MaristelaCesquinide_D.pdf: 2056313 bytes, checksum: fe162225f6402886dd228faa021438b9 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O aumento da prevalência da obesidade e diabete tipo 2 nas sociedades modernas está fortemente associado às doenças cardiovasculares, hipertensão, infarto e aterosclerose. Estas patologias têm sido relacionadas com ingestão calórica excessiva e diminuição do gasto energético. Muitos fatores regulam a ingestão alimentar, incluindo hormônios como insulina e leptina, alimentos e comportamento. Estes fatores são integrados no hipotálamo que media um sistema de sinalização celular para regular o comportamento alimentar e o balanço energético da célula. A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) tem sido proposta como capaz de mediar as adaptações celulares às variações nutricionais ambientais. O resultado da ativação da AMPK é a inibição de vias biossintetizantes que consomem energia, tais como as vias de síntese de ácidos graxos e proteínas, e a ativação de vias catabólicas, como a via de oxidação de ácidos graxos e a glicólise. No hipotálamo, a AMPK desempenha o papel de mediar os efeitos hormonais na ingestão alimentar e no balanço energético. Outras moléculas, como a acetil-CoA carboxilase (ACC) e o seu produto, o malonil-CoA têm sido propostas como possíveis intermediários na sinalização hipotalâmica que monitora o estado energético do corpo. No presente trabalho, nós administramos citrato, um ativador alostérico da ACC, no hipotálamo de ratos a fim de investigarmos o efeito deste composto na atividade hipotalâmica e hepática da AMPK. O resultado desta modulação no metabolismo energético, metabolismo de glicose e comportamento alimentar foi comparado aos ratos tratados com salina. Nós observamos que o tratamento com citrato inibiu a fosforilação da AMPK hipotalâmica seguido de inibição da fosforilação da ACC hipotalâmica, indicando menor atividade da AMPK neste tecido. A inibição da AMPK promoveu diminuição da ingestão alimentar, perda de peso corpóreo e aumento da expressão dos neuropeptídeos anorexigênicos POMC e CRH. No grupo de ratos tratados com citrato, a captação de glicose foi maior do que nos ratos que receberam solução salina, como mostrada pelo teste tolerância à glicose (GTT) e pelo clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico. Consistente com estes resultados, no fígado, os ratos tratados com citrato mostraram maior fosforilação das proteínas da cascata de sinalização da insulina, reduzidos níveis de fosforilação da AMPK e ACC e expressão aumentada da PEPCK e G6Pase, se comparado aos animais controle. O efeito central do citrato na melhora da sinalização da insulina nos tecidos periféricos, na ativação da produção de glicose pelo fígado e na inibição da AMPK hepática foi bloqueado por antagonista ?-adrenérgico. De acordo com estes resultados, nós podemos sugerir que a modulação da AMPK por intermediários metabólicos possa ser um mecanismo importante de controle da homeostase energética e consequentemente do diabetes e obesidade / Abstract: The increased prevalence of obesity and type II diabetes in modern societies is largely linked to cardiovascular disease, hypertension, stroke and atherosclerosis. These pathologies have been associated to excessive caloric intake and decreased energy expenditure. Many factors regulate food intake, including hormones such as insulin and leptin, fuels and behavior. These factors are integrated in the hypothalamus that mediates a signaling system to regulate food behavior and cellular energy balance. The AMPactivated protein quinase (AMPK) has been proposed to be capable of mediating the cellular adaptations to nutritional environmental variation. The result of AMPK activation is the inhibition of nergy-consuming biosynthetic pathways, such as fatty acid and protein synthesis, and activation of ATP-catabolic pathways, such as fatty acid oxidation and glycolysis. In the hypothalamus, AMPK mediates hormonal effects on food intake and energy balance. Other molecules, such as acetyl-CoA carboxylase (ACC) and its product malonyl-CoA have been proposed as possible intermediaries in the hypothalamic signaling pathway that monitors energy status. In the present work we administrated citrate, an allosteric activator of ACC, in the hypothalamus to investigate its effect on hypothalamic and hepatic AMPK activity and the result of this modulation in the energetic cellular metabolism, such as glucose metabolism and food behavior. Results were compared to saline-treated rats. Here we show that citrate treatment inhibited hypothalamic AMPK phosphorylation followed by an inhibition of hypothalamic ACC phosphorylation, indicating lower AMPK activity in this tissue. The AMPK inhibition promoted decrease in food intake, loss of body weight and increased expression of anorexigenic neuropeptides (POMC and CRH). In the citrate group, the glucose uptake was higher than in animals receiving saline according to GTT and hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Consistent with these results, in the liver, citrate-treated rats showed also higher phosphorylation of insulin signaling proteins than control rats, reduced AMPK and ACC phosphorylation and increased PEPCK and G6Pase expression. Supported by these results, we suggest that AMPK modulation by citrate can be an important mechanism to understand deregulated glucose metabolism involved in diabetes and obesity. The central effect of citrate in the improvement of peripheral insulin signaling, in the activation of liver glucose production, and in the inhibition of hepatic AMPK was blocked by the ?-adrenergic antagonist. According to these results, we suggest that AMPK modulation by metabolic intermediaries can be an important mechanism controlling the energetic homeostase, diabetes and obesity / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Estudos recentes demonstram que o Hormônio Tiroideano (HT) é capaz de modular rapidamente o estado de fosforilação de proteínas quinases relacionadas ao processo de hipertrofia cardíaca. Evidências experimentais indicam que a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) seja um alvo importante no controle do crescimento hipertrófico, uma vez que a ativação desta enzima determina ampla variedade de efeitos siológicos, incluindo o controle de proteínas relacionadas à síntese protéica. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram os de avaliar os efeitos do HT sobre a modulação da via de sinalização da AMPK, além de verificar o possível envolvimento desta quinase no modelo de hipertrofia in vitro induzida pelo HT. Os resultados obtidos mostraram que rapidamente este hormônio ativa a AMPK e proteínas relacionadas a esta sinalização. Além disso, a estimulação farmacológica da AMPK atenua a hipertrofia de cardiomiócitos induzida pelo HT. Estes dados sugerem que a AMPK seja uma possível ferramenta terapêutica em doenças cardiovasculares como a hipertrofia cardíaca. / Some studies have shown that Thyroid Hormones (TH) are also able to rapidly modulate the phosphorylation state of protein kinases related to cardiac hypertrophy process by non-genomic actions. In this sense, experimental evidences indicate that AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important target in the control of hypertrophic growth, since the activation of this enzyme determines wide variety of physiological effects, including the control of enzymes related to protein synthesis. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of TH on the modulation of AMPK signaling pathway and to check the possible involvement of this kinase in vitro model of hypertrophy induced by TH. The results showed that this hormone rapidly activates AMPK and related proteins to this signaling. Furthermore, pharmacological stimulation of AMPK attenuated cardiomyocyte hypertrophy induced by TH. These data suggest that AMPK may correspond to a possible therapeutic tool in cardiovascular disease.

Estudos recentes demonstram que o Hormônio Tiroideano (HT) é capaz de modular rapidamente o estado de fosforilação de proteínas quinases relacionadas ao processo de hipertrofia cardíaca. Evidências experimentais indicam que a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) seja um alvo importante no controle do crescimento hipertrófico, uma vez que a ativação desta enzima determina ampla variedade de efeitos siológicos, incluindo o controle de proteínas relacionadas à síntese protéica. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram os de avaliar os efeitos do HT sobre a modulação da via de sinalização da AMPK, além de verificar o possível envolvimento desta quinase no modelo de hipertrofia in vitro induzida pelo HT. Os resultados obtidos mostraram que rapidamente este hormônio ativa a AMPK e proteínas relacionadas a esta sinalização. Além disso, a estimulação farmacológica da AMPK atenua a hipertrofia de cardiomiócitos induzida pelo HT. Estes dados sugerem que a AMPK seja uma possível ferramenta terapêutica em doenças cardiovasculares como a hipertrofia cardíaca. / Some studies have shown that Thyroid Hormones (TH) are also able to rapidly modulate the phosphorylation state of protein kinases related to cardiac hypertrophy process by non-genomic actions. In this sense, experimental evidences indicate that AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important target in the control of hypertrophic growth, since the activation of this enzyme determines wide variety of physiological effects, including the control of enzymes related to protein synthesis. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of TH on the modulation of AMPK signaling pathway and to check the possible involvement of this kinase in vitro model of hypertrophy induced by TH. The results showed that this hormone rapidly activates AMPK and related proteins to this signaling. Furthermore, pharmacological stimulation of AMPK attenuated cardiomyocyte hypertrophy induced by TH. These data suggest that AMPK may correspond to a possible therapeutic tool in cardiovascular disease.

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoJorge_M.pdf: 2550633 bytes, checksum: 914361a57f5efd5794bcee99ff8ce2a4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Diabetes Mellitus (DM) é uma síndrome metabólica, de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica, decorrente da falta de insulina, às vezes, associado à resistência dos tecidos periféricos a esse hormônio. O DM1 é caracterizado pela infiltração de macrófagos e linfócitos do tipo T-CD4+ e T-CD8+ no pâncreas, devido a uma falha do reconhecimento no sistema autoimune, que desencadeiam processos inflamatórios com liberação de óxido nítrico (NO), de radicais livres e de citocinas tais como: interleucina-1? (IL-1 ?) e Interferon- ? (IFN- ?). Essas citocinas pró-inflamatórias ativam mecanismos que levam a morte celular por apoptose, com perda da massa funcional das células beta. Esses mecanismos podem ser reproduzidos in-vitro pela exposição de células beta a essas citocinas ou à Aloxana. O CNTF é uma citocina de sobrevivência neuronal, e em células beta age sobre o controle glicêmico inibindo secreção de insulina e promovendo sobrevivência de ilhotas. A AMPK é uma proteína quinase que em células beta atua como um sensor do estado energético celular e, quando as concentrações intracelulares de ATP diminuem, a AMPK é ativada estimulando geração de ATP e inibindo o consumo desse nucleotídeo. Em ilhotas, a AMPK desempenha função importante na regulação da secreção de insulina sendo que a inibição de AMPK protege as células beta da apoptose mediada por citosinas (IL-1? e IFN-?) ou induzidas por células T do tipo CD8+ e CD4+. Diante do exposto, conclui-se que CNTF e AMPK desempenham funções importantes e correlatas nas células beta pancreáticas e, podem ser considerados alvos terapêuticos para o tratamento do DM tipo I. Contudo, a interação entre esses dois fatores (CNTF e AMPK) em células secretoras de insulina permanece desconhecida. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a possível papel da interação entre CNTF e AMPK na morte celular induzida pelos agentes diabetogênicos IL-1? e Aloxana. Nossos resultados indicaram que: A Aloxana e a IL-1? dependem da via da AMPK para induzir apoptose em células MIN6; O CNTF modula a via da AMPK em células MIN6 e ilhotas de camundongos Swiss neonato. O CNTF foi capaz de impedir a morte celular induzida por Aloxana e por IL-1? através da downregulation da via da AMPK em células MIN6. / Abstract: Diabetes Mellitus (DM) is a metabolic syndrome of multiple etiologies, resulting from the lack of insulin sometime associated with an increase in the resistance to the hormone by insulin-target tissues. DM1 is characterized by the infiltration of macrophages and T-type CD4 + and T-CD8 + cells in the pancreas, due to a failure of the autoimmune system, causing inflammation and leading to the release of nitric oxide (NO), free radicals, and cytokines such as interleukin-1? (IL-1?) and interferon-? (IFN-?). These pro-inflammatory cytokines activate pro-apoptotic mechanisms, triggering beta cell death apoptosis, leading to a loss in functional beta cell mass. These mechanisms may be reproduced in vitro with exposure of beta cells to pro-inflammatory cytokines such as IL-1? or to Alloxan. The cytokine CNTF is a neuronal survival factor. Besides, CNTF modulates glycemia, inhibiting insulin secretion and promoting islet cells survival. AMPK is a protein kinase that acts on pancreatic beta cells as a sensor of the cellular energy state, and is activated when the cellular ATP concentrations decrease, stimulating ATP generation and inhibiting ATP consumption. In islets, AMPK plays an important role in regulating insulin secretion and inhibition of AMPK protects beta cells from apoptosis mediated by either cytokines (IL-1? and IFN-?) and/or induced T cell CD8 + and CD4 +. AIMS: Given that, both CNTF and AMPK play important role in beta cells and may be used as therapeutic targets for the treatment of DM1. However, the interaction between these two factors (CNTF and AMPK) in pancreatic beta cells remains unknown. Thus, the objective of this work was to investigate the relationship between interaction of AMPK and CNTF on pancreatic beta cell death, induced by Alloxan or IL-1?. Our results indicated that both Alloxan and IL-1? are dependent of AMPK pathway to induce apoptosis in MIN6 cells; CNTF inhibits AMPK pathway in MIN6 cells as well as in islets of newborn Swiss mice; CNTF prevents beta cell death, induced by Alloxan and IL-1?, through downregulation of AMPK pathway in MIN6 cells. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcio Alberto Torsoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:25:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoAparecidodos_M.pdf: 1529206 bytes, checksum: e9aae5229598f14274aea766dccadceb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A hipoglicemia endotóxica tem papel importante na sobrevivência de ratos e pacientes com sepse. O hipotálamo e uma importante área no sistema nervoso central que regula a homeostase energética. Estudos recentes têm demonstrado à importante papel da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) no controle da homeostase glicêmica, sendo um importante sensor energético ativado quando a uma diminuição de disponibilidade energética como é observado na hipoglicemia, e por controlar importantes estímulos que visão restabelecer a glicemia como a modulação da produção de glicose hepática. Até o momento não existem estudos que investiguem o papel da AMPK hipotalâmica na endotoxemia e na hipoglicemia associada a essa enfermidade. Por isso o objetivo do nosso estudo foi o de avaliar a participação das citocinas inflamatórias e da AMPK hipotalâmica na redução da resposta contrarregulatória hepática durante a endotoxemia promovida por LPS. Para isso foram utilizados camundongos (Swiss) e camundongos com mutação no receptor TLR4 (C3H/HeJ) e seus controles selvagens (Wild type (C3H/HeN)) ambos os animais receberam LPS (1mg/Kg) ou salina intraperitonealmente ou/e AICAR por via intracerebroventricular e após os tempos pré-estabelecidos obtivemos os resultados que mostram que a administração periférica de LPS induz o aumento nas citocinas TNF? e IL?, ocorreu a desfosforilação da AMPK hipotalâmica e menor fosforilação da sua proteína alvo a ACC se comparado ao grupo controle; desfosforilação da AMPK hepática e ACC hepática, aumento da fosforilação da STAT3 hipotalâmica e hepática, aumento da fosforilação a TAK1 hipotalâmica e quantidade da MyD88 hipotalâmica proteínas da via do TLR4 se comparado ao grupo controle, também foi observado aumento na fosforilação da JNK hepática, redução da ingestão alimentar, redução da glicemia basal e um possível aumento na captação de glicose observada pelo teste de tolerância à glicose nos animais que receberam LPS, também foi observado à diminuição da quantidade e expressão da proteína PEPCK e diminuição da G6Pase resultado que corroborou o resultado da diminuição da produção de glicose hepática observada no teste de tolerância ao piruvato (PTT). A redução na glicemia nos animais nos gerou uma hipótese de que esse efeito pode ter a participação da insulina onde observamos um significativo aumento nos níveis séricos deste hormônio, a ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica reduziu o efeito hipoglicemiante do LPS, onde também observamos que a ativação farmacológica da AMPK inibiu a diminuição das proteínas PEPCK e G6Pase deflagrado pelo LPS sugerindo que a um controle hipotalâmico através da AMPK sobre a secreção de glicose. Nos animais mutantes do receptor TLR4 (C3H/HeJ) não houve diminuição da glicemia e desfosforilação da AMPK hipotalâmica e diminuição da PEPCK hepática como observamos nos animais Wild type (C3H/HeN). Mostrando que o receptor TLR4 possui uma atividade intrínseca na indução à hipoglicemia e desfosforilação da AMPK. Os dados do nosso trabalho mostram que a endotoxemia ocasionada pela administração de LPS exerce uma importante modulação da ação da AMPK hipotalâmica, modulação negativa da ingestão e glicemia plasmática, alem de inibir a produção de glicose e expressão e quantidades de proteínas neoglicogênicas e ativação de vias inflamatórias mostrando que a sepse e/ou endotoxemia por LPS leva a severos danos na homeostase glicêmica, contudo também mostramos que a ativação da AMPK hipotalâmica consegue minimizar os efeitos oriundos da endotoxemia, mostrando que mecanismos que atuem sobre a ativação da AMPK hipotalâmica podem contribuir para o tratamento da Sepse/endotoxemia / Abstract: Endotoxic hypoglycaemia has an important role in the survival rates of septic patients. Currently, the hypothalamus is the main area of the brain that regulates glycemic homeostasis. Previous studies have demonstrated that hypothalamic AMP-activated protein kinase (AMPK) activity is sufficient for nutrient-sensing mechanisms to modulate glucose production. However, the role of hypothalamic AMPK in hypoglycaemia associated with endotoxemia is unknown. The aims of this study were to examine hypothalamic AMPK dephosphorylation in lipopolysaccharide (LPS) treated mice and to determine whether pharmacological AMPK activation could reduce the effects of endotoxemia on the liver metabolism of glucose. Fasted Swiss mice and C3H/HeJ (TLR4-receptor mutant) and C3H/HeN (wild type) mices received intraperitoneal injections of LPS (1mg/kg). LPS-treated mice showed reduced food intake and diminished basal glycemia, increased serum TNF? and IL1? levels and hypothalamic p-TAK and TLR4/MyD88 association. These effects were accompanied by hypothalamic AMPK/ACC dephosphorylation and reduction of glucose production in the liver. Interestingly, the LPS treated mice liver also showed diminished expression of PEPCK/G6Pase and reduction in p-FOXO1, p-AMPK, p- STAT3 and p-JNK level. In contrast, the pharmacological hypothalamic AMPK activation blocked the effects of LPS on the hypothalamic AMPK phosphorylation, liver PEPCK expression and glucose production. Furthermore, the effects of LPS were TLR4-dependent because no effect on hypothalamic AMPK phosphorylation, liver PEPCK expression and basal glycemia was detected in C3H/HeJ (TLR4- receptor mutant) mice. These results suggest that hypothalamic AMPK activity may be an important pharmacological target to control glucose homeostasis during endotoxemia / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Ciências

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T14:08:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kato_LarissaSayuri_M.pdf: 3085711 bytes, checksum: 2c9b592f72e52ceb332be3af215a87fe (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estudo das vias de sinalização envolvidas no metabolismo energético é de grande relevância fisiológica, uma vez que um desequilíbrio da homeostase energética pode resultar em obesidade e/ou síndrome metabólica e aumento da mortalidade por doença cardiovascular. Estudos recentes de nosso grupo em três modelos experimentais que exibem distintos tipos de dislipidemias revelaram alterações significativas da composição corporal, gasto energético e padrão de ingestão alimentar. Neste trabalho estudamos a homeostase energética desses modelos dislipidêmicos avaliando: (1) a expressão e fosforilação da proteína quinase dependente de AMP (AMPK), um importante regulador do metabolismo energético, bem como de seu alvo, a enzima acetil-CoA carboxilase (ACC), em fígado e músculo esquelético de camundongos hipoalfalipoproteinêmicos e hipercolesterolêmicos e (2) o efeito da alimentação pareada em animais hipertrigliceridêmicos que apresentam alterações de comportamento alimentar, metabolismo corporal e maior atividade do canal mitocondrial de potássio sensível ao ATP (mitoKATP). Considerando os animais hipoalfalipoproteinêmicos (transgênicos para CETP), os quais apresentam aumento de gasto energético global, verificamos que estes apresentam redução da massa relativa dos depósitos adiposos quando comparados os controles wild type (WT). O estudo da ativação da AMPK e da ACC mostra que o estado energético dos tecidos muscular e hepático parece não diferir nos animais CETP e WT. Tanto no fígado como no músculo dos animais CETP não houve alteração da massa e do estado de ativação da AMPK e da ACC. Estes resultados sugerem que não ocorrem variações significativas na síntese, armazenamento e "exportação" de lípides no fígado destes animais. Em relação ao músculo sóleo, pode-se concluir que não há alteração de síntese e catabolismo lipídico nos animais CETP. De modo geral, podemos dizer que a sinalização da AMPK não está ativada nestes tecidos e, portanto, que o maior metabolismo corporal observado nestes animais deve estar sendo causado por outros tecidos do organismo, por exemplo, o próprio tecido adiposo. Em animais machos e fêmeas hipercolesterolêmicas (LDLR0) observamos redução da massa corporal, porém sem alteração significativa da massa relativa dos depósitos adiposos quando comparados aos animais controles wild type. Os resultados sobre ativação da AMPK e da ACC mostram que o estado energético em tecidos periféricos é diferente nos animais LDLR0 e controles (WT). No fígado das fêmeas hipercolesterolêmicas observamos aumento da ativação da AMPK sem alteração significativa da fosforilação da ACC. Isso significa que não houve inibição da lipogênese ou ativação da beta-oxidação no fígado dos animais hipercolesterolêmicos, embora possa ter havido aumento de catabolismo de outros nutrientes. No músculo sóleo das fêmeas e dos machos não houve alteração de fosforilação de ambas AMPK e ACC. Pode-se então concluir que não há deprivação energética no músculo destes animais. Considerando o estudo em animais hipertrigliceridêmicos (HTG), quando submetidos ao regime de paired feeding (PF) observamos uma redução de 17% no consumo alimentar nas fêmeas e nos machos HTG quando comparados aos HTG alimentados ad libitum (ad lib). Isso levou a uma redução significativa do ganho de peso dos HTG-PF comparados aos WT-ad lib, em ambos os sexos. Os animais HTG-PF mantiveram a massa dos depósitos adiposos da carcaça semelhantes aos WT-ad lib e HTG-ad lib. No entanto, o depósito adiposo visceral das fêmeas HTG-ad lib é menor que dos WT-ad lib, enquanto nos machos, os HGT-PF apresentaram maior adiposo visceral que os HTG-ad lib. Quando comparados aos WT-ad lib, verificamos que as fêmeas HTG-PF mantiveram aumento significativo da atividade (abertura) do canal de potássio mitocondrial sensível ao ATP (mitoKATP) e da produção corporal de CO2. No entanto, nos machos HTG-PF houve fechamento dos mitoKATP, redução da produção de CO2 e manutenção da massa corporal. Assim, pode-se inferir que o metabolismo corporal (produção de CO2) reflete o aumento do metabolismo celular causado por aumento da atividade do mitoKATP que desacopla levemente as mitocôndrias e que estas adaptações são revertidas pela restrição alimentar nos machos, mas não nas fêmeas HTG / Abstract: An imbalance of energy homeostasis can result in obesity and/or metabolic syndrome and increased mortality from cardiovascular disease. Recent studies by our group in three experimental models that exhibit different types of dyslipidemia have shown significant changes in body composition, energy expenditure and food intake. In this work we studied the energy homeostasis in these models through: (1) quantifying the expression and phosphorylation of AMP-dependent protein kinase (AMPK), a key regulator of energy metabolism, as well as its target, the enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACC) in liver and skeletal muscle in hypoalphalipoproteinemic and hypercholesterolemic mice and (2) the effect of paired feeding regimen on hypertriglyceridemic mice that present increased food intake, body CO2 production and increased activity of the mitochondrial potassium channel sensitive to ATP (mitoKATP). Considering the hypoalphalipoproteinemic mice (transgenic for CETP), which show an increased overall energy expenditure, we found that these mice have reduced relative fat depot mass when compared to wild type controls (WT). Western blot analyses showed that, in both tissues, liver and muscle, there were no changes in mass and state of activation of AMPK and ACC in CETP compared to WT mice. These results suggest that no significant variations in the synthesis, storage and secretion of lipids in the liver of these mice. Regarding the soleus muscle, these results suggest that there is no change in lipid synthesis and catabolism in CETP mice. Overall we may say that AMPK signaling is not activated in liver and muscle tissues and, therefore, that the increased body metabolism observed in these CETP mice must be caused by other body tissues, for example, the adipose tissue itself. In hypercholesterolemic male and female mice (LDLR0) we observed a reduction in body mass, but no significant change in the relative mass of fat depots when compared to WT. The results on activation of AMPK and ACC show that the liver of LDLR0 females had increased activation of AMPK without significant change in the phosphorylation of ACC. This means that there was no inhibition of lipogenesis and activation of ?-oxidation in the liver of hypercholesterolemic mice, although there may have been increased catabolism of other nutrients. In the soleus muscle of females and males there were no changes in the phosphorylation state of both AMPK and ACC. Then, we can conclude that there is no energy deprivation in the muscle of these LDLR0 mice. Considering the study with hypertriglyceridemic (HTG) mice, when subjected to the paired feeding (PF) we observed a 17% reduction in food intake of females and males when compared to HTG mice fed ad libitum (ad lib). This led to a significant reduction in HTG-PF weight gain compared to WT-ad lib in both sexes. HTG-PF mice retained the mass of carcass fat deposits similar to WT and HTG ad lib. Compared to WT-ad lib, HTG-PF mice maintained significant increased activity (opening) of the mitoKATP and body CO2 production. These data showed that the regimen of paired feeding in which HTG mice were submitted did not change the high rate body metabolism and mitochondrial resting respiration observed in HTG-ad lib mice. These results suggest that the metabolic adaptation of HTG (higher activity of mitoKATP) is not sensitive to changes in food restriction and compromises the rate of body growth / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular