Orientador: Márcio Alberto Torsoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:21:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_ViniciusDias_M.pdf: 1179657 bytes, checksum: 3d71a3a82020acdf4b2e2a10b8eabfdf (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A AMPK hipotalâmica age como um sensor energético e é capaz de modular a ingestão alimentar, homeostase de glicose e a biossíntese de ácidos graxos. É conhecido que a injeção intra-hipotalâmica de ácidos graxos suprime a produção de glicose pelo fígado, principalmente pela ativação de canais de potássio sensíveis a ATP hipotalâmico (K(ATP)). Uma vez que em todos os modelos estudados a biossíntese de malonil-CoA estava envolvida, nós hipotetizamos que a Acetil-CoA Carboxilase poderia modular respostas contra-regulatórias independente da disponibilidade de nutrientes. Nesse estudo foram empregados os seguintes métodos: Immunoblot, PCR em tempo real, ELISA e avaliações bioquímicas. Através desses métodos, nós mostramos que a redução da expressão de acetil-CoA carboxilase pela injeção de oligonucleotídeo antisense intraventricular resultou no aumento da ingestão alimentar e diminuiu a expressão dos mRNA de CART, CRH e TRH. Além disso, como nos ratos em jejum, os ratos tratados com oligonucleotídeo antisense apresentaram concentrações de corpos cetônicos e glucagon séricos aumentados, além de níveis de insulina e glicogênio hepático diminuídos. A redução de acetil-CoA carboxilase hipotalâmica também aumentou a expressão de PEPCK, fosforilação de AMPK e a produção de glicose no fígado. Interessantemente, esses efeitos foram observados sem modificação da fosforilação da AMPK hipotalâmica. Com isso, concluímos que a inibição da ACC hipotalâmica pode ativar resposta contra-regulatória hepática independente da ativação da AMPK hipotalâmica / Abstract: BACKGROUND: Hypothalamic AMPK acts as a cell energy sensor and can modulate food intake, glucose homeostasis, and fatty acid biosynthesis. Intrahypothalamic fatty acid injection is known to suppress liver glucose production, mainly by activation of hypothalamic ATP-sensitive potassium (K(ATP)) channels. Since all models employed seem to involve malonyl-CoA biosynthesis, we hypothesized that acetyl-CoA carboxylase can modulate the counter-regulatory response independent of nutrient availability. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: In this study employing immunoblot, realtime PCR, ELISA, and biochemical measurements, we showed that reduction of the hypothalamic expression of acetyl-CoA carboxylase by antisense oligonucleotide after intraventricular injection increased food intake and diminished the expression of CART, CRH, and TRH mRNA. Additionally, as in fasted rats antisense oligonucleotide-treated rats, increased serum glucagon and ketone bodies were observed along with diminished levels of serum insulin and hepatic glycogen. The reduction of hypothalamic acetyl-CoA carboxylase also increased PEPCK expression, AMPK phosphorylation, and glucose production. Interestingly, these effects were observed without modification of hypothalamic AMPK phosphorylation. CONCLUSION/SIGNIFICANCE: Hypothalamic ACC inhibition can activate hepatic counter-regulatory response independent of hypothalamic AMPK activation / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6583_1.pdf: 2036261 bytes, checksum: 2f9456a9138bbf6c7d3482c028af1558 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / O diabetes mellitus é um grave problema de saúde pública caracterizado por hiperglicemia crônica ocasionada pela ausência ou ineficiência da insulina nos tecidos-alvo. Muitas espécies de plantas têm sido usadas na medicina popular para tratar os sintomas da doença. Na etnofarmacologia, o chá da casca de Caesalpinia ferrea Martius Ext Tul tem sido usado no tratamento do diabetes. Nesse estudo, metabólitos secundários foram identificados e quantificados por HPLC. A fim de verificar a atividade antidiabética de C. ferrea, quatro grupos de ratos Wistar diabéticos induzidos por estreptozotocina (50mg/Kg) (n=7/grupo) foram tratados com o extrato aquoso da casca do caule de C. ferrea (EaCf) (300 e 450mg/Kg/dia), veículo e metformina (500mg/Kg/dia) durante 4 semanas. Mudanças no ganho de massa, no consumo de água e ração e nos parâmetros bioquímicos foram avaliadas. A expressão da proteína quinase B (Akt), da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) e acetil-CoA carboxilase (ACC) foram determinadas no fígado e músculo esquelético dos animais usando Western blot. A avaliação da segurança de uso do EaCf foi verificada através dos ensaios de toxicidade aguda, subcrônica, crônica e reprodutiva. Para os ensaios de toxicidade aguda, o EaCf (2000mg/Kg) foi administrado em ratos Wistar de ambos os sexos (n= 5/grupo/sexo). Na toxicidade subcrônica, ratos Wistar machos (n=10/grupo) foram tratados durante 30 dias com o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) e na crônica, o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) foi administrado aos camundongos Swiss machos durante 90 dias. Ao final do tratamento foram realizadas análises bioquímicas, hematológicas, macro e microscópicas dos órgãos. Na toxicidade reprodutiva, o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) foi administrado em ratas Wistar prenhes durante o período integral de gestação para avaliação dos parâmetros reprodutivos maternos e comportamentais da prole. O conteúdo de ácido gálico, catequina, epicatequina e ácido elágico quantificado por HPLC foi de 112,76; 17,75; 6,13 e 12,00mg/g. Os resultados ainda mostraram que EaCf reduziu os níveis glicêmicos e melhorou o estado metabólico geral dos animais diabéticos. A ativação da Akt foi observada no fígado e músculo esquelético dos animais tratados com conseqüente desativação da AMPK no músculo e ativação da ACC em ambos quando comparado aos não-tratados. Na toxicidade aguda, o tratamento não induziu nenhum sinal de toxicidade ou morte, e na subcrônica, não houve alterações macro e microscópicas dos órgãos e nem nos parâmetros hematológicos e bioquímicos, exceto a amilasemia observada. Na toxicidade crônica, houve reduções no ganho de massa corporal, nos níveis séricos de proteínas totais e albumina (em ambas as doses). Na dose de 1500mg/Kg, houve aumento da lactato desidrogenase, amilase e necrose do intestino delgado. Durante toda a gestação, houve redução no ganho de massa corporal (1500mg/Kg) e na prole foram observadas reduções na massa corporal no 1º e 4º dias de vida e no comprimento, no 21º dia de vida pós-natal (1500mg/Kg). Os resultados sugerem que EaCf apresenta atividade antidiabética e age, possivelmente, regulando a captação hepática e muscular de glicose via Akt. O tratamento crônico sugere toxicidade principalmente na maior dose, provavelmente pela ação dos taninos que comprometem a absorção de macronutrientes

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T14:08:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kato_LarissaSayuri_M.pdf: 3085711 bytes, checksum: 2c9b592f72e52ceb332be3af215a87fe (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estudo das vias de sinalização envolvidas no metabolismo energético é de grande relevância fisiológica, uma vez que um desequilíbrio da homeostase energética pode resultar em obesidade e/ou síndrome metabólica e aumento da mortalidade por doença cardiovascular. Estudos recentes de nosso grupo em três modelos experimentais que exibem distintos tipos de dislipidemias revelaram alterações significativas da composição corporal, gasto energético e padrão de ingestão alimentar. Neste trabalho estudamos a homeostase energética desses modelos dislipidêmicos avaliando: (1) a expressão e fosforilação da proteína quinase dependente de AMP (AMPK), um importante regulador do metabolismo energético, bem como de seu alvo, a enzima acetil-CoA carboxilase (ACC), em fígado e músculo esquelético de camundongos hipoalfalipoproteinêmicos e hipercolesterolêmicos e (2) o efeito da alimentação pareada em animais hipertrigliceridêmicos que apresentam alterações de comportamento alimentar, metabolismo corporal e maior atividade do canal mitocondrial de potássio sensível ao ATP (mitoKATP). Considerando os animais hipoalfalipoproteinêmicos (transgênicos para CETP), os quais apresentam aumento de gasto energético global, verificamos que estes apresentam redução da massa relativa dos depósitos adiposos quando comparados os controles wild type (WT). O estudo da ativação da AMPK e da ACC mostra que o estado energético dos tecidos muscular e hepático parece não diferir nos animais CETP e WT. Tanto no fígado como no músculo dos animais CETP não houve alteração da massa e do estado de ativação da AMPK e da ACC. Estes resultados sugerem que não ocorrem variações significativas na síntese, armazenamento e "exportação" de lípides no fígado destes animais. Em relação ao músculo sóleo, pode-se concluir que não há alteração de síntese e catabolismo lipídico nos animais CETP. De modo geral, podemos dizer que a sinalização da AMPK não está ativada nestes tecidos e, portanto, que o maior metabolismo corporal observado nestes animais deve estar sendo causado por outros tecidos do organismo, por exemplo, o próprio tecido adiposo. Em animais machos e fêmeas hipercolesterolêmicas (LDLR0) observamos redução da massa corporal, porém sem alteração significativa da massa relativa dos depósitos adiposos quando comparados aos animais controles wild type. Os resultados sobre ativação da AMPK e da ACC mostram que o estado energético em tecidos periféricos é diferente nos animais LDLR0 e controles (WT). No fígado das fêmeas hipercolesterolêmicas observamos aumento da ativação da AMPK sem alteração significativa da fosforilação da ACC. Isso significa que não houve inibição da lipogênese ou ativação da beta-oxidação no fígado dos animais hipercolesterolêmicos, embora possa ter havido aumento de catabolismo de outros nutrientes. No músculo sóleo das fêmeas e dos machos não houve alteração de fosforilação de ambas AMPK e ACC. Pode-se então concluir que não há deprivação energética no músculo destes animais. Considerando o estudo em animais hipertrigliceridêmicos (HTG), quando submetidos ao regime de paired feeding (PF) observamos uma redução de 17% no consumo alimentar nas fêmeas e nos machos HTG quando comparados aos HTG alimentados ad libitum (ad lib). Isso levou a uma redução significativa do ganho de peso dos HTG-PF comparados aos WT-ad lib, em ambos os sexos. Os animais HTG-PF mantiveram a massa dos depósitos adiposos da carcaça semelhantes aos WT-ad lib e HTG-ad lib. No entanto, o depósito adiposo visceral das fêmeas HTG-ad lib é menor que dos WT-ad lib, enquanto nos machos, os HGT-PF apresentaram maior adiposo visceral que os HTG-ad lib. Quando comparados aos WT-ad lib, verificamos que as fêmeas HTG-PF mantiveram aumento significativo da atividade (abertura) do canal de potássio mitocondrial sensível ao ATP (mitoKATP) e da produção corporal de CO2. No entanto, nos machos HTG-PF houve fechamento dos mitoKATP, redução da produção de CO2 e manutenção da massa corporal. Assim, pode-se inferir que o metabolismo corporal (produção de CO2) reflete o aumento do metabolismo celular causado por aumento da atividade do mitoKATP que desacopla levemente as mitocôndrias e que estas adaptações são revertidas pela restrição alimentar nos machos, mas não nas fêmeas HTG / Abstract: An imbalance of energy homeostasis can result in obesity and/or metabolic syndrome and increased mortality from cardiovascular disease. Recent studies by our group in three experimental models that exhibit different types of dyslipidemia have shown significant changes in body composition, energy expenditure and food intake. In this work we studied the energy homeostasis in these models through: (1) quantifying the expression and phosphorylation of AMP-dependent protein kinase (AMPK), a key regulator of energy metabolism, as well as its target, the enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACC) in liver and skeletal muscle in hypoalphalipoproteinemic and hypercholesterolemic mice and (2) the effect of paired feeding regimen on hypertriglyceridemic mice that present increased food intake, body CO2 production and increased activity of the mitochondrial potassium channel sensitive to ATP (mitoKATP). Considering the hypoalphalipoproteinemic mice (transgenic for CETP), which show an increased overall energy expenditure, we found that these mice have reduced relative fat depot mass when compared to wild type controls (WT). Western blot analyses showed that, in both tissues, liver and muscle, there were no changes in mass and state of activation of AMPK and ACC in CETP compared to WT mice. These results suggest that no significant variations in the synthesis, storage and secretion of lipids in the liver of these mice. Regarding the soleus muscle, these results suggest that there is no change in lipid synthesis and catabolism in CETP mice. Overall we may say that AMPK signaling is not activated in liver and muscle tissues and, therefore, that the increased body metabolism observed in these CETP mice must be caused by other body tissues, for example, the adipose tissue itself. In hypercholesterolemic male and female mice (LDLR0) we observed a reduction in body mass, but no significant change in the relative mass of fat depots when compared to WT. The results on activation of AMPK and ACC show that the liver of LDLR0 females had increased activation of AMPK without significant change in the phosphorylation of ACC. This means that there was no inhibition of lipogenesis and activation of ?-oxidation in the liver of hypercholesterolemic mice, although there may have been increased catabolism of other nutrients. In the soleus muscle of females and males there were no changes in the phosphorylation state of both AMPK and ACC. Then, we can conclude that there is no energy deprivation in the muscle of these LDLR0 mice. Considering the study with hypertriglyceridemic (HTG) mice, when subjected to the paired feeding (PF) we observed a 17% reduction in food intake of females and males when compared to HTG mice fed ad libitum (ad lib). This led to a significant reduction in HTG-PF weight gain compared to WT-ad lib in both sexes. HTG-PF mice retained the mass of carcass fat deposits similar to WT and HTG ad lib. Compared to WT-ad lib, HTG-PF mice maintained significant increased activity (opening) of the mitoKATP and body CO2 production. These data showed that the regimen of paired feeding in which HTG mice were submitted did not change the high rate body metabolism and mitochondrial resting respiration observed in HTG-ad lib mice. These results suggest that the metabolic adaptation of HTG (higher activity of mitoKATP) is not sensitive to changes in food restriction and compromises the rate of body growth / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:19:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AMARANTE_Adriano_2013.pdf: 11925080 bytes, checksum: 6de5e4ba7ae233d30b78c7f1d927740a (MD5) Previous issue date: 2013-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work was developed a prototype of a new nanobiosensor with molecular specificity through a study of theoretical models of Chemical Force Microscope. For the sensing were used molecular modeling techniques as well as experimental models of the functionalized Atomic Force Microscope tip with the Acetil co-A Carboxylase (ACC) attached. Specific and non-specific inhibitors were used to evaluate substrate-enzyme interactions. The nanobiosensor investigates specific enzymatic inhibition characteristics of the ACC enzyme through the herbicide Diclofop by reversing this process applying a force in a determined direction. The force is theoretically calculated by using molecular dynamic techniques associated to the adhesion force experimentally obtained. Theoretical and experimental questions involving nanobiosensors of AFM tips still obscure until now, such as, the number of functional enzymes attached on the AFM tip, the number of the active sites available to interact after immobilization process, the consequences of the enzyme immobilization as well as the substrate and theoretical adhesion between AFM tip and substrate were analyzed here. / Este trabalho teve como objetivo principal desenvolver o protótipo de um novo nanobiossensor de alta especificidade por intermédio do estudo e desenvolvimento de modelos teóricos específicos para a Microscopia de Força Química (MFQ). Para o sensoriamento foram utilizadas técnicas de Modelagem Molecular Computacional (MMC) e resultados experimentais de MFQ, do qual a ponta do Microscópio de Força Atômica (AFM, do inglês Atomic Force Microscopy) foi funcionalizada com enzimas Acetil-coA Carboxilase (ACC). O nanobiossensor foi utilizado para detectar especificamente substratos de herbicidas específicos e não-específicos. O nanobiossensor explora as características de inibição enzimática específica da enzima ACC pelo herbicida Diclofop revertendo esse processo aplicando-se uma força numa determinada direção. Essa força foi calculada teoricamente por intermédio de cálculos de técnicas de Dinâmica Molecular e associada à força de adesão experimental. Os resultados experimentais validaram os modelos teóricos de forma inequívoca. Questões teóricas e experimentais envolvendo nanobiossensores de ponta de AFM não respondidas até o momento (número de enzimas úteis na ponta do AFM que podem interagir com o substrato, o número de sítios ativos disponíveis, consequências da imobilização das enzimas e do substrato, força de adesão teórica entre a ponta do AFM e o substrato de herbicidas, etc.) foram solucionadas neste trabalho.