Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo de investigación y, en el marco de un estudio estructural y funcional del citoesqueleto celular, se procedió a purificar las proteínas: tubulina, actina, tau y MAP-2. Las tres primeras proteínas se obtuvieron de cerebros de bovino frescos obtenidos en el matadero de SOFACAR S.A. Por otra parte, la actina fue purificada a partir de músculo de pollo. Una vez purificadas las proteínas y conocida su concentración, fueron caracterizadas por medio de electroforesis en PAGE, teñidos con azul de coomassie para ver su grado de pureza y también fueron inmunocaracterizadas, para su identificación molecular. Cada proteína se concentró y guardó a –80ºC hasta su uso. Posteriormente se realizaron experimentos de cinética de polimerización in vitro de microtúbulos y microfilamentos, en cuatro ensayos distintos, pero comparativos entre sí, utilizando para ello métodos turbidimétricos en los cuales se registraron las lecturas de los cambios de absorbancia bajo condiciones de pH y temperatura conocidas. Los dos primeros tenían como proteína base la tubulina (1,8mg/ml) a la cual se adicionó una de las diferentes MAPs. En un caso se incubó en presencia de tau (0,3mg/ml) y se registraron los cambios en absorbancia. En otro ensayo se adicionó MAP-2 (0,3mg/ml) a la tubulina pura incubada y se registró la cinética de polimerización. Ambas lecturas se realizaron a 340nm. Otros ensayos se realizaron con actina (0,4mg/ml), que fue incubada en primer lugar en presencia de tau y luego con MAP-2, registrándose los cambios de absorbancia a 232nm de longitud de onda constante. Los valores obtenidos en cada lectura fueron graficados en función del tiempo. Las curvas obtenidas fueron comparadas entre sí, para establecer las diferencias y semejanzas entre ellas. Durante los experimentos de cinética de polimerización, se tomaron alícuotas de cada ensayo a distintos tiempos, para luego procesar estas muestras y observarlas al microscopio electrónico, de modo de corroborar la curva de cinética respectiva con las estructuras formadas. Estas se analizaron comparativamente con los controles y entre sí. Por otra parte, se procedió a analizar las microfotografías obtenidas al incubar los microfilamentos con los microtúbulos preformados en presencia de tau o de MAP-2, para observar la presencia de interacciones macromoleculares entre las estructuras. Estos estudios se orientaron a reproducir in vitro un sistema de polimerización y depolimerización de las estructuras del citoesqueleto, de modo de aproximarse y comprender el proceso celular que ocurre normalmente en la célula, además de observar la participación de las MAPs en la formación y regulación de este sistema, y la interacción entre las macromoléculas que se forman, microtúbulos y microfilamentos. De lo expuesto, se verificó la reproducibilidad de la formación en condiciones in vitro de estructuras filamentosas y por medio del estudio comparativo de las MAPs se determinó que la proteína tau fue más eficiente que MAP-2 en promover la polimerización de estructuras del citoesqueleto, así como también se corroboró que ambas MAPs disminuyen fuertemente la concentración crítica necesaria tanto de tubulina como de actina en sus respectivos procesos de polimerización. En cuanto a las reacciones supramoleculares, al analizar las imágenes en microscopía electrónica se verifico la existencia de interacciones entre ambos componentes del citoesqueleto, observándose pequeños filamentos que conectan ambas macromoléculas, correspondientes a las MAPs estudiadas

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.

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