Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-02-21T14:50:31Z No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-02-21T15:18:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-21T15:18:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / As Células Mesangiais – CM participam do controle da filtração glomerular, da depuração de substâncias e produção da matriz extracelular. A proliferação das CMs e aumento de matriz estão associados à fisiopatogenia das glomerulopatias. Sabe-se que o Fator de Necrose Tumoral – TNF-α induz proliferação mesangial e que as Tiazolidinedionas – TZDs, agonistas dos Receptores Proliferadores Peroxisomais Ativados gama – PPARγ, utilizados no tratamento da diabetes mellitus, melhoram a resistência à insulina e são eficazes na prevenção da progressão de doença renal em diferentes modelos experimentais. Esta proteção parece ser secundária ao efeito anti-inflamatório das TZDs. Infelizmente, estes ligantes também apresentam efeitos colaterais indesejáveis, tais como ganho de peso, edema e cardiotoxicidade. Recentemente, foi desenvolvido um novo agonista parcial de PPARγ, o GQ-16 que apresenta atividade anti-diabética semelhante a outras TZDs, mas sem induzir ganho de peso ou edema. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo investigar se o GQ-16 diminui a proliferação mesangial induzida por TNF-α. Nossos resultados mostram que o GQ-16 reduz significativamente a proliferação celular induzida pelo TNF-α, em um padrão de curva dose resposta, semelhante à rosiglitazona e pioglitazona, além de reduzir a atividade transcricional do promotor do TNF-α, também em um padrão de curva dose resposta. Foi avaliado o efeito anti-fibrótico, pela expressão de mRNA de TGF-β e, embora nossos resultados não tenham apresentado significância estatística, foram similares à rosiglitazona. Concluímos que o GQ-16 é um modulador seletivo de PPARγ e apresenta um efeito antiproliferativo, antiinflamatório e, possivelmente, antifibrótico semelhante à rosiglitazona. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Mesangial cells – MC participate in the control of glomerular filtration, clearance of substances and extracellular matrix production. The proliferation of MCs and increased extracellular matrix are associated with the pathogenesis of glomerulopathies. It is known that the tumor necrosis factor – TNF-α induces mesangial proliferation and thiazolidinediones – TZDs, agonists of peroxisomal proliferator activated receptor gamma – PPARγ used in the treatment of diabetes mellitus, improve insulin resistance and are effective in preventing the progression of renal disease in different experimental models. This protection seems to be secondary to the anti-inflammatory effect of thiazolidinediones. Unfortunately, these ligands also have undesirable side effects such as weight gain, edema and cardiotoxicity. Recently, it was developed a new PPARγ partial agonist, the GQ-16, which has similar anti-diabetic activity to other thiazolidinediones, but without inducing weight gain or edema. Thus, this study aims to investigate whether the GQ-16 decreases mesangial proliferation induced by TNF-α. Our results show that the GQ-16 significantly reduces cell proliferation induced by TNF-α in a standard dose response curve, similar to rosiglitazone and pioglitazone, in addition to reducing the transcriptional activity of the promoter of TNF-α, also in a standard dose response curve. We evaluated the anti-fibrotic effect through the mRNA expression of TGF-β and although our results do not have statistical significance, were similar to rosiglitazone. We conclude that GQ-16 is a selective modulator of PPARγ and presents an antiproliferative, antiinflammatory and possibly antifibrotic effect similar to rosiglitazone.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-12-04T15:20:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4529139 bytes, checksum: 19b46c84a5c4c3b6aaf29763184e718b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T15:20:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4529139 bytes, checksum: 19b46c84a5c4c3b6aaf29763184e718b (MD5) Previous issue date: 2015-09-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dentre as moléculas utilizadas pelos tripanosomatídeos para invadir a célula hospedeira estão as E-NTPDases, que são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados nos seus produtos monofosfatados. As propostas do presente trabalho foram avaliar a atividade ectonucleotidásica e a localização celular da NTPDase-1 nas cepas Berenice-62, Colombiana e nos clones CL-Brener e CL-14 de T. cruzi e das NTPDases em L. tarentolae, bem como a capacidade dessas enzimas em participar do processo de adesão. Além disto, avaliar o efeito da fase de crescimento, meio de cultura e choque térmico sobre a atividade e localização NTPDase-1 na cepa Colombiana. Os resultados deste trabalho mostraram de forma geral as atividades na fase logarítimica maiores que na fase estacionária. A NTPDase-1 participa da adesão dos parasitos da cepa Y. Pelas análises ultraestruturais da localização subcelular da NTPDase-1 foi possível observar marcações distribuídas em diversas regiões da célula. Quando se analisou a influência do meio de cultivo e choque térmico na atividade ectonucleotidásica de T. cruzi observou-se maior hidrólise dos nucleotídeos em meio Grace’s 20% SFB sem choque térmico, na fase exponencial. O choque térmico em meio LIT mostrou-se mais eficaz quando comparado à temperatura de 28°C e ao meio Grace’s 20% SFB. A inibição por suramina mostrou um perfil bem variado. A NTPDase-1 da cepa Colombiana participa da adesão celular. Em L. tarentolae os resultados confirmaram por microscopia eletrônica e confocal a presença das NTPDases em diversas organelas e na superfície celular, e mostraram uma preferência pela hidrólise de ATP tanto em formas procíclicas como metacíclicas. As NTPDases foram também parcialmente inibidas na presença de suramina. Além de participarem da adesão celular de L. tarentolae em macrófagos. Este trabalho mostrou a importância das E-NTPdases em tripanosomatídeos mesmo em espécie não patogênica para humanos. / Among the molecules used by trypanosomatids to invade the host cell are the E- NTPDase, enzymes capable of hydrolyze nucleotides tri and/or difosfatados in its monofosfatados products. . For this reason, the actual work aimed to assess the ectonucleotidase activity and cellular localization of NTPDase-1 in both strains Berenice-62 and Colombian and in both clones CL-Brener and CL-14 of T. cruzi; besides, the ectonucleotidase activity and cellular localization of NTPDases in L. tarentolae, as well to investigate the role of these enzymes in the adhesion process. Furthermore, the effects of growth stage, growth medium and heat shock in the activity and localization of NTPDase-1 in the Colombian strain were also evaluated. The results have showed, in general, a higher activity in the logarithmic phase than in the stationary phase. The NTPDase-1 participates cellular adhesion of the parasites of the Y strain. Through ultrastructural analyses of subcellular localization of NTPDase-1 was possible to observe markings distributed on several regions of the cell. Besides, when analyzing the influence of growth medium and heat shock in ectonucleotidase activity of T.cruzi, the nucleotide hydrolyses increased in Grace’s medium 20% without heat shock and exponential phase. The heat shock seemed to be more effective in comparison to the 28°C heat shock in LIT medium. Inhibition by suramin displayed a well diverse profile. Thus, electronic and confocal microscopies confirmed the presence of NTPDases in diverse organelles as well in the cellular surface of Leishmania tarentolae, in addition to the preference for ATP hydrolyses in both procyclic and metacyclic forms of this parasite. Subsequently, the NTPDases were partially inhibited by suramin. Finally, was possible to confirm the involvement of NTPDases in macrophage adhesion process in L. tarentolae. These data suggest that E-NTPDases may be important proteins to the infection process of tripanosomatids including nonpathogenic species to humans.

Orientador: Patrícia Monteiro Seraphim / Banca: Rosa Maria Barilli Nogueira / Banca: Fábio Santos de Lira / Resumo: A literatura aponta que no diabetes mellitus, a expressão gênica de proteínas envolvidas no UPS (ubiquitine-proteasome system) encontra-se acima dos níveis basais, ocasionando degradação de proteínas miofibrilares. Sabe-se que a enzima de conjugação E214kDa e ubiquitina ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger-1) podem ser consideradas como biomarcadores de tal via. Os modelos de animais diabéticos apresentam maior expressão de NFkB (fator nuclear kappa B), o qual tem papel importante na regulação da transcrição do gene do GLUT4. O exercício físico configura-se como método terapêutico no tratamento do diabetes mellitus. A contração muscular melhora a captação de glicose na musculatura esquelética, translocando o GLUT4 via proteína cinase ativada por 5'-AMP (AMPK). Objetivo: Avaliar o efeito de seis semanas de treinamento de salto sobre conteúdo proteico de GLUT4, e expressão gênica (mRNA) dos genes Slc2a4 (proteína GLUT4), UBb (Ubiquitina), E214kDa, Trim63 (proteína MuRF1), NFkB p105 e Prkaa2 (proteína AMPKα2) no músculo gastrocnêmio de ratos diabéticos... / Abstract: The literature suggests that in diabetes mellitus, the gene expression of proteins involved in UPS (ubiquitine - proteasome system) lies above baseline levels, causing degradation of myofibrillar proteins. It is known that E214kDa conjugating enzyme and ubiquitin ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger -1) may be regarded as biomarkers of this pathway. The models of diabetic animals shows increased expression of NFkB (Nuclear Factor kappa B), which plays an important role in the regulation of GLUT4 gene transcription. Exercise appears as a therapeutic method in the treatment of diabetes mellitus. Muscle contraction improves glucose uptake in skeletal muscle GLUT4 translocating protein kinase pathway activated by 5' - AMP (AMPK). Objective: To evaluate the effect of six weeks of jumping on GLUT4 protein content of training, and gene expression (mRNA) of Slc2a4 (GLUT4 protein), UBB (Ubiquitin), E214kDa, Trim63 (MuRF1 protein) , NFkB p105 gene and Prkaa2 (AMPKα2) protein in the gastrocnemius muscle of diabetic rats... / Mestre

Ingeniero Civil en Biotecnología / Ingeniero Civil Químico / Debido a que el hígado posee funciones únicas, es de gran interés desarrollar herramientas que permitan conseguir un mejor entendimiento global del comportamiento de las células hepáticas bajo cambios de las condiciones de crecimiento causado por agentes externos, tales como cambios en la suplementación de la fuente de carbono o la utilización de drogas en el medio de cultivo. El objetivo de este de esta memoria es establecer una metodología que permita realizar estudios metabólicos en células de origen hepático, con herramientas in silico que complemente los trabajos de investigaciones in vitro. Para ello, se utilizará la línea celular HepG2, ya que presenta ventajas frente a otras células de origen hepático, como su alta capacidad proliferativa y su fenotipo estable. Junto a esto se diseñó un modelo hepático para describir el metabolismo intracelular, que considera 37 metabolitos y 32 reacciones, abarcando las principales vías metabólicas de una célula hepática. En un primer estudio experimental se analizó como afecta en el metabolismo de las células la aplicación de agente nocivo acetaminofén (APAP), y si el daño es contrarrestable utilizando N-acetilcisteína (NAC) como agente protector. Como resultado se obtuvo que la concentración utilizada de APAP en el medio (1 [mM]) es altamente tóxica ya que frena de inmediato el crecimiento celular, entrando a una fase de muerte celular. Del análisis de flujo metabólico aplicado a este caso se obtuvo que existe una alta tasa específica de producción de lactato, y por ende, los flujos son redireccionados para que aumenten los niveles de piruvato intracelular a partir de diversa fuentes de carbono además de la glucosa (triptófano y triglicéridos), y sea utilizado en la síntesis de lactato. Con respecto a la protección, sólo fue posible obtener una curva de crecimiento comparable al control cuando se utilizó NAC (5 [mM]) 3 horas después que se administrara APAP. La aplicación previa tuvo el mismo resultado que el caso en que sólo se utiliza APAP. El análisis de flujo metabólico del único caso en que hubo una protección efectiva está sujeto a errores de cálculos de tasas específicas, al igual que el caso control. Grandes desbalances de carbono y nitrógeno, junto con una distribución de flujos internos con comportamientos no esperados, no permiten comparar los resultados entre los casos. Sin embargo, este hecho refleja lo importante que es tener mediciones precisas y un buen diseño experimental para calcular las tasas específicas de consumo/producción, para así obtener un correcto funcionamiento del modelo hepático planteado. En el segundo estudio, se analizaron los cambios metabólicos que se generan al utilizar diferentes suplementaciones del carbohidrato en el medio. Los casos fueron una suplementación pura de glucosa, una pura de fructosa y una mezcla de ellas (en una razón 1:1). Al realizar las curvas de crecimiento, se obtuvieron parámetros de crecimiento similares, siendo el caso de fructosa pura en donde las células crecen a menor velocidad, dado que están acostumbradas a crecer en un medio con glucosa. Este hecho se ratifica al realizar el análisis de flujo metabólico, donde el caso de mayor consumo de hexosa, producción de lactato y síntesis de triglicéridos fue el caso en que se suplementó exclusivamente con glucosa. En los casos en que existía fructosa en el medio, las células presentaron una tasa menor de consumo de azúcar, y por consiguiente una menor producción de triglicéridos. Además en estos dos casos, los flujos hacia síntesis de lactato y síntesis de triglicéridos son más bajo, pero con un flujo permanente en el ciclo TCA cercano al doble que el caso de suplementación con glucosa pura. El modelo hepático fue capaz representar el metabolismo de la línea celular HepG2 en ambos estudios. Sin embargo, debido a los resultados del primero, es necesario realizar más ensayos de toxicidad de sustancias, para validar el modelo y la metodología empleada en este trabajo, con el fin de caracterizar y mejorar funciones hepáticas en sistemas de cultivo in vitro.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-18T12:31:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1236120 bytes, checksum: 961eee1ac0d9bc2a54b4d3caf9ea9317 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T12:31:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1236120 bytes, checksum: 961eee1ac0d9bc2a54b4d3caf9ea9317 (MD5) Previous issue date: 2005-08-02 / A importância relativa da sacarose na osmorregulação das células- guarda (CG) bem como o papel fisiológico da sintase da sacarose (SuSy) em folhas permanece pouco entendido. Neste trabalho, foram investigadas estas questões via análises dos efeitos da modulação da atividade sacarolítica em CG e, conjuntamente, com uma caracterização fenotípica dos efeitos da redução da expressão do gene da SuSy em plantas transgênicas. Análises de trocas gasosas e de parâmetros biométricos em plantas de batata (Solanum tuberosum L. Désirée) transgênicas antisenso da isoforma SuSy 3, sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S, e plantas com superexpressão do gene de invetase de levedura sob controle do promotor S1Δ4, específico de CG, foram investigadas. Por um lado, observou-se redução da condutância estomática (g s ) e uma ligeira redução na taxa da assimilação líquida de CO 2 (A) com a redução na atividade sacarolítica em CG (i.e., plantas SuSy 3 antisenso); o fenótipo oposto foi observado nas plantas transgênicas com aumento da atividade sacarolítica especificamente em CG (i.e., plantas com superexpressão da invertase). Os aumentos em A nas plantas com superexpressão da invertase pôde ser explicado como resultante de menores limitações estomáticas à fotossíntese, em relação aos das plantas-controle. Entretanto, as mudanças em A não foram relacionadas com alterações nas taxas máximas de assimilação do CO 2 derivadas de curvas A/C i daqueles genótipos. A redução moderada em A nas plantas SuSy 3 antisenso foi acompanhada por incrementos na área foliar e massa seca da parte aérea, o quê, provavelmente, poderia estar relacionada com a redução na densidade dos tubérculos. Ainda, plantas SuSy 3 antisenso apresentaram aumentos na atividade da sintase da sacarose-fosfato (SPS) e pirofosforilase da ADP-glicose (AGPase), e um decréscimo na atividade da SuSy e invertases ácidas, refletindo em aumentos nos teores de sacarose e amido nas folhas. Os aumentos nas atividades da SPS e da AGPase podem estar ligados à redução no teores de ortofosfato inorgânico. Não foram observads mudanças significativas na composição da parede celular do limbo foliar. Por outro lado, nas plantas com superexpressão da invertase, nenhuma das mudanças nas atividades enzimáticas e nos níveis de açúcares analisados foi observada. Ressalta-se um incremento nos teores do ácido 3-fosfoglicérico e hexoses-P. Analisando-se em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que mudanças em g s foram principalmente devido a mudanças no metabolismo de sacarose, exclusivamente em CG. Não se obteve evidências, neste trabalho, de que a SuSy 3 possa estar envolvida significativamente na síntese de parede celular nas folhas. / The relative importance of sucrose in guard-cell (GC) osmoregulation as well as the physiological role of sucrose synthase (SuSy) in leaves is still not understood. In this work, these questions were addressed by analyzing the effects of modulation of sucrolitic activities in GC, in addition to phenotypically characterizing the effects of its gene expression downregulation in transgenic plants. Detailed analysis of gas exchange and growth parameters of antisense potato plant (Solanum tuberosum L. cv. Désirée) for isoform 3 of SuSy (SuSy 3), under the control of 35S promoter, and sense potato plants expressing yeast invertase under the control of the S1Δ4, GC-specific promoter, were performed. Stomatal conductance (g s ) decreased to a greater extent than the net CO 2 assimilation rate (A) in transgenic plants with reduction in sucrolitic activity in GC (i.e., SuSy 3 antisense plants); an opposite phenotype was found in transgenic plants with increased sucrolitic activity exclusively in GC (i.e., sense invertase plants). The increase in A in sense invertase plants could be explained as a result of smaller stomatal restrictions to photosynthesis than in control plants. However, changes in A were not followed by changes in maximal net carbon assimilation rates, as obtained from A/C i curves. The moderate decrease in A in SuSy 3 antisense plants was accompanied by an increase in leaf both area and dry weight of leaves and stem, which probably could be linked to a reduction in total tuber density. Leaves from SuSy 3 antisense plants showed increases in sucrose-phosphate synthase (SPS) and ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase), and decreases in SuSy and acid invertases activities. The enzymatic changes led to increases in leaf sucrose and starch levels. The increase in SPS and AGPase activities could be linked to a reduction in inorganic orthophosphate content. There were no significant changes in both cellulose levels and cell-wall composition. None of these changes in plants expressing yeast invertase were found, but a significant increase in phosphoglyceric acid and hexoses-P contents was observed. Taken together, these results support the hypothesis that changes in g s is due mainly to changes in sucrose metabolism exclusively in GC; also, no evidence for an important role of SuSy 3 isoform in cell-wall synthesis in leaves could be herein found. / Dissertação importada do Alexandria

A estimulação vibrotátil tem sido utilizada para promover a comunicação alternativa em pessoas com deficiência visual e/ou auditiva. Por meio dela, ativam-se os receptores da pele que promovem a transdução do estímulo mecânico em uma resposta eletrofisiológica enviada ao SNC. O objetivo do presente trabalho é o de investigar a resposta à estimulação tátil por jato de CO2 como método de comunicação alternativa. Materiais e Métodos: desenvolveu-se um sistema de estimulação tátil por jato de CO2, no qual pressão e fluxo do gás são controlados e o gás é aplicado à pele por meio de uma agulha, cuja velocidade de deslocamento pode ser ajustada entre 20 e 100 mm/s. O instrumento atua como um plotter tátil. Foram realizados testes com 25 voluntários sem deficiências físicas e/ou cognitivas, nos quais avaliaram-se as respostas psicofísica e cognitiva e a taxa de reconhecimento correto de dezenove letras aplicadas na região abdominal, com intensidade estimulatória equivalente a três vezes o limiar de percepção. Resultados: o limiar de percepção da força encontrado foi de 60 mgf e a estimulação fluxotátil foi realizada utilizando-se a força de 180 mgf. Em testes cegos, a melhor taxa de reconhecimento correto das letras atingiu a média de 68 (±17) %, e ocorreu na velocidade de 40 mm/s e frequência de 1,33 Hz. As letras D, O, M e N apresentaram as menores taxas médias de reconhecimento, com 29%, 37%, 47% e 51%, respectivamente, devido à morfologia das mesmas gerar dúvida na diferenciação entre elas, enquanto as melhores taxas foram observadas sobre as letras I, U, J e B com 87%, 71%, 68% e 65%, respectivamente. Conclusões: o sistema desenvolvido possibilitou a execução dos testes e a coleta das informações, necessárias à realização da pesquisa. Os resultados mostraram que a resposta psicofísica à estimulação fluxotátil está relacionada à faixa de frequência de resposta dos discos de Merkel, com resposta máxima em 1,33 Hz, correspondente a velocidade de deslocamento da agulha de estimulação em 40 mm/s. A morfologia das letras e a velocidade de deslocamento da agulha de estimulação influenciaram nas taxas de reconhecimento das letras. / Vibrotactile stimulation has been used to promote alternative communication for people with visual and hearing impairments. The stimuli activate the receptors of the skin that promote the transduction of mechanical stimuli into an electrophysiological response sent to the CNS. Objective: to investigate the response to tactile stimulation by a CO2 jet as a method of alternative. Materials and Methods: a cutaneous stimulation system was developed which yields jets of CO2 on the subject’s skin at stimulating speeds varying from 20 up to 100 mm/s, by means of an injection needle. The instrument acts as a tactile plotter. Tests were conducted in twenty five volunteers without physical and/or cognitive disabilities in whose the psychophysical and cognitive responses were evaluated as well as the rate of correct recognition of nineteen characters applied to the abdominal region, with the stimulus intensity equivalent to three times the threshold of perception. Results: a force perception threshold of 60 mgf was found and the fluxtactile stimulation was performed using a force of 180 mgf. In blind tests, the best rate of correct character recognition had an average of 68 (± 17)%, and occurred at the speed of 40 mm/s and frequency of 1.33 Hz. The characters D, O, M and N have shown the lower average rate of recognition with 29%, 37%, 47% and 51%, respectively, due to the uncertainty generated by their similar morphology, whereas the best rates were observed for letters I, U, J, and B with 87%, 71%, 68% and 65%, respectively. Conclusions: the developed system enabled the experimental research and the acquisition of information necessary for carrying out the research. The results have shown that the psychophysical responses to fluxtactile stimuli are related to the frequency response of the Merkel discs, with maximal performance at 1.33 Hz, corresponding to the speed of the stimulation needle of 40 mm/s. The morphology of the graphical characters and the stimulation needle speed influenced the rates of letters recognition.

As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Completa.pdf: 5651353 bytes, checksum: 51c96a7210d03ea18a0c2bf0251eec36 (MD5) Previous issue date: 2009-06-01 / As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.