Memoria para optar al Título de Bioquímica / Las histonas son proteínas pequeñas con una alta carga positiva, capaces de interactuar con el ADN y ayudar en su compactación. Antes de poder ejercer esta función estas proteínas son sintetizadas en el citoplasma celular, en donde adquieren su correcto plegamiento y modificaciones post-traduccionales características por el paso secuencial a través de una serie de complejos proteicos. Pero no todas las proteínas recientemente sintetizadas adoptan su estructura nativa, y hasta un 30% de ellas son marcadas co-traduccionalmente para ser degradadas por el sistema ubiquitina-proteosoma. El objetivo de este trabajo fue dilucidar la función que cumple este mecanismo proteolítico enfrentado a una población de histonas H3 citosólicas mal plegadas. Para esto se trabajó con dos análogos aminoacídicos, AZC y Can, inductores del mal plegamiento, además de MG132, un inhibidor del proteosoma. Mediante técnicas de fraccionamiento subcelular se obtuvo el extracto citosólico y se demostró la acumulación de la histona H3 cuando se inhibe la subunidad 20S del proteosoma en paralelo a la inducción del mal plegamiento. Con estos resultados se concluyó que, al utilizar análogos de aminoácidos que inducen mal plegamiento proteico, las histonas recientemente sintetizadas se degradan por la vía ubiquitina-proteosoma. Trabajos a futuro debiesen enfocarse en investigar la potencial participación de otros mecanismos de degradación para esta proteína / Histones are small highly positive charged proteins, capable of interact with the DNA to assist in its compaction. Before being able to exert this function, these proteins are synthesized in the cellular cytoplasm and then sequentially associate with different protein complexes to acquire their correct conformation and to establish their characteristic post-translational modifications. But not all newly synthesized proteins succeed in acquiring their native structure, indeed, up to 30% of them are marked to be degraded by the ubiquitin-proteasome system. We focus our study on understand the participation of this proteolytic mechanism when faced to a population of cytosolic misfolded histone H3. To this end we worked with two amino acid analogues, AZC and Can, whose presence increases the amount of aberrant proteins, in addition to MG132, a proteasome inhibitor. By using subcellular fractionation techniques, the cytosolic extract was isolated and we demonstrated that the proteasomal 20S subunit inhibition, together with the induction of the misfold, leaded to a significant accumulation of the histone H3. With this, we established the participation of the ubiquitin-proteasome system in the degradation of the newly synthesized histone H3 in conditions of induced misfolding. Future work should investigate the potential participation of other degradation mechanisms for this protein / FONDECYT 1160480; Proyecto Basal PFB-16

Magíster en bioquímica, área de especialización en bioquímica de proteínas y biotecnología / Memoria de título de bioquímico / La autofagia es un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular frente a diferentes tipos de estrés. Este proceso degradativo consiste en el reclutamiento de proteínas, lípidos y organelos completos en vesículas de doble membrana para la posterior degradación lisosomal de su contenido. Una de las proteínas más importante en la regulación de la autofagia es Beclin-1/ATG6. En condiciones basales, Beclin-1 se encuentra unido a Bcl-2/Bcl-XL. La disociación de estas proteínas es indispensable para la activación de la autofagia. Tanto Beclin-1 como Bcl-2 son reguladas por modificaciones post-traduccionales que permiten su disociación. Dentro de estas modificaciones la poli-ubiquitinación en Lys63 de Beclin-1 promueve su disociación de Bcl-2 y la activación de la autofagia. Por otra parte, tanto la generación de estrés de retículo endoplasmático (RE) como la acumulación de agregados proteicos inducen autofagia. La respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) restablece el normal funcionamiento del RE mediante distintas vías de señalización como la vía de degradación de proteínas del RE (ERAD), la cual elimina las proteínas mal plegadas dentro del RE al ser retrotranslocarlas hacia el citoplasma y poli-ubiquitinarlas para su degradación proteosomal. La acción del ERAD ocurre a través de un complejo formado por diferentes proteínas, entre ellas Herp y la ubiquitina ligasa Hrd-1/Synoviolina. El sistema ubiquitina-proteosoma modifica post-traduccionalmente proteínas, uniéndolas covalentemente a una pequeña proteína denominada ubiquitina. La unión de varias subunidades de ubiquitina unidas por su Lys48 es conocida como poli-ubiquitinación en Lys48 y está generalmente asociada a la degradación proteosomal de la proteína marcada. Por otra parte, otros tipos de cadenas de poli-ubiquitina unidas por su Lys63 tendrían funciones de señalización. Herp es una proteína integral de membrana asociada al RE, la cual aumenta significativamente sus niveles en respuesta al estrés del RE y activarse la vía UPR. Herp posee un dominio análogo a ubiquitina (ULD), el cual lo vincularía al ERAD. El dominio ULD de Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación dependiente de Hrd-1 y de esta manera aumenta la degradación de sustratos específicos de esta enzima. Estudios recientes en nuestro laboratorio mostraron que Herp actúa como un regulador negativo de la autofagia y que los niveles de Beclin-1 aumentan significativamente en su ausencia. El objetivo de esta tesis fue establecer el mecanismo a través del cual Herp regula negativamente la autofagia. Con este fin se prepararon células HeLa “knock-down” (KD) para Herp mediante la expresión de un shRNA específico. También se utilizaron siRNA específicos para Herp con el fin de reducir los niveles de esta proteína en células HeLa “wild-type”. Los resultados obtenidos muestran que Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1. Ni la privación de glucosa ni la disminución de Hrd-1 mediante un siRNA específico produjeron diferencias en la poli-ubiquitinación de Beclin-1. La inhibición del proteosoma con MG132 indujo un aumento en la cantidad de Beclin-1 en células controles, mientras que las células Herp KD no presentaron diferencias con respecto al control, sugiriendo que la poli-ubiquitinación por Lys48 de Beclin-1 conduce a su degradación proteosomal. Sin embargo al activar la autofagia por privación de glucosa las células tratadas con el siRNA de Herp o siRNA de Herp y Hrd-1 en conjunto mostraron una tendencia al aumento en la autofagia, mientras que las células transfectadas con el siRNA de Hrd-1 mostraron una disminución de la activación de la autofagia. En conclusión los resultados solo comprueban parcialmente la hipótesis propuesta. Si bien se observó que Herp regula negativamente la autofagia mediante la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1 y su consiguiente degradación proteosomal, la ubiquitin ligasa Hrd-1 no sería la encargada de la poli-ubiquitinación en Lys48 dependiente de Herp. / Autophagy is a key physiological process for cell survival under different types of stress. This process consists in the recruitment of various cytoplasmatic components such as proteins, lipids and organelles into double-membrane vesicles which fuse with lysosomes enabling the degradation of its content. One of the most important regulatory proteins in autophagy is Beclin-1/ATG6. In basal conditions, Beclin-1 interacts with its repressor protein Bcl-2/Bcl-XL. The dissociation of these two proteins is indispensable for autophagy initiation and development. Both Beclin-1 and Bcl-2 are subjected to different post-translational modifications, which regulate their dissociation. Among these modifications, the Lys63 poly-ubiquitination of Beclin-1 promotes dissociation from Bcl-2 and autophagy activation. The generation of endoplasmic reticulum (ER) stress and the subsequent accumulation of misfolded proteins is a well known autophagy activating signal. In order to maintain homeostasis to the ER during stress, the unfolded protein response (UPR) is activated. The UPR accomplishes this task by a series of signaling pathways such as ER-associated protein degradation (ERAD), which degrades misfolded proteins inside the ER by retro-translocation of them to the cytoplasm and poly-ubiquitination for proteosomal degradation. ERAD is controlled by a series of proteins in the ER such as Herp and the ubiquitin-ligase Hrd-1/Synoviolin. The ubiquitin-proteasome system modifies proteins by the attachment of the small protein ubiquitin. Attaching several subunits of ubiquitin to each other by their Lys48 is called Lys48 poly-ubiquitination and is normally recognized as a signal for proteasome degradation. In the other hand, Lys63 poly-ubiquitination of proteins is related to other signaling process. Herp is an integral ER protein, whose levels are significantly increased during ER stress and UPR activation. Herp contains an ubiquitin-like domain (ULD) which has been associated with ERAD. Herp ULD domain controls Hrd-1 dependant poly-ubiquitination, increasing the poly-ubiquitination and proteasomal degradation of specific substrates of Hrd-1. Our recent studies have shown that Herp is a novel negative regulator of autophagy and Beclin-1 levels are up-regulated in the absence of Herp. The aim of the present work was to establish how Herp negatively regulates autophagy. To this end, Herp knock-down (KD) HeLa cells were prepared by expressing a specific shRNA. Specific siRNA were also used to silence Herp expression in HeLa wild-type cells. Our results show Herp positively regulates Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination. Both glucose deprivation and Hrd-1 siRNA treatment did not have any effect in Beclin-1 poly-ubiquitination. Proteasome inhibition with MG132 induces Beclin-1 levels in control cells, while Herp KD cells do not show any differences. These data suggest that Beclin-1 lysine-48 poly-ubiquitination leads to its proteasome degradation. Glucose deprivation showed an increase in autophagy activation cells treated with a Herp siRNA or Hrd-1 and Herp siRNA treated cells. However, Hrd-1 siRNA treatment alone showed impaired autophagy activation. In conclusion, our results only prove the hypothesis partially. The results suggest Herp negatively regulates autophagy through Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination and consequent proteasomal degradation, but the ubiquitin ligase Hrd-1 would not be responsible Herp mediated Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination. / Fondap

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Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 29/08/2016 / Inclui referências : f. 81-84 / Área de concentração: Patologia / Resumo: USP2a é uma importante enzima deubiquitinase (DUB) capaz de remover a ubiquitina de diferentes substratos, como da enzima FASN e do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR). Em tumores de próstata observa-se uma correlação positiva entre a expressão de USP2a e a tumorigênese, caracterizando-a como uma proteína oncogênica. Essa característica da DUB está principalmente relacionada com sua função estabilizadora da enzima FASN, responsável pela síntese de ácidos graxos na célula. A USP2a também resgata o EGFR da degradação, mantendo seus níveis celulares elevados. Sabe-se que o direcionamento de proteínas da membrana plasmática para a via do corpo multivesicular requer a ação dos complexos proteicos ESCRTs. Um deles, o ESCRT-0, possui duas subunidades: Hrs, responsável por direcionar o complexo aos endossomos precoces, e a subunidade STAM, capaz de interagir com diferentes DUBs. Sabe-se que a USP2a co-localiza com EEA1, um marcador de endossomos precoces, então decidiu-se analisar se a USP2a interage também com STAM, e identificar o sítio dessa interação. Para isso, linhagens celulares normais e tumorais de próstata foram modificadas para expressar permanentemente a forma selvagem e o mutante cataliticamente inativo de USP2a, e também foram silenciadas para a expressão de STAM. As sequências de STAM, de sua região SH3 e do mutante STAM SH3 foram clonadas, com o intuito de se obter plasmídeos de superexpressão para esses construtos. A primeira evidência de interação entre USP2a e STAM foi observada em ensaio de co-imunoprecipitação com células tumorais de próstata superexpressando USP2a, mas esse resultado ainda não foi totalmente confirmado. A região de STAM que pode contribuir para essa interação não foi identificada devido a baixos níveis de expressão dos construtos. Uma relação indireta entre USP2a e STAM foi observada, com o aumento da ubiquitinação de STAM com a superexpressão da forma selvagem da enzima em células de próstata, sem alterar os níveis celulares da proteína. Observou-se também que STAM é capaz de modular a reciclagem de EGFR em linhagens celulares de próstata, uma vez que seu silenciamento aumenta a taxa de degradação de EGFR. Analisou-se também o efeito fenotípico da deleção do gene fasn em camundongos com tumores de próstata induzidos pela perda de Pten. Verificou-se que a inibição genética de FASN reduz a incidência de formas agressivas de tumores de próstata nos animais. Os resultados obtidos sugerem que FASN, assim como USP2a, pode ser um importante alvo farmacológico para o tratamento de tumores de próstata. Palavras-chave: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN. / Abstract: USP2a is an important deubiquitinating enzyme (DUB) capable of removing ubiquitin from different substrate proteins, like FASN and epidermal growth factor receptor (EGFR). In prostate tumors there is a positive correlation between USP2a expression level and tumorigenesis, which makes it an oncogenic protein. This characteristic is mainly related with its ability to stabilize FASN, the enzyme that synthesizes fatty acids in cells. USP2a also rescues EGFR from lysosomal degradation, keeping its cellular levels raised. orting of plasma membrane proteins into multivesicular body pathway requires the ESCRTs complexes. One of these, the ESCRT-0, has two subunits: the subunit Hrs, that is responsible for targeting the complex to early endosome, and the subunit STAM, which interacts with different DUBs. -localizes with EEA1, a marker of early endosomes, so we decided to analyze if USP2a also interacts with STAM, whether this interaction is needed to taking USP2a to early endosome and identify the protein site required for this interaction. For this, normal and tumoral prostate cell lines were modified to permanently overexpress USP2a wild type and its catalytically inactive mutant, these cell lines also had the STAM expression knocked down. Molecular cloning of STAM, its SH3 region and a mutant lacking SH3, all tagged with GFP, were performed in order to obtain plasmids for overexpression of this constructs. The first sign of interaction between USP2a and STAM was observed with a co-immunoprecipitation assay in prostate tumoral cells overexpressing USP2a, but it was not fully confirmed. The region of STAM constructs. Indirect relationship between USP2a and STAM was observed, since overexpression of wild type USP2a is related with enhanced ubiquitination of STAM in prostate cell lines, even though the protein level remains the same. STAM is also capable of affect EGFR recycling in prostate cell lines, since STAM knocked down cells shown enhanced degradation of EGFR. It was also analyzed the effect of fasn gene deletion on Pten loss driven prostate tumors. The genetic ablation of FASN reduced the incidence of aggressive prostate tumors in mice, suggesting that FASN, as well as USP2a, could be an important pharmacological target for treatment of prostate cancer. Key words: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN.

Made available in DSpace on 2015-10-06T02:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475514-Texto+Completo-0.pdf: 1720487 bytes, checksum: d25e86525eb79aae71491a51f3662cf9 (MD5) Previous issue date: 2015 / The healthy neuronal function and synaptic modification need both the synthesis and degradation of proteins. Evidence indicates that the protein turnover mediated by proteasome activity is involved in synaptic plasticity and long term memory. However, their role in different stages of memory is still under discussion, and previous studies did not evaluate the possible need of protein degradation in recognition memory. In this work, we have shown that proteasome inhibitor, lactacystin, infused in the CA1 area of the hippocampus at two specific time periods during consolidation affect the retention of the recognition memory in mice. The administration of lactacystin did not affect the reconsolidation of memory. These findings provide the first evidence for the importance of proteasome activity in memory recognition, indicating that the protein breakdown in the hippocampus is required during two specific time windows in memory consolidation, contributing to a better understanding of protein turnover's role in memory formation. Changes of brain iron levels have been observed in neurodegenerative diseases. It has been demonstrated by our research group, that iron overload in the neonatal period results in severe and persistent memory deficits in adulthood. Protein degradation mediated by the ubiquitin proteasome system plays an important role in regulating various cellular processes and their involvement has been implicated in pathogenesis of neurodegenerative diseases. So in this study was also evaluated the effects of iron exposure in the neonatal period on the expression of proteasome subunits β1, β2, and β5 and polyubiquitinated proteins in brains of rats at 15 days of life and adulthood. Two types of hippocampal-dependent memory and recognition aversive were analyzed in adult animals. We confirm earlier evidence that iron administered in the neonatal period affect both the aversive memory and recognition memory. The levels of proteins polyubiquitinated found to be high in the hippocampus, but not in the cortex of adult animals treated with iron. The gene expression of the subunits β1 and β5 were affected by age in the hippocampus, which is higher in the early stages of development, accompanied by a related increase with age polyubiquitinated protein levels in adult rats. In the cortex, the gene expression of all three subunits of the proteasome was significantly higher in old adult than in neonatal age. Together, these results suggest that the expression of the subunits of the proteasome and are regulated activity of age-dependent manner. This was the first study to investigate the protein degradation system in the brain of rats newborns and also the first to study the proteasome subunits comparing neonatal and adult ages. Exposure to iron in the neonatal period produces long lasting harmful effects on the functioning of the ubiquitin-proteasome system, which may be related to deficiency of the iron induced memory, providing evidence that this system can be considered a target for the treatment of deficits memory. / A função neuronal saudável e a modificação sináptica precisam tanto da síntese quanto da degradação de proteínas. Evidências indicam que o turnover de proteínas mediado pela atividade do proteassoma está envolvido na plasticidade sináptica e na memória de longa duração. No entanto, seu papel nas diferentes fases da memória continua em discussão, e estudos anteriores não avaliaram a possível necessidade da degradação de proteínas na memória de reconhecimento. Nesse trabalho, nós mostramos que o inibidor de proteassoma, lactacistina, infundido na área de CA1 do hipocampo em dois períodos de tempo específicos durante a consolidação, prejudica a retenção da memória de reconhecimento em ratos. A administração da lactacistina não afetou a reconsolidação da memória. Estas descobertas fornecem a primeira evidência para a importância da atividade do proteassoma na memória de reconhecimento, indicando que a degradação de proteínas no hipocampo é necessária durante duas janelas de tempo específicas na consolidação da memória, contribuindo para a melhor compreensão do papel do turnover de proteína na formação da memória. Alterações dos níveis de ferro cerebral têm sido observadas em doenças neurodegenerativas. Já foi demonstrado pelo nosso grupo de pesquisa, que a sobrecarga de ferro no período neonatal resulta em graves e persistentes déficits de memória na vida adulta. A degradação das proteínas mediada pelo sistema ubiquitina-proteassoma desempenha um importante papel na regulação de vários processos celulares e seu comprometimento tem sido implicado na patogênese de doenças neurodegenerativas. Então, nesse estudo, também foram avaliados os efeitos da exposição de ferro no período neonatal sobre a expressão das subunidades do proteassoma β1, β2, e β5 e das proteínas poliubiquitinadas em cérebros de ratos aos 15 dias de vida e na idade adulta. Dois tipos de memória dependente do hipocampo, aversiva e de reconhecimento, foram analisados em animais adultos. Confirmamos as evidências anteriores, de que o ferro administrado no período neonatal prejudica tanto a memória aversiva quanto a memória de reconhecimento. Os níveis de proteínas poliubiquitinadas encontraram-se elevados no hipocampo, mas não no córtex, de animais adultos tratados com ferro.A expressão gênica das subunidades β1 e β5 foram afetadas pela idade no hipocampo, sendo maior nos primeiros estágios de desenvolvimento, acompanhado por um aumento relacionado com a idade nos níveis de proteína poliubiquitinada em ratos adultos. No córtex, a expressão gênica das três subunidades do proteassoma foi significativamente mais elevada na idade adulta do que na idade neonatal. Em conjunto, esses resultados sugerem que a expressão das subunidades e a atividade do proteassoma são regulados de forma dependente da idade. Este, foi o primeiro estudo a investigar o sistema de degradação de proteínas em cérebros de ratos neonatos e também, o primeiro a estudar as subunidades do proteassoma comparando as idades neonatal e adulta. A exposição ao ferro no período neonatal produz efeitos nocivos duradouros sobre o funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma, que pode estar relacionado com a deficiência de memória induzida pelo ferro, fornecendo evidências de que esse sistema pode ser considerado um alvo para o tratamento dos déficits de memória.

Orientador: Katia Cristina Kupper / Coorientador: Maurício Ventura Mazzi / Banca: Helia Harumi Sato / Banca: Tiago Santana Balbuena / Resumo: O setor citrícola enfrenta vários problemas com doenças que ocorrem na pós-colheita, como o bolor verde e a podridão azeda, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii, respectivamente. O surgimento de linhagens resistentes de P. digitatum e a falta de produtos registrados no Brasil para o controle da podridão azeda levam produtores e pesquisadores em busca de métodos alternativos de controle como o uso de leveduras, sendo o fator killer um dos possíveis mecanismos de ação desses microrganismos. Diante disso, esse trabalho teve por objetivo purificar a toxina killer produzida por Aureobasidium pullulans e testá-la no controle dos fitopatógenos P. digitatum e G. citri-aurantii. Inicialmente, foram testados diferentes métodos de precipitação proteica; em seguida, com a finalidade de conhecer a composição do extrato bruto proteico de A. pullulans foi determinada a atividade proteolítica e a presença de proteínas que agem sobre receptores da parede celular, β-1,3 glucanase e quitinase. A purificação da toxina foi realizada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de gel Sephadex G-75 em tampão formiato de amônio 0,05M, pH 6,0 e cromatografia em coluna de Cellulose (Medium Fibers) em tampão citrato 0,01M, pH 4,6. Posteriormente, a purificação foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida e realizada a detecção de atividade killer em meio sólido YEPD-azul de metileno tamponado com citrato-fosfato (0,1 M pH 4,6). A identificação da toxina foi r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus sector faces several problems with post-harvest diseases, such as green mold and sour rot, caused by Penicillium digitatum and Geotrichum citri-aurantii, respectively. The emergence of resistant P. digitatum strains and the lack of products registered in Brazil for the control of sour rot lead producers and researchers in search for alternative control methods such as the use of yeasts, being the killer factor one of the possible mechanisms of action of these microorganisms. Therefore, this work aimed at purifying the killer toxin produced by Aureobasidium pullulans and testing it in the control of P. digitatum and G. citri-aurantii phytopathogens. Initially, different methods of protein precipitation were tested; then, in order to know the composition of the protein precipitate from A. pullulans, the photeolytic activity and the presence of proteins acting on cell wall receptors, β-1,3 glucanase and chitinase were determined. Toxin purification occurred by Sephadex G-75 gel exclusion chromatography with ammonium formate elution buffer (0.05M, pH 6.0) and Cellulose chromatography (Medium Fibers) and citrate elution buffer (0.01M, pH 4.6). Subsequently, purification was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and the detection of killer activity was performed in solid YEPD-methylene blue buffered with citrate-phosphate (0.1 M pH 4.6). Toxin identification was performed by mass spectrometry (LC-MSE). Based on the results obtained, it was verified that the bes... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 12/12/2016 / Inclui referências : f. 65-70 / Resumo: A ubiquitinação está envolvida em vários processos no organismo, desde ciclo celular até vias de sinalização de apoptose. Por esse amplo envolvimento, é de extrema importância uma fina regulação que é realizada por enzimas chamadas deubiquitinases (DUBs) que hidrolisam ligações isopeptídicas. Dentre todas as DUBs, USP é a família mais extensa tendo como membro USP2 que possui duas isoformas fruto de processamento alternativo: USP2a (de 69kDa) e USP2b (de 45kDa) que se diferenciam apenas na região N-terminal. Alguns estudos relacionam essas isoformas com a via da p53, miogênese, tumores de próstata, agressividade de tumores de mama e manutenção dos níveis de Na+ e pressão sanguínea. Apesar desses estudos, a distribuição tecidual da USP2 ainda não está completamente estabelecida. A presença de duas isoformas distintas de processamento e a inexistência de anticorpos comerciais que possam distinguir entre as duas isoformas justifica a produção de reagentes confiáveis para o estudo de USP2. Desde modo, o objetivo foi produzir anticorpo monoclonal, isoforma específico, para USP2a e clonar, produzir proteína recombinante em bactérias e superexpressar USP2b em células eucariontes. USP2a foi produzida em E. coli BL21(DE3)STAR fusionada com etiqueta de histidina e purificada por coluna de Ni-NTA. A proteína purificada foi usada para imunizar camundongos balb/c. O soro policlonal desses animais foi testado por western blot para a presença de anticorpo anti-USP2a quanto ao reconhecimento da proteína endógena e superexpressa em linhagens de próstata LNCaP e RWPE-1 tendo dois animais positivos usados para a fusão com mieloma. Os hibridomas após a diluição limitante foram varridos por ELISA chegando-se a um clone 4GD2 que reconheceu USP2a superexpressa em HEK293T e não reconheceu USP2b superexpressa em HEK293T, indicando que obteve-se sucesso na produção de um anticorpo monoclonal isoforma específico para USP2a. Além disso, a isoforma USP2b foi clonada com sucesso nos vetores pET28a(+) e pcDNA3.1(-)6his. Esta isoforma não foi expressa em E. coli mesmo com várias mudanças no sistema, desde cepa bacteriana até temperatura, meio e tempo de expressão, mas foi superexpressa em HEK293T. As ferramentas produzidas serão de extrema importância para estudos de mapeamento tecidual, análise de cinética e busca de novos parceiros moleculares para essas isoformas. Palavras-chave: USP2, USP2a, USP2b, anticorpo monoclonal, proteína recombinante. / Abstract: Several physiological processes involve ubiquitylating modification, from cell cycle to apoptosis pathways. Because this involvement has a large range, it is extremely important that this post-translational modification be tightly regulated. Enzymes called deubiquitinases (DUBs) hydrolyze isopeptide bond and have a pivotal role in this regulation. Among all DUBs, the USP is the largest family. USP2, a member of this family, has two isoforms from alternative splicing: USP2a (69kDa) and USP2b (45kDa) and differences rely within their N-terminal regions. These isoforms have related to p53 pathway, myogenesis, prostate tumors, breast tumors aggressiveness and maintenance of Na+ levels and blood pressure. Despite these studies, the tissue distribution of USP2 is not completely established. Absences of commercial antibody that recognize specific isoforms justify the production of reliable reagents to study USP2. Thus, the aims of this study were (1) to express both USP2a and USP2b in heterologous bacterial system; (2) to overexpress USP2b in mammalian cells and (3) to produce monoclonal antibodies specific to USP2a isoform. USP2a was produced in E. coli BL21(DE3)STAR fused with polyhistidine tag and purified by Ni-NTA column. The purified protein was used to immunize Balb/c mice strain. We have tested the polyclonal serum of these animals by western blot to the presence of antibody anti-USP2a that recognize endogenous and overexpressed protein in prostate line LNCaP and RWPE-1. Two animals were positive and employed in fusion procedures. After hybridoma supernatant screenings for anti-USP2a presence by ELISA, we isolated the clone 4GD2, which was stable and still secreting antibodies after several freeze-thaw cycles. Monoclonal antibody 4GD2 recognizes USP2a overexpressed in HEK293T cells and does not cross-react with USP2b, suggesting that MoAb 4GD2 is highly specific. In addition, USP2b was successfully cloned in pET28a(+) and pcDNA3.1(-)6his vectors, both expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems, respectively. We were not able to express successfully USP2b in E. coli under different protocols (e.g. temperature, medium and time parameters changes), however we expressed His-tagged USP2b in HEK293T cells. The produced tools will be extremely important in further studies, such as tissue and temporal USP2 expression mapping, USP2 expression and disappearing kinetics in cell lines and characterization of new molecular partners for this DUB. Key words: USP2, USP2a, USP2b, monoclonal antibody and recombinant protein.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-05Bitstream added on 2015-01-26T13:30:54Z : No. of bitstreams: 1 000799339.pdf: 643539 bytes, checksum: 8e393b7ddf87588d52857005898757c9 (MD5) / A literatura aponta que no diabetes mellitus, a expressão gênica de proteínas envolvidas no UPS (ubiquitine-proteasome system) encontra-se acima dos níveis basais, ocasionando degradação de proteínas miofibrilares. Sabe-se que a enzima de conjugação E214kDa e ubiquitina ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger-1) podem ser consideradas como biomarcadores de tal via. Os modelos de animais diabéticos apresentam maior expressão de NFkB (fator nuclear kappa B), o qual tem papel importante na regulação da transcrição do gene do GLUT4. O exercício físico configura-se como método terapêutico no tratamento do diabetes mellitus. A contração muscular melhora a captação de glicose na musculatura esquelética, translocando o GLUT4 via proteína cinase ativada por 5´-AMP (AMPK). Objetivo: Avaliar o efeito de seis semanas de treinamento de salto sobre conteúdo proteico de GLUT4, e expressão gênica (mRNA) dos genes Slc2a4 (proteína GLUT4), UBb (Ubiquitina), E214kDa, Trim63 (proteína MuRF1), NFkB p105 e Prkaa2 (proteína AMPKα2) no músculo gastrocnêmio de ratos diabéticos... / The literature suggests that in diabetes mellitus, the gene expression of proteins involved in UPS (ubiquitine - proteasome system) lies above baseline levels, causing degradation of myofibrillar proteins. It is known that E214kDa conjugating enzyme and ubiquitin ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger -1) may be regarded as biomarkers of this pathway. The models of diabetic animals shows increased expression of NFkB (Nuclear Factor kappa B), which plays an important role in the regulation of GLUT4 gene transcription. Exercise appears as a therapeutic method in the treatment of diabetes mellitus. Muscle contraction improves glucose uptake in skeletal muscle GLUT4 translocating protein kinase pathway activated by 5' - AMP (AMPK). Objective: To evaluate the effect of six weeks of jumping on GLUT4 protein content of training, and gene expression (mRNA) of Slc2a4 (GLUT4 protein), UBB (Ubiquitin), E214kDa, Trim63 (MuRF1 protein) , NFkB p105 gene and Prkaa2 (AMPKα2) protein in the gastrocnemius muscle of diabetic rats...

Orientador: Patrícia Monteiro Seraphim / Banca: Rosa Maria Barilli Nogueira / Banca: Fábio Santos de Lira / Resumo: A literatura aponta que no diabetes mellitus, a expressão gênica de proteínas envolvidas no UPS (ubiquitine-proteasome system) encontra-se acima dos níveis basais, ocasionando degradação de proteínas miofibrilares. Sabe-se que a enzima de conjugação E214kDa e ubiquitina ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger-1) podem ser consideradas como biomarcadores de tal via. Os modelos de animais diabéticos apresentam maior expressão de NFkB (fator nuclear kappa B), o qual tem papel importante na regulação da transcrição do gene do GLUT4. O exercício físico configura-se como método terapêutico no tratamento do diabetes mellitus. A contração muscular melhora a captação de glicose na musculatura esquelética, translocando o GLUT4 via proteína cinase ativada por 5'-AMP (AMPK). Objetivo: Avaliar o efeito de seis semanas de treinamento de salto sobre conteúdo proteico de GLUT4, e expressão gênica (mRNA) dos genes Slc2a4 (proteína GLUT4), UBb (Ubiquitina), E214kDa, Trim63 (proteína MuRF1), NFkB p105 e Prkaa2 (proteína AMPKα2) no músculo gastrocnêmio de ratos diabéticos... / Abstract: The literature suggests that in diabetes mellitus, the gene expression of proteins involved in UPS (ubiquitine - proteasome system) lies above baseline levels, causing degradation of myofibrillar proteins. It is known that E214kDa conjugating enzyme and ubiquitin ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger -1) may be regarded as biomarkers of this pathway. The models of diabetic animals shows increased expression of NFkB (Nuclear Factor kappa B), which plays an important role in the regulation of GLUT4 gene transcription. Exercise appears as a therapeutic method in the treatment of diabetes mellitus. Muscle contraction improves glucose uptake in skeletal muscle GLUT4 translocating protein kinase pathway activated by 5' - AMP (AMPK). Objective: To evaluate the effect of six weeks of jumping on GLUT4 protein content of training, and gene expression (mRNA) of Slc2a4 (GLUT4 protein), UBB (Ubiquitin), E214kDa, Trim63 (MuRF1 protein) , NFkB p105 gene and Prkaa2 (AMPKα2) protein in the gastrocnemius muscle of diabetic rats... / Mestre

Orientadores: Lício Augusto Velloso, Marciane Milanski Ferreira / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_LeticiaMartinsIgnaciode_D.pdf: 4083691 bytes, checksum: 4627dc93519577a00d2747b36d1a406f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Dentre os fatores ambientais que contribuem para o desenvolvimento de obesidade, o consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados desempenha o papel mais importante. Estudos recentes realizados por vários grupos, inclusive o nosso, revelam que ácidos graxos saturados presentes na dieta levam ao desenvolvimento de resistência hipotalâmica à ação dos hormônios leptina e insulina, fenômeno este fundamental para que ocorra a quebra no equilíbrio entre ingestão e gasto calórico. Até o momento caracterizaram-se dois mecanismos moleculares potencialmente envolvidos na iniciação do processo que resulta na disfunção hipotalâmica na obesidade, a ativação de TLR4 e a indução de estresse de retículo endoplasmático, ambos levando a uma resposta inflamatória local e, eventualmente, a apoptose neuronal. Estudos recentes têm revelado que frente a situações que oferecem risco de dano celular, ativa-se um mecanismo de controle de tráfico e degradação protéica chamado sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). O acúmulo de agregados protéicos positivos para ubiquitina pode gerar toxicidade celular e regular a plasticidade neuronal. Também a modulação de componentes do UPS pode gerar neurodegeneração hipotalâmica e fenótipo obeso em animais experimentais. Neste estudo aventamos a hipótese que durante períodos prolongados de obesidade a ativação anômala do UPS contribuiria para a perpetuação do quadro de obesidade. De fato, os resultados obtidos revelam que roedores com predisposição para a obesidade induzida por dieta mantém, a princípio, a capacidade de regular adequadamente a UPS no hipotálamo. Com o passar do tempo esta capacidade é perdida resultando numa maior dificuldade para perda de peso frente à redução do aporte calórico. Roedores com mutações que os protegem da inflamação, não apresentam distúrbio funcional do UPS quando expostos a dieta rica em ácidos graxos e, são também protegidos da obesidade. Portanto, o defeito funcional do UPS no hipotálamo no curso de obesidade prolongada, constitui-se num fator importante contribuindo para a refratariedade ao tratamento e perpetuação da doença / Abstract: The consumption of high-fat diets, especially those rich in saturated fatty acids, plays the most important role in the development of obesity. Recent studies by several groups, including ours, have shown that dietary long-chain saturated fatty acids lead to the development of hypothalamic resistance to leptin and insulin, an important condition contributing for breaking of the balance between caloric intake and energy expenditure. Two molecular mechanisms are currently known to play a triggering role in this process; activation of TLR4 and endoplasmic reticulum stress, both leading to local inflammation and eventually apoptosis of neurons. The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays an important role in the control of protein recycling in the cell. The accumulation of ubiquitin-positive protein aggregates can cause cell toxicity and regulate neuronal plasticity. Also the modulation or differential activation of UPS can produce hypothalamic neurodegeneration and obese phenotype in experimental animals. Here, we hypothesized that under prolonged diet-induced obesity, a defect in the UPS in the hypothalamus could contribute for the defective control of energy homeostasis leading to the refractoriness of obesity to caloric restriction. In fact in an obesity-prone rodent strain, prolonged, but not short-term obesity was accompanied by functional abnormality of the UPS in the hypothalamus. In mutants protected from inflammation, resistance to diet-induced obesity was accompanied by stability of the UPS in the hypothalamus. Thus, defect of the UPS in the hypothalamus, during prolonged obesity is an important factor contributing the refractoriness of obesity to caloric restriction / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica