Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2018-06-15T13:14:24Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_VersaoFINAL_LuaniPiva_ATA.pdf: 4417876 bytes, checksum: 11d62a30d4befaaa00307256913971c0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-15T13:14:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_VersaoFINAL_LuaniPiva_ATA.pdf: 4417876 bytes, checksum: 11d62a30d4befaaa00307256913971c0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Despite the evident importance of the Amazon forest in regulating the global climate, through processes like photosynthesis and evapotranspiration, little is known about gases synthesized in the secondary metabolism and emited by trees of this ecosystem that are involved in these processes, such as the volatile terpenoids (e.g. monoterpenes and sesquiterpenes). In the present study, from a method of collecting volatile terpenoids in situ, with a low collection time and collected air volume, combined with thermal desorption analysis with gas chromatography coupled to mass spectrometry (TD GC-MS), the composition of volatile terpenoids in tree trunks belonging to 15 species of Protium (Burm. f.) genus was determined. A library of volatile terpenoids was created and sixteen (16) monoterpenes were found, in addition to six (6) sesquiterpenes. The monoterpenes α-pinene and D-limonene were the most abundant, appearing 63 and 58 times, respectively, in 69 samples. In addition, a new record of a monoterpene for tropical tree species, the ξ-fencheno, has been reported. An explanatory analysis of the distribution of volatile terpenoids by species was also performed, from which information on the richness of compounds in the genus Protium was obtained, as well as how each species could be characterized by the higher or lower frequency of compounds reported. Results of the present study provide a basis for the beginning of filling the knowledge gap on this subject, considering that to date no work on the characterization of volatile terpenoids in tropical tree species in the Brazilian Amazon has been found. In addition, these outcomes favor the understanding of the ecological and evolutionary interactions of resins, to ensure the sustainable commercial exploration of this material, as well as contribute to its ecological conservation. In addition, they may contribute to elucidate the functions of these compounds in the tropical forests dynamics (plant-plant interactions, plant-insect interactions) as well as the forest-atmosphere interactions. / Apesar da notória importância da Floresta Amazônica na regulação do clima do planeta, por meio de processos como a fotossíntese e evapotranspiração, pouco se conhece a respeito dos gases sintetizados e emitidos pelas árvores desse ecossistema, a partir do metabolismo secundário, envolvidos nesses processos, como é o caso dos terpenóides voláteis (e.g. monoterpenos e sesquiterpenos). No presente estudo, a partir de um método de coleta de terpenóides voláteis in situ, com baixo tempo de coleta e volume de ar coletado, aliado à análise por dessorção térmica com cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (TD GC- MS, na sigla em inglês), foi possível determinar a composição de terpenóides voláteis em troncos de árvores resinosas pertencentes a 15 espécies do gênero Protium (Burm. f.). Uma biblioteca de terpenóides voláteis foi criada, sendo que 16 monoterpenos foram encontrados, além de 6 sesquiterpenos. Os monoterpenos α-pineno e D-limoneno foram os mais abundantes, sendo relatados 63 e 58 vezes, respectivamente, num total de 69 amostras. Ademais, um novo registro de monoterpeno para espécie arbórea tropical, o ξ-fencheno, foi relatado. Uma análise explanatória da distribuição de terpenóides voláteis por espécie também foi realizada, a partir da qual obteve-se informações sobre a riqueza de compostos no gênero Protium, além de como cada espécie pôde ser caracterizada pela maior ou menor frequência de compostos relatada. Os resultados do presente estudo fornecem uma base para o início do preenchimento de uma lacuna de conhecimento acerca dessa temática, tendo em vista que, até o momento não foram encontrados trabalhos sobre a caracterização de terpenóides voláteis em espécies arbóreas tropicais na Amazônia brasileira. Além disso, favorecem o entendimento sobre as interações ecológicas e evolutivas das resinas, visando assegurar a exploração comercial sustentável desse material, bem como contribuir para sua conservação ecológica. Ainda, podem contribuir para a obtenção de maiores esclarecimentos sobre as funções desses compostos na dinâmica das florestas tropicais (interações planta-planta; interações planta-inseto), bem como nas interações floresta-atmosfera.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.

O desenvolvimento de antimaláricos é necessario pois, há linhagens de Plasmodium resistentes às drogas em uso e um alvo importante é a via de isoprenoides. Importantes alvos derivados desta via são: heme O já que, há antimaláricos relacionados ao heme; e a giberilina pois, há inibidores desta que não são prejudiciais ao homem. Inabenfide (INA) e uniconazol-P (UNP) inibem a biossíntese de giberilina em plantas e o crescimento de P. falciparum. Inicialmente, identificamos no parasita genes homólogos para a síntese de heme O e A, cox10 e 15, que codificam as enzimas HOS e HAS. Parasitas transgênicos com HOS e HAS marcados com GFP permitiram identificar a localização de cox10 no núcleo e de cox15 na mitocôndria. Identificamos heme O por marcações metabólicas e espectrometria de massa. Entretanto, não identificamos heme A e giberelina. INA e UNP diminuem a biossíntese de heme O e a parasitemia, observado por oxido-redução e marcação metabólica, o que torna a sintese de heme O um interessante alvo para antimaláricos. / The development of antimalarials is necessary because there are Plasmodium strains resistant to the drugs in use and an important target is the isoprenoid pathway. Targets derived from the isoprenoid pathway are: heme O as there are antimalarial drugs related to heme; And gibberillin, because there are inhibitors which are not harmful to man. Inabenfide (INA) and uniconazole-P (UNP) inhibit biosynthesis of gibberillin in plants and of growth the P. falciparum. Initially, we identified in P. falciparum genes homologous to cox10 and 15 encoding the enzymes (HOS and HAS) for synthesis of heme O and A. We created transgenic parasite lines which had HOS and HAS tagged to GFP. These revealed that the subcellular location of cox10 is in the nucleus and of cox15 in mitochondria. We identified heme O by metabolic labeling and mass spectrometry. However, no heme A or gibberellin was detected. INA and UNP decreased heme O biosynthesis and parasitemia as observed by oxido-reduction and metabolic labeling. Our data point to heme O as an important target for antimalarials.

Les pucerons sont considérés comme des ravageurs majeurs, dune part en raison de leur action directe sur le végétal, mais également en tant que vecteurs de nombreux virus phytopathogènes. A lheure actuelle, la lutte contre certaines espèces de pucerons, au moyen dinsecticides de synthèse, devient extrêmement difficile en raison de lapparition de populations résistantes. Le développement de nouveaux produits antiparasitaires, visant spécifiquement les pucerons, devient, par conséquent, hautement souhaitable. Dans ce contexte, nous avons choisi de nous intéresser aux enzymes de la famille des « short-chain » isoprényle diphosphate synthases (scIPPS). Ces enzymes constituent une classe de prényltransférases impliquées dans le métabolisme des isoprénoïdes. Cette classe comprend la géranyle diphosphate synthase, la farnésyle diphosphate synthase et la géranylgéranyle diphosphate synthase qui respectivement synthétise le géranyle diphosphate (GPP, C10), le farnésyle diphosphate (FPP, C15), et le géranylgéranyle diphosphate (GGPP, C20). Nous avons cloné chez le puceron un nouveau type de scIPPS. Contrairement à d'autres scIPPS connues, lenzyme recombinante du puceron affiche une activité bifonctionnelle ; cette dernière étant capable de synthétiser à la fois le GPP, le précurseur commun des monoterpènes, mais également le FPP, le précurseur des sesquiterpènes. Chez les pucerons, ces deux précurseurs sont supposés jouer un rôle clé dans la biosynthèse de l'hormone juvénile et des phéromones d'alarme et sexuelle. Dans le but de fournir une explication structurelle à la bifonctionnalité observée chez la GPP/FPP synthase de puceron, nous avons entrepris de résoudre sa structure tridimensionnelle en se basant sur les structures cristallographiques du poulet. Plusieurs mutants ont été ensuite conçus et caractérisés.

Orientador: Raquel Marques Braga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_ValeriaBittencourtde_D.pdf: 9598037 bytes, checksum: 83f061fb32519074a309e1975981ace5 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Nosso trabalho tem por objetivo o isolamento e a elucidação estrutural dos metabólitos secundários de Himatanthus obovatus (família Apocynaceae, sub-família Rauvolfioideae). Apenas cinco espécies de Himatanthus já foram estudadas do ponto de vista químico. O material de H. obovatus utilizado nesse trabalho foi coletado na Chapada dos Guimarães (MT) e em Casa Branca (SP). Utilizando diferentes metodologias de extração e tratamento dos extratos etanólicos brutos foram isoladas 5 lignanas: pinoresinol, isolariciresinol, hidroxipinoresinol, lariciresinol e olivil; 3 nor-isoprenóides: blumenol C, blumenol A e um nor-isoprenóide inédito; o iridóide plumieride, misturas dos terpenos: acetato de lupeol + acetato de a-amirina + acetato de b-amirina + germanicol e stigmasterol + b-sitosterol + campesteroI a, após a acetilação do extrato etanólico bruto, o glicitol inositol. Os extratos Diclorometânico (CDCb) e Etanólico (CECb) da casca de H. obovatus (Casa Branca (SP) foram submetidos aos testes com Artemia salina Leach. e de atividade antiproliferativa frente à 4 linhagens celulares derivadas de tumores humanos: leucemia (K562), pulmão (NCI460), melanoma (UACC62) e mama (MCF7). Os resultados dos dois testes foram bastante coerentes, já que ambos mostraram resultados promissores para o extrato CDCb. Os testes de bioautografia foram realizados com os extratos da casca de H. obovatus (Casa Branca): CHCb (heptano), CDCb (diclorometano) e CECb (etanol) e com as substâncias isoladas: pinoresinol, isolariciresinol, blumenol C, blumenol A, nor-isoprenóide inédito, hidroxipinoresinol, lariciresinol, plumieride e inositol, frente aos fungos: Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Candida albicans, Cladosporium cladosporioides, Fusarium oxysporium, Penicillium oxalicum, P. funicullosum e Rhizopus orizae. e frente às bactérias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhimurim, Staphilococcus aureus e Streptococcus mutans. Foram observadas atividades bactericida para as lignanas: isolariciresinol frente à bactéria S. mutans e lariciresinol frente à bactéria S. aureus. Os compostos isolados de H. obovatus permitiram comparar filogeneticamente este gênero aos gêneros Tabernaemontana e Rauvolfia (pertencentes às mesmas família e sub-família), estudados anteriormente em nosso grupo de pesquisas e ricos em alcalóides indólicos. / Abstract: Our objective is the isolation and identification of the compounds from Himatanthus obovatus (family Apocynaceae and sub-family Rauvolfioideae). Five species from genus Himatanthus have been chemically studied. H. obovatus was collected in Chapada dos Guimarães (MT state, Brazil) and in Casa Branca (SP State, Brazil). We used different methodologies for extraction and purification of the extracts, yielding 5 lignans: pinoresinol, isolariciresinol, hydroxypinoresinol, lariciresinol and olivil; 3 nor-isoprenoids: blumenol C, blumenol A and one unknown nor-isoprenoid; the iridoid plumieride, a mixture of terpenes: lupeol acetate + a-amirin acetate + b-amirin acetate + germanicol and stigmasterol + b-sitosterol + campesterol and, after acetylation of the crude ethanolic extract, the glycitol inositol. The diclorometanic (CDCb) and ethanolic (CECb) extracts trom the bark of H. obovatus (Casa Branca - SP) have been tested with Artemia salina Leach. and for antiproliferative activity against 4 carcinoma cell lines derived from human cancer: leukemia (K562), lung (NCI1460), melanoma (UACC62) and breast (MCF7). The good results with the CDCb extract in both tests suggest that this extract is a development candidate. The Bioautography tests were made with the heptanic (CHCb), diclorometanic (CDCb) and ethanolic (CECb) extracts from the bark of H. obovatus (Casa Branca - SP) and with the isolated substances: pinoresinol, isolariciresinel, blumenol C, blumenol A, the unknown nor-isoprenoid, hydroxypinoresinol, lariciresinol, plumieride and inositol against the fungi: Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Candida albicans, Cladosporium cladosporioides, Fusarium oxysporium, Penicillium oxalicum P. funicullosum and Rhizopus orizae and against the bacteria: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhimurim, Staphilococcus aureus and Streptococcus mutans. We observed bactericide activity at the lignans: isolariciresinol against the bacteria S. mutans and lariciresinol against the bacteria S. aureus. The coumpounds isolated from H. obovatus allowed us to phylogenetically compare this genus to the genera Tabernaemontana and Rauvolfia (belonging to the same family and sub-family), previously studied in our group and rich in indolic alkaloids. / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.

La comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la resistencia de la planta frente a patógenos biotrofos es un campo de investigación complejo y en expansión donde se impone la identificación de nuevos reguladores. Previamente se había descrito en nuestro laboratorio el gen P69C que codifica una proteasa con homología a subtilisinas y cuya expresión se induce en el transcurso de la interacción planta-patógeno. Con el fin de estudiar nuevos componentes de la planta implicados en la señalización de la respuesta defensiva, se procedió al escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana que de forma constitutiva y sin la existencia de ningún estímulo externo se encontrara activada la expresión del gen GUS dirigida por el promotor P69C. En la presente memoria de tesis se describe ampliamente la identificación y caracterización del mutante, csb3 (constitutive subtilisin3). Las plantas csb3 poseen elevados niveles de ácido salicílico (SA) y además expresan genes dependientes de la ruta de SA tales como PR-1, PR-2 y GST6. Por otra parte, el mutante csb3 exhibe una elevada resistencia al oomiceto patógeno Hyaloperonospora parasitica de naturaleza biotrofa y a la bacteria patógena también biotrofa Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 (Pst) DC3000. Sin embargo, la resistencia a patógenos necrotrofos tales como Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina permanece inalterada en las plantas csb3. Para analizar la participación de los distintos componentes de la ruta de señalización dependiente de SA en la manifestación del fenotipo de resistencia de csb3, se procedió al análisis epistático entre csb3 y pad4, sid2, eds5, nahG, npr1, dth9 y cpr1. Estos estudios indican que la elevada resistencia frente a patógenos biotrofos de las plantas csb3 requiere de todos y cada uno de los componentes de la ruta de señalización dependiente del SA estudiados. El gen CSB3 identificado por clonaje posicional codifica la 1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato (HDS) sin / Gil Morrió, MJ. (2005). Disección genética del mecanismo de resistencia frente a patógenos biotrofos mediado por el gen CSB3 en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1870 / Palancia