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Análise do perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26s em fases larvais e adultas do Schistosoma mansoni.

Dias, Leandro Simões January 2013 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-09-19T22:13:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:23:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5) Previous issue date: 2013 / Análises pós genômicas têm propiciado avanços significativos sobre a biologia do parasito Schistosoma mansoni. Particularmente, experimentos de transcrissômica em larga escala apontaram genes essenciais, ligados a vias de degradação proteica intracelular, com expressão diferencial ao longo do ciclo de vida do parasito. Tais achados corroboram com as marcantes alterações fenotípicas observadas após a penetração no hospedeiro vertebrado e o extenso remodelamento corporal necessário para a instalação e maturação do verme adulto no sistema porta-hepático.A presente investigação objetivou determinar o perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26S, em fases larvais e adultas do verme. Neste intuito, oligonucleotídeos específicos para amplificação parcial das subunidades Rpn10 e alfa 7 foram confeccionados. Após a extração de RNA total de vermes adultos seguido de RT-PCR, observou-se amplificação de produtos de aproximadamente 251 e 753 pb, de massas moleculares esperadas para os amplicons relacionados às subunidades Rpn10 e alfa 7, respectivamente. Os produtos de amplificação foram purificados do gel e clonados utilizando o sistema Gateway®. Novos ciclos de amplificação demonstraram a obtenção de plasmídeos recombinantes para as duas subunidades. Entretanto, experimentos de expressão heteróloga em bactérias BL21 não permitiram a detecção epurificação das subunidades alfa 7 e Rpn10 recombinantes no lisado celular. Como proposta alternativa, utilizou-se o plasmídeo PET28a® recombinante contendo a região codificadora da subunidade Rpn10 de S. mansoni, gentilmente cedido pela Dra. Enyara Rezende Morais (Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos - Universidade de São Paulo). Após transformação em BL21, seleção de clones recombinantes e indução com IPTG, análises por SDS-PAGE e coloração do gel por Coomassie revelaram a expressão de uma proteína recombinante de massa molecular em torno de 55 kDa. Uma preparação de Rpn10 em alto grau de homogeneidade foi obtida após purificação por afinidade em resina de níquel. Anticorpos policlonais anti-SmRpn10 recombinante foram gerados em camundongos Swiss e utilizados para avaliação do perfil de expressão de Rpn10 em extratos solúveis de cercárias, esquistossômulos (de 3h e 3 dias), vermes adultos, ovos e miracídios. A partir de eletroforese bidimensional, utilizando separação isoelétrica em gel de gradiente linear (pH 3-10) e Western blotting, foram detectadas 3 isoformas para Rpn10 em todos os estágios investigados. Essas apresentaram aumento de expressão no estágio de cercária, o qual foi novamente confirmado por Western blotting 1D comparando as fases analisadas. Este achado refere-se ao primeiro relato da existência de isoformas para a subunidade Rpn10 constituinte do proteassoma 26S e agrega diversidade ao perfil de subpopulações possíveis e alternativas deste complexo proteolítico em S. mansoni __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Post-genomic analyses have allowed significant advances towards understanding the biology of the human parasite Schistosoma mansoni. In particular, large scaletranscriptome experiments highlighted essential genes related to proteolytic pathways exhibiting differential expression profiles throughout the parasite´s life cycle. Such findings corroborate with the marked phenotypic alterations observed after penetration into the vertebrate host and the extensive body remodeling required for maturation of the adult stage in the hepatic portal system. The present investigation aimed to determine the expression profile of 26S proteasome constituent subunits in both larvae and adult stages. Specific oligonucleotides were first designed for amplification of the subunits Rpn10 and alpha 7. After RNA extraction from adult worms and RT-PCR, amplification products at the expected molecular size (~250 and 750 bp) related to Rpn10 and alpha 7 subunits, respectively, were obtained. The amplification products were purified from the agarose gel and cloned using the Gateway® system. New amplification cycles demonstrated the production of recombinant plasmids for the two subunits under investigation. However, heterologous expression in Escherichia coli (BL21 strain) did not allowed detection and,purification of the respective recombinant proteins from cell lysates. As an alternative, the PET28a® recombinant plasmid containing the full length Rpn10 subunit of S. mansoni was kindly provided by Dr. Enyara R. Morais (Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos – Universidade de São Paulo) and employed in this study. After transformation of BL21 E. coli cells, selection of recombinant clones and induction of expression using IPTG, SDS-PAGE analysis revealed the expression of a recombinant protein exhibiting molecular mass around 55 kDa. A homogenous fraction of His-tagged recombinant Rpn10 was obtained after its purification from the cell lysate using a nickel column. Polyclonal antibodies anti-Rpn10 were raised in Swiss mice and used for evaluation of the expression profile of this subunit in soluble extracts from cercariae, 3h schistosomula, adult worms, eggs and miracidia. A two dimensional gel approach (2-DE), using linear pH3-10 gradient for the first dimension, coupled to Western blotting revealed the existence of at least 3 isoforms for Rpn10 subunit in all investigated stages. Such isoforms exhibited upregulation in the cercariae, which was later confirmed by a comparative 1D Western blotting experiment. To our knowledge, this finding refers to the first report for the existence of Rpn10 isoforms and contributes adding further complexity to alternative possibilities of 26S proteasome assembly in S. mansoni.
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Clonagem e expressão da proteína 14-3-3ε1 de Echinococcus granulosus em Escherichia coli

Teichmann, Aline January 2010 (has links)
O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.
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Clonagem e caracterização parcial do cDNA de uma proteína de Boophilus microplus similar à coronina

Freitas, Daniela Reis Joaquim de January 2002 (has links)
O carrapato Boophilus microplus, um ectoparasita hematófago, está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo todo. Atualmente, seu controle é baseado no uso de pesticidas. Para auxiliar no desenvolvimento de novas vacinas para este parasita, é importante compreender melhor sua fisiologia. A coronina, uma proteína de citoesqueleto, pertence à Família das Proteínas G. Está localizada no córtex celular e apresenta várias funções, desde locomoção celular, fagocitose, macropinocitose a ligação de microtúbulos, orientação da polaridade de embriões, citocinese, polimerização dos filamentos de actina e regulação da organização do citoesqueleto. No presente trabalho, o cDNA de uma proteína semelhante a coronina foi isolado de uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares de partenóginas por triagem imunológica. A análise de seqüência mostrou que o clone SG5 possui identidade entre 15 e 17% com seqüências de proteínas semelhantes a coronina de outras espécies, como as de humanos e de camundongo, e possui um tamanho de 1.938 pb, com uma suposta ORF de 960 nucleotídeos. Na análise da expressão do gene, verificouse que o mRNA deste gene está presente em ovos e larvas de 15 dias e glândulas salivares, intestino e ovário de teleógina e partenógina; em corpo gorduroso sua presença não foi detectada. Um estudo mais detalhado do papel da proteína semelhante a coronina nas glândulas salivares de B. microplus pode auxiliar em uma melhor compreensão da fisiologia deste parasita.
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Clonagem, expressão e caracterização de duas lipoxigenases de Shewanella woodyi /

Hansen, Jhoanne. January 2013 (has links)
Orientadora: Maria Benincasa Vidotti / Co-orientadora: Angeles Manresa / Banca: Ana Claudia Barana / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: Mariana Carina Frigieri / Banca: Janete Apparecida Desiderio / Resumo: Lipoxigenases são enzimas que catalizam a oxido-redução de ácidos graxos poliinsaturados que contém em sua estrutura um ou mais grupos cis 1,4- pentadieno, produzindo hidroperóxidos através da incorporação de um oxigênio molecular. Durante anos a presença de lipoxigenase foi considerada exclusivamente eucariótica, presente em mamíferos, plantas, pequenos invertebrados marinhos e fungos. A função biológica dessas enzimas tem sido amplamente estudada. Porém, pouco tem sido descrito em organismos procariotos. O presente estudo teve por objetivos clonar e caracterizar bioquimicamente duas lipoxigenases de Shewanella woodyi ATCC 51908, caracterizar os produtos de reação destas enzimas e realizar um estudo filogenético e estrutural, comparando-as com lipoxigenases de eucariotos e procariotos. Parâmetros enzimáticos dessas enzimas foram descritos. A influência do pH e temperatura na atividade catalítica foram estudadas. Também foi determinado a preferência por substrato e o efeito da adição de vários íons divalentes que podem interferir na atividade catalítica. A enzima SWPrecLox de S. woodyi apresentou temperatura e pH ótimos de 31ºC e 8,0, respectivamente. Demonstrou afinidade por ácido linoleico, com uma Km de 0,47 mM e Vmax de 2,78 mmols min-1 mg-1. A enzima SWAracLOX teve ácido araquidônico como substrato preferente, com valores de Km 0,20 mM e Vmax 1,6 mmols min-1 mg-1. Atividade ótima foi alcançada com 27ºC e pH 7,0. A partir das estruturas moleculares das lipoxigenases de Plexaura homomalla e Pseudomonas aeruginosa, foram criados hipotéticos modelos estruturais de SWPrecLOX e SWAracLOX. / Abstract: Lipoxygenases are enzymes that catalyze the oxido-reduction of polyunsaturated fatty acids in their structure that contains one or more groups cis 1,4- pentadiene, producing hydroperoxides from the incorporation of molecular oxygen. For years, the presence of lipoxygenases was considered a eukaryotic feature, present in mammals, plants, small marine invertebrates and fungi. The present study aimed to clone and characterize biochemically two lipoxygenases from Shewanella woodyi ATCC 51908, characterize the reaction products of these enzymes and conduct a phylogenetic and structural analysis, comparing them with eukaryotes and prokaryotes lipoxygenases. The biological function of these lipoxygenases has been widely studied. However, only few have been described in prokaryotes. Enzymatic parameters of these enzymes have been described. The influence of the pH and the temperature on the catalytic activity has been studied. Also has been studied the substrate preference and the effect of the addition of several divalent cations that can enhance or eliminate the catalytic activity. The enzyme SWPrecLox of S. woodyi showed temperature and pH optimum were 31 ºC and 8,0, respectively. Demonstrated substrate affinity for linoleic acid, with Km 0,47 mM and Vmax 2,78 mmols min-1 mg-1. The enzyme SWAracLox has arachidonic acid as preferred substrate, with Km 0,20 mM and Vmax 1,6 mmols min-1 mg-1. Optimum activity was reached at 27 ºC and pH 7,0. From the molecular structures of lipoxygenase Plexaura homomalla and Pseudomonas aeruginosa, were created a hypothetical structural model of the SWPrecLox and SWAracLox. / Doutor
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Clonagem e caracterização funcional de anticorpo recombinante Anti-GP35/50 de Trypanosoma cruzi

Soares, Rodrigo Jahn January 2014 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da Rocha / Coorientadora : Profª. Drª. Larissa Magalhães Alvarenga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/05/2014 / Inclui referências : f. 71-82 / Resumo: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença parasitária que afeta em torno de 12 a 14 milhões de indivíduos, causando um importante impacto econômico. Uma vez que as formas de tratamento disponíveis apresentam eficiência questionáveis e sérios efeitos colaterais, a busca de formas alternativas à terapêutica atual se faz necessária. A melhoria na "entrega" de fármacos pode ser uma estratégia interessante para redução dos efeitos colaterais dos tratamentos utilizados. Além disso, os fármacos ideais são aqueles que interferem em mecanismos específicos do parasito, que são essenciais para sua sobrevivência no hospedeiro mamífero. Nesse sentido, foi demostrado previamente que as mucinas denominadas gp35/50 participam no processo de adesão e invasão celular possibilitando o estabelecimento da infecção, tornando-se candidatos interessantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no tratamento desta parasitose. Adicionalmente, anticorpos monoclonais anti-gp35/50 (mAb-10D8) são capazes de interferir com o mecanismo de virulência de formas tripomastigotas metacíclicas. Conciliando todas as características, decidimos obter anticorpo recombinante anti-gp35/50 (scFv-10D8) para fins terapêuticos, uma vez que estas moléculas são específicas e tem sido utilizadas com sucesso em outras patologias. Desta forma, a tecnologia de anticorpos recombinantes a partir RNA total de hibridoma (mAb-10D8) foi utilizada aqui para obtenção das regiões variáveis das cadeias leves e pesada de mAb-10D8 por RT-PCR utilizando iniciadores específicos. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e utilizados para síntese de um gene sintético de scFv (scFv-10D8) otimizado para expressão em E. coli. O gene de scFv-10D8 foi subclonado em vetor de expressão procariótico fusionado à cauda de histidinas (pET22b). Após otimização das condições de indução e enriquecimento de uma fração contendo scFv-10D8, foi demonstrado que a proteína recombinante é capaz de reconhecer as mesmas proteínas identificadas pelo mAb-10D8. Diante destes resultados, especula-se que esse anticorpo recombinante anti-gp35/50 de T. cruzi manterá as mesmas propriedades descritas para o mAb-10D8 e seu fragmento Fab na redução da virulência. Sendo assim, é provável que o scFv-10D8 poderá ser utilizado sozinho ou associado a outras moléculas tóxicas ao parasito. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, gp35/50, anticorpos recombinantes. / Abstract: Chagas disease is a parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects approximately 10 million individuals causing a major economic impact. Since the available therapeutic approaches have questionable effectiveness and serious side effects, the search for alternatives to the current therapeutic strategies is required. The improvement on drug delivery can reduce the side effects caused by the treatment. Moreover, the ideal drugs are the ones that interfere with specific mechanisms from the parasite that is essential for its survival in the mammalian host. Thus, it was previously shown that the mucins called gp35/50 are involved in cell adhesion and invasion processes enabling the establishment of infection and become interesting candidates for the development of new chemotherapeutic agents. Additionally, it was published that anti-gp35/50 monoclonal antibodies (mAb-10D8) are capable of interfering with the virulence mechanisms of trypomastigotes. Combining all the features we decided to obtain anti-gp35/50 recombinant antibody (scFv-10D8) for therapeutic purposes, since these molecules are specific and have been successfully used in other pathologies. Here, the technology of recombinant antibodies was used to obtain the regions encoding the variable light and heavy chains of mAb-10D8 by RT-PCR using specific primers and total RNA from hybridoma cells. The fragments were sequenced and used for the synthesis of a synthetic gene of scFv (scFv- 10D8) optimized for E. coli expression. The scFv-10D8 gene was subcloned fused to a histidine tag into a prokaryotic expression system (pET22b). After testing some induction conditions and enriching a fraction containing scFv-10D8, it was demonstrated that the recombinant antibody is able to recognize in the same fashion as mAb-10D8 the parasite protein. These results encourage us to speculate that this scFv anti-T.cruzi gp35/50 can be used in a new therapeutic strategy for Chagas disease, since it may retain the features previously described for mAb-10D8 and its Fab fragment. Thus, scFv-10D8 may be used alone or conjugated to a known drug against T. cruzi. Keywords: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, Recombinant antibodies, gp35/50
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Determinação da seqüência de cDNA da enzima hialuronidase do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera : vespidae) /

Silva, Giselly Pereira da. January 2007 (has links)
Orientador: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: José Chaud Netto / Banca: Patricia Pasquali Parise Maltempi / Banca: Lucia Elvira Alvares / Banca: Roberta Cornelio Ferreira Nocelli / Resumo: Hialuronidases pertencem a um grupo de enzimas hidrolíticas, as quais degradam o ácido hialurônico, um polissacarídeo de alta massa molecular, encontrado em todos os tecidos de mamíferos e fluídos corpóreos. O ácido hialurônico é um componente da matriz extracelular de vertebrados, que preenche os espaços entre células e fibras, e age como lubrificante, bem como uma barreira à penetração de partículas estranhas. Os níveis de ácido hialurônico são marcadamente aumentados durante a embriogênese, inflamação, transformação maligna e em qualquer lugar que seja requerido a rápida substituição de tecido e remodelamento. Os defeitos no metabolismo do ácido hialurônico parecem relacionar-se a várias doenças sugerindo que o seu nível seja altamente controlado. No entanto, surpreendentemente, o estudo de enzimas envolvidas na síntese e degradação do ácido hialurônico tem sido negligenciado. Em venenos de insetos Hymenoptera (abelhas, formigas e vespas), a hialuronidase é uma enzima comum e um dos mais importantes alérgenos, sendo também, o único em potencial, que pode promover reatividade-cruzada entre os venenos de abelhas e vespas, como também entre os de diferentes gêneros e espécies de vespídeos, levando à produção de reações alérgicas mediadas por IgE, umas das maiores causas de anafilaxia em pacientes alérgicos ao veneno. Neste trabalho, através da metodologia de RACE-PCR, foi determinada e caracterizada, a seqüência completa de cDNA do alérgeno - hialuronidase - do veneno da vespa urbana Polybia paulista, a qual, é bastante agressiva e abundante no Estado de São Paulo, sendo responsável por muitos acidentes de importância médica, devido ao seu veneno que, assim como em outros vespídeos, apresenta três conhecidos alérgenos - hialuronidase, fosfolipase e antígeno 5. O cDNA foi obtido a partir do mRNA extraído dos abdomens dos insetos e amplificado por iniciadores gene-específicos. ... / Abstract: Hyaluronidases are a group of hydrolytic enzymes which degrade Hyaluronic acid (HA), the most abundant glycocaminoglycan of vertebrate extracellular space. HA is a high molecular weight polysaccharide found in virtually all mammalian tissues and body fluids, where it fills the space between cells and fibers and acts as a lubrificant as well as a barrier to penetration by foreign particles. Hyaluronic acid levels are markedly increased during the embryogenesis, inflammation, malignant transformation and whenever fast tissue turnover and remodeling is required. Defects in HA metabolism appear to be related to various diseases suggesting that the level of HA must be tightly controlled. Surprisingly, the study of the enzymes involved in HA synthesis and degradation has been greatly neglected. In venoms of Hymenoptera insects (bees, ants and wasps), the hyaluronidase is a common enzyme and one of the most important allergen, being potentially the unique that are able to promote immunological cross-reactivity between venoms from bees and wasps, and also among vespid venoms from different genus and species, producing allergic reactions IgE-mediated, one of the main causes of anaphylaxis in venom-allergic patients. In this work, by the RACE-PCR methodology, the hyaluronidase cDNA complete sequence from the urban wasp Polybia paulista was determined and characterized. This wasp is very aggressive and abundant in the São Paulo state, being responsible for many accidents of medical importance due its venom, which contains, like other vespids, three well known allergens- hyaluronidase, phospholipase and antigen 5. The cDNA was obtained from mRNA extracted from insect abdomens and amplified by gene-specific primers. At first, two consecutive sequences of about 800 and 600 bp were obtained, purified, cloned and sequenced. After, the hyaluronidase cDNA complete sequence of 991pb was obtained, purified and directly sequenced The resulting data were analyzed . / Doutor
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Clonagem do cDNA da endoglicanase 2 de Humicola grisea var. thermoidea e sua expressão em Saccharomyces cerevisiae

Siqueira, Saulo José Linhares de 03 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-19T11:12:03Z No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-03-17T15:59:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-17T15:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) Previous issue date: 2006-03 / Humicola grisea var. thermoidea é um fungo termofílico que apresenta um sistema celulolítico com potencial para aplicação em processos de degradação de material lignocelulósico para produção de etanol. O crescente interesse nesse combustível e a abundância de materiais lignocelulósicos que podem ser usados como matéria-prima (como rejeitos agrícolas) fez aumentar o interesse no estudo de celulases. A expressão de celulases em S. cerevisiae é interessante pois esse microrganismo pode ser utilizado diretamente em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) para produção de etanol. Anteriormente os cDNA da cbh1.2 e bgl4 de H. grisea var. thermoidea foram expressos em levedura. Neste trabalho o cDNA do gene de egl2 desse fungo foi amplificado por RT-PCR e clonado no vetor de expressão pAAH5 de Saccharomyces cerevisiae. Este vetor foi utilizado para transformar a linhagem MFL de S. cerevisae com genótipo leu2-. A atividade enzimática dos transformantes foi detectada por ensaio com Congo Red em placas contendo carboximetilcelulose (CMC) como substrato. A endoglicanase 2 de H. grisea var. thermoidea foi expressa em S. cerevisiae sob controle do promotor ADH1 e a levedura produziu a enzima em sua forma ativa. A enzima EGL2 recombinante possui massa molecular de 55 kDa e sua atividade enzimática foi caracterizada. Essa enzima apresentou atividade ótima em pH 5,0 e em temperaturas entre 50 e 60° C. EGL2 manteve aproximadamente 80% de sua atividade após pré-incubação a 50 °C por 6 horas, mostrando-se estável nessa temperatura. A enzima apresentou atividade sobre papel de filtro e atividade significativa sobre celulose microcristalina. Esta enzima foi capaz de hidrolisar o substrato sintético MUC, indicando que a enzima tem atividade sobre pequenos celo-oligossacarídeos. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Humicola grisea var. thermoidea is a thermophilic fungus that produces high levels of cellulases which has high potential for use in lignocellulose degradation for ethanol production. With the increasing interest on this fuel and the amount of lignocellulosic wastes that can be used as raw material, new cellulases are characterized each day. Strains of S. cerevisiae expressing cellulases can be used in simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) for ethanol production. Previously, cbh1.2 and bgl4 cDNAs from H. grisea var. thermoidea was expressed in yeast. In this work, egl2 cDNA from this fungus was obtained by RT-PCR and inserted into a Saccharomyces cerevisiae expression vector. The resulting molecular construction was introduced into a leu2 S. cerevisiae strain. Enzymatic activity in the transformants were detected by the Congo red assay using carboxymethil cellulose (CMC) as substrate. Endoglucanase 2 from H. grisea var. thermoidea was expressed in S. cerevisiae under the control of ADH1 promoter and the enzyme was in its active form. Recombinant EGL2 presented a molecular mass of 55 kDa. This enzyme has an optimal pH of 5.0 and optimal temperatures between 50 and 60 °C. Recombinant EGL2 retained 80% of the initial activity after incubation at 50 °C up to 6 hours. The enzyme showed high activity toward filter paper and significantly activity toward microcrystalline cellulose. The activity toward the synthetic substrate MUC was observed, indicating that this enzyme can hydrolize small cellooligosaccharides.
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Clonagem e expressão do fator 1 humano induzível por hipóxia (HIF-1) na levedura Saccharomyces cerevisiae

Ferreira, Túlio César January 2006 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-24T21:07:45Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à mudanças na concentração de oxigênio e tem um papel importante nos processos fisiológicos e patológicos em humanos. Este fator de transcrição é expresso quando as células de mamíferos são submetidas à condições de hipóxia e ativa cerca de 70 genes alvos regulados por oxigênio. HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta por dois membros da família de proteínas contendo o domínio basic helix-loop-helix (bHLH)-PER-ARNT-SIM (PAS), HIF-1α (atua unicamente na resposta à hipóxia) e o HIF-1β (também conhecido como translocador nuclear do receptor de aril hidrocarbono, ARNT, que é constitutivamente expresso). A estabilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, hidroxilação, nitrosilação e acetilação. Sob normóxia, HIF-1α é constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado pela HIF prolil hidroxilase (HPH) levandoo a ser rapidamente marcado para a degradação mediada pelo proteasoma. A seqüência de eventos que leva a ativação do HIF-1α e os efeitos paradoxais do HIF- 1 (efeitos pro- e anti-apoptóticos) não são completamente entendidos. Também não estão claros como os mecanismos dependentes e independentes de oxigênio que contribuem para as modificações pós-traducionais do HIF-1α, translocação nuclear, heterodimerização com o ARNT, ligação ao DNA em regiões regulatórias cis de genes alvos e recrutamento de cofatores. Portanto, as proteínas que interagem com o HIF-1α e as modificações pós-traducionais precisam ser melhor entendidas. Células de leveduras compartilham vários aspectos de sua bioquímica com os organismos multicelulares tais como, respostas transcricionais e celulares e mecanismos de modificações pós-traducionais de proteínas. Além disso, elas são fáceis de manipular sob diferentes condições de laboratório. Este trabalho visou avaliar a viabilidade da expressão do HIF-1 na levedura Saccharomyces cerevisiae como um modelo alternativo de expressão. Em células de leveduras, HIF-1 não é alvo de degradação sob condições de normóxia, já que esse microorganismo não possui a via de degradação mediada pelo von Hippel Lindau (proteína supressora de tumor). Pretendemos usar esse modelo de expressão para estudar as modificações pós-traducionais do HIF-1α e sua interação com outras proteínas que possam afetar sua dimerização/co-ativação, sob diversas condições. Estabelecemos então uma linhagem de levedura que expressa o HIF-1α e o ARNT constitutivamente sob condições normais de oxigênio. Também mostramos que o HIF-1α recombinante humano foi capaz de formar o heterodímero com o ARNT e se ligar ao elemento responsivo a hipóxia (HRE) da eritropoietina humana. Além disso, nós descrevemos a presença desse motivo no genoma de levedura e mostramos que esse organismo pode conter motivos HRE funcionais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a central regulator in the response to changes in oxygen concentration and plays an important role in physiological and pathological processes in humans. This transcription factor is expressed when mammalian cells are subjected to hypoxia and activates transcription of over 70 oxygen-regulated target genes. HIF-1 is a heterodimeric protein composed of two members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-containing PER-ARNT-SIM (PAS) domain family, HIF-1α (unique to the hypoxia response) and HIF-1β (also known as the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT, which is constitutively expressed). HIF-1α stability and activity are regulated by post-translational modifications such as phosphorylation, hydroxylation, nitrosation and acetylation. Under normoxia, HIF-1α is constitutively expressed and subsequently hydroxylated by a HIF prolyl hydroxylase (HPH) causing it to be rapidly targeted for proteasomemediated degradation. The sequence of events that leads to the full activation of HIF- 1α and the paradoxical effects of HIF-1 (pro- and anti-apoptotic effects) are not completely understood. Neither is clear how oxygen-dependent nor oxygenindependent mechanisms contribute to the post-translational modifications of HIF-1α, nuclear translocation, heterodimerization with ARNT, DNA binding to the cisregulatory region of target genes and recruitment of cofactors. Therefore, HIF-1α interacting partners and the pos-translational modifications need to be better elucidated. Yeast cells share several aspects of its biochemistry with multicellular organism such as, transcriptional and cellular responses and mechanisms of protein post-transcriptional modifications. In addition they are easy to manipulate under different laboratory conditions. This work aimed to evaluate the viability of HIF-1 expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae as an alternative expression model. In yeast cells, HIF-1 may not be targeted to degradation under normoxic conditions, since this microorganism lacks the pathway mediated by the von Hippel Lindau-VHL (a tumor suppressor protein). We intend to used this expression model to study the post-translational modifications and its interaction with other proteins that may affect its dimerization/co-activation. We established a yeast strain overexpressing HIF-1α and ARNT in a constitutive manner under normal conditions of oxygen. We also showed that recombinant HIF-1α was able to form a heterodimer with ARNT and bind to human erythropoietin hypoxia responsive element (HRE) motif. Additionally, we described the presence of this motif in the yeast genome and showed that this organism may harbor HRE motifs.
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Clonagem e expressão da Oligopeptidase Bsímile, da X-Prolil dipeptidil aminopeptidase e da Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi

Almeida, Keyla Caroline de January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-04-01T20:30:22Z No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) Previous issue date: 2009 / Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização. / After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.
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Clonagem e expressão da proteína 14-3-3ε1 de Echinococcus granulosus em Escherichia coli

Teichmann, Aline January 2010 (has links)
O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

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