Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

Resumo: O presente trabalho refere-se ao desenvolvimento de duas metodologias: imobilização da proteína do core do vírus da Hepatite C (VHC) em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) como suporte sólido para ELISA e um imunossensor amperométrico para detecção de anticorpos anti-VHC. Para atingir este objetivo, o RNA-VHC extraído de amostras de soro (genótipo 1b) foi submetido à técnica de RT-PCR e posterior amplificação da seqüência de 408pb do core do VHC. Este produto foi clonado em vetor pET42a. O vetor recombinante foi introduzido em bactérias da linhagem BL21 (DES). Após o cultivo das colônias, a indução foi realizada em concentração final de 0,4mM de IPTG. As bactérias foram lisadas e as frações solúvel e insolúvel, analisadas em gel de poliacrilamida 15%, mostrando uma banda aparente de 44kDa, tamanho esperado da proteína recombinante fusionada a GST. A proteína recombinante do core foi purificada e confirmada por imunodetecção utilizando soro positivo para VHC e apresentou ausência de reatividade cruzada com amostras positivas para outras doenças infecciosas. Na primeira metodologia, a proteína do core foi imobilizada em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) preparada por sol-gel como suporte sólido em teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. As condições adequadas para o estabelecimento desta técnica envolveram 1,25ng da proteína/disco, conjugado com peroxidase na diluição 1:10000 e diluição do soro de 1:40. Este procedimento foi comparado ao ELISA convencional. O desenvolvimento desta matriz híbrida para imunodetecção mostrou bom desempenho, reprodutibilidade e simplicidade durante a síntese, sendo vantajoso para aplicação comercial. / Abstract: The present work reports the development of two methodologies: hepatitis C vírus core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process used as solid phase in ELISA and an amperometric immunosensor for detection of antibodies anti-VHC. Toward to achieve this aim, the HCV RNA from serum (genotype 1b) was submitted to RT-PCR techniqueand subsequent amplification of the HCV core 408pb. This product was cloned into pET42a vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21 (DES) cell line strain. Cell cultures were grown and induced with final concentration of 0,4mM of IPTG. After induction, the cell were harvest and the soluble and insoluble fractions were analyzed by polyacrilamide gel 15% showing a band with an approximate molecular weight of 44kDa, expected size for this GST-fused recombinant protein. The recombinant protein was purified and confirmed by immunological detection using HCV positive serum and showed absence of cross reactivity with positive samples for others infectious diseases. In the first methodology, the core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process was used as solid phase in ELISA for detection of antibodies anti-VHC antibody. 1,25ng protein per disc, a peroxidase conjugate diluition of 1:10000 and a serum dilution of 1:40 were adequate for the establishment of the procedure. This procedure performance of the siloxane-polypropyleneglycol discs as a matrix for immnunodetection, showed easy synthesis, good performance and reproducibility for commercial application. The second consisted on the immobilization of core protein into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process and deposited on the pencil graphite electrode surface by dip-coating process for development of an amperometric immunosensor. / Orientador: Paulo Inácio da Costa / Coorientador: Hideko Yamanaka / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Maria Valnice Boldrin / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Marília Almeida Antunes Rossini / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf: 353281 bytes, checksum: 6786716aa7970dd6c603e25cad2d5709 (MD5) / As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura... / The experiments performed were, the production of cDNA using anti-sense primers and purified RNA, amplification of the gene encoding the 25K protein of Cole latent virus (CoLV25K), purification of the amplified fragment, cloning in multiplication vector pGEM-T for cell transformation into competent Escherichia coli strain TOP 10, vector purification, enzymatic digestion using the enzymes Bam HI and Hind III, subcloning in expression vector pET28a, transformation into competent cells of E. coli strain BL21-RIL, sequencing of the gene cloned into the expression vector and protein expression at 37 o C. When expressed at 37 °C, the protein with a molecular mass of 25 kDa was detected in inclusion bodies. Thus, the protein was purified under denaturing conditions (using 8 M urea) and subjected to dialysis to stimulate refolding. After refolding, the protein was concentrated to approximately 3 mg / mL and the circular dichroism assay was performed to verify the content of secondary structure, and dynamic light scattering, to estimate the size distribution of particle populations which are present in solution. The data from the deconvolution of circular dichroism experiments indicate a percentage of 40-46% α-helix, 12-14% β-sheet, 15-22% turns and 24-28% of other structures, indicating a structured protein; and the data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable, monodispersive, but forms a large complex of particles which must be separated to before crystallization experiments. Other techniques were used to solubilize the expressed protein: lowering the temperature of expression to 18 °C, using the method... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Flávia Thomaz Verechia Pereira / Resumo: A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição entre os tecidos maternos e fetais, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre a mãe e o feto e pela síntese de hormônios fundamentais para a manutenção da gestação. Para o crescimento placentário e a nutrição fetal é necessário um delicado equilíbrio entre proliferação e morte das células placentárias. Essas células possuem propriedades específicas em relação a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas sendo fundamentais para o desenvolvimento adequado do concepto ao longo da prenhez e seu nascimento. Gestações de animais clonados frequentemente apresentam anormalidades como hidroâmnio, hidroalantoide, edema placentário, retenção de placenta e abortos. Neste estudo, foi avaliada a ocorrência de apoptose (morte celular) em placentônios provenientes de conceptos bovinos transgênicos clonados (n=5) e de gestações naturais (n=18), nos períodos de 60 e 90 dias de gestação, que tiveram seu desenvolvimento interrompido para remoção do útero gestante. As amostras de placentônio foram segmentadas e fixadas em solução aquosa de paraformoldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M e pH 7.4, para verificação da morfologia pela coloração HE e realização da técnica de imunoistoquímica. Os resultados obtidos foram comparados entre bovinos clonados transgênicos e de gestações naturais. Todos os grupos e idades gestacionais analisados apresentaram a mesma composição celular com epitélio uterino... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The placenta in mammals is a transitional organ formed by the justaposition between maternal and fetal tissues, it is responsible for physiological exchanges between mother and fetus and the synthesis of hormones essential for maintaining gestation. For the fetal placental growth and nutrition are requires a delicate balance between proliferation and death cells of the placenta. These cells have specific properties in relation to its metabolic functions, endocrine and angiogenic and it is critical to the proper development of the fetus throughout pregnancy and birth. Cloned animals often have abnormal pregnancies as hidroamnion, hidroalantois, placental edema, retained placenta and abortion. In this study, placentomes the occurrence of apoptosis (death cells) was avaluate from fetuses cloned transgenic cattle (n = 5) and natural pregnancies (n = 18) in periods of 60 and 90 days of gestation that had their intermited development to remove the pregnant uterus. Placentome samples were segmented and fixed in aqueous 4% paraformaldehyde in sodium phosphate buffer (PBS) pH 7.4 and 0.1M, to check the morphology of HE staining and the immunohistochemistry. The results were compared between transgenic cloned cattle and natural gestations. In all groups and gestational ages analyzed showed the same cellular composition with simple cubic uterine epithelium, it is noted the presence of trophoblast giant cells mononuclear and giant trophoblast cells binucleated migrated from fetal epithel... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vadim R. Viviani / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Banca: Mauricio Bacci Junior / Banca: Etelvino José Henriques Bechara / Banca: Cleide Costa / Resumo: A partir dos coleópteros luminescentes, mais de 20 luciferases já foram clonadas e seqüenciadas. Dessas, a maioria é de lampirídeos das regiões Neártica e Paleártica, quatro de elaterídeos jamaicanos e uma de um fengodídeo asiático. Apenas outras cinco são oriundas da América do Sul, o continente mais rico em espécies de coleópteros luminescentes e o provável berço evolutivo de Lampyridae, a família com maior número de coleópteros luminescentes. Espécies desta região apresentam a maior variedade de cores de bioluminescência. No presente trabalho clonamos e seqüenciamos luciferases dos gêneros Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. e Taximastinocerus sp., da família Phengodidae. Com base na análise filogenética dessas luciferases e outras já publicadas, concluímos que as luciferases das lanternas laterais e cefálicas são codificadas por genes parálogos, e propusemos um modelo para a evolução das cores da bioluminescência nessa família. Também determinamos o genoma mitocondrial de Pyrophorus divergens, membro da família Elateridae. A partir desse genoma e outros já publicados, analisamos a evolução da bioluminescência na superfamília Elateroidea sensu Lawrence e Newton (1995) e concluímos que essa pode ter surgido três vezes independentemente nesse grupo. / Abstract: From luminescent Coleopteran's, more than 20 luciferases have already been cloned and sequenced. Among them, most part is from lampyrids of Neartic and Paleartic regions, four are from Jamaican elaterids and one is from Asiatic phengodids. Just five are from South American species, the richest continent in luminescent Coleopteran's and, probably, the evolutionary cradle of Lampyridae. Species from this region display the greatest range of bioluminescence colors. At the present work, we cloned and sequenced luciferases from the genera Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. and Taximastinocerus sp., from Phengodidae family. Based on the phylogenetic analysis of these genes and other already published, we concluded that head and lateral lantern luciferases are coded by paralogous genes, and we also proposed a model for bioluminescence color evolution in this family. We also sequenced the mitochondrial genome of Pyrophorus divergens, an Elateridae member. Based on this genome and other already published, we analysed the evolutionary history of bioluminescence in Elateroidea superfamily sensu Lawrence e Newton (1995) and concluded that it could have appeared three times independently in this group. / Doutor

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:55:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000387905-Texto+Completo-0.pdf: 630912 bytes, checksum: 5c11a94965c50eee0f374f0f6d6200ff (MD5) Previous issue date: 2007 / This research approaches the matters of genetic manipulation, specially cloning and the General Diagnosis of Pre-Implementation of Embryos, considering the implications of such manipulation to the understanding of the human as such. In order to follow such a research, the perspectives of Hans Jonas, Jurgen Habermas, Michel Foucault, and Giorgio Agamben are to be considered, aiming towards a complementary reading of these authors that should indicate a limit to biomedical research. Such limit will be established from a anthropological point of view that holds in the differentiation between the biological taking of man as a bare living object, and the consideration of man as the specific phenomena that occurs in a caesura between a bare life and a politically relevant life. / O presente trabalho aborda a questão da manipulação genética, especialmente a clonagem e o Diagnóstico Geral de Pré-Implementação de Embriões a partir de suas implicações para a autocompreensão do ser humano. Para tanto, as perspectivas de Hans Jonas, Jurgen Habermas, Michel Foucault e Giorgio Agamben serão consideradas, propondo uma leitura complementar destes autores que indica para um limite da pesquisa biomédica. Tal limite será estabelecido a partir de uma perspectiva antropológica, que sustenta na diferenciação entre a tomada biológica do homem, enquanto mero vivente, e na consideração deste enquanto fenômeno específico que ocorre em uma cesura d a vida nua para uma vida politicamente relevante.

A formação de espiguetas multiflora é uma característica complexa devido à sua expressividade variável. Os mecanismos genéticos e moleculares que controlam o caráter espiguetas multiflora ainda não são completamente compreendidos em aveia. Os objetivos deste estudo foram: i) caracterizar duas populações de linhagens recombinantes de aveia para o caráter espiguetas multiflora; ii) determinar o número de genes que controla o caráter espiguetas multiflora em aveia e, iii) identificar, clonar, sequenciar e caracterizar sequências codificantes associadas a genes candidatos ao controle da formação de espiguetas multiflora em aveia. As populações de aveia “UFRGS 01B7114-1-3 x UFRGS 006013-1” e “URS Taura x UFRGS 017004-2” foram avaliadas para o caráter espiguetas multiflora, em duas épocas de semeadura, no ano de 2014. A formação de espiguetas normais, multiflora e mosaico, em cada um dos terços da panícula e na panícula inteira foi analisada. Pares de primers específicos para o gene AP2 foram desenvolvidos a partir do alinhamento de sequências homólogas de diferentes espécies de gramíneas Pares de primers para os genes Vrn1 e AGL6 também foram utilizados para amplificar e clonar sequências de aveia. A expressão das espiguetas multiflora ao longo da panícula foi alterada nas populações avaliadas em função da época de semeadura. A semeadura tardia aumentou a formação de espiguetas multiflora e reduziu o número de espiguetas mosaico, nas duas populações. A análise genética indicou a presença de um gene maior controlando o caráter espiguetas multiflora em aveia hexaploide. A análise molecular revelou a presença de duas variações alélicas dos genes Vrn1 e AP2 nos genótipos URS Taura e UFRGS 017004-2, indicando que o gene AP2 deve estar conservado em aveia. Uma sequência do gene AGL6 também foi isolada nestes genitores. A existência de polimorfismos moleculares nos genes Vrn1, AP2 e AGL6 pode ser determinante para a expressão do caráter espiguetas multiflora. Estudos complementares poderão confirmar a associação destes genes com a formação de espiguetas multiflora em aveia. / The formation of multiflorous spikelet is a complex character due to its variable expressivity. Genetic and molecular mechanisms that control the character multiflorous spikelet are not fully understood in oats. The objectives of this study were: i) to characterize two populations of recombinants oat lines to the character multiflorous spikelet; ii) to determine the number of genes controlling the character multiflorous spikelet in oats; and iii) to identify, clone, sequence and characterize coding sequences associated with candidate genes to control the formation of multiflorous spikelet in oats. The character multiflorous spikelet was evaluated in the oat populations “UFRGS 01B7114-1-3 x UFRGS 006013-1” and “URS Taura x UFRGS 017004-2”, in two sowing dates, in the year of 2014. The formation of normal, multiflorous and mosaic spikelets was analyzed in each third of the panicle and in the whole panicle. Specific primer pairs for the gene AP2 were developed from the alignment of homologous sequences from different grass species. Specific primer pairs for the genes Vrn1 and AGL6 were also utilized for amplifying and cloning oat sequences. The expression of multiflorous spikelets along the panicle was dependent on the sowing date in each evaluated population. The late sowing increased the formation of multiflorous spikelet and decreased the number of mosaic spikelets, in both populations. Genetic analysis indicated the presence of one major gene controlling the character multiflorous spikelet in hexaploid oat. Molecular analysis revealed the presence of two allelic variants of the genes Vrn1 and AP2 in the genotypes URS Taura and UFRGS 017004-2, indicating that AP2 might be conserved in oats. One sequence of the gene AGL6 was also isolated in these genotypes. The existence of molecular polymorphisms in the genes Vrn1, AP2 and AGL6 can be crucial for the expression of the character multiflorous spikelet. Further studies may confirm the association of these genes with the formation of multiflorous spikelets in oats.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T17:42:29Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) Previous issue date: 2009-08 / Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-01T14:07:26Z No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear, um padrão epigenético preexistente deve sofrer uma reprogramação correta para garantir o desenvolvimento embrionário. Contudo, essa reprogramação é ineficiente na clonagem, pois o carioplasto possui um padrão metilação do DNA diferente dos gametas. Acredita-se num aumento da eficiência da clonagem de mamíferos se os carioplastos utilizados possuírem um DNA hipometilado. Este é o primeiro estudo a utilizar a procaína como agente desmetilante no cultivo in vitro em linhagem celular de fibroblastos de bovinos. Os objetivos foram avaliar os efeitos da procaína no cultivo in vitro sobre a viabilidade celular, avaliar a integridade cromossômica e analisar o padrão de metilação no DNA para as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) dos genes imprinting IGF2 e XIST, por tratamento com bissulfito de sódio seguido de seqüenciamento, em linhagem celular de Bos taurus indicus. O cultivo celular com a procaína apresentou crescimento celular e a suplementação com 0,1 e 0,5 mM levou a um aumento no número de células viáveis em relação ao grupo controle e ao tratamento com 2,0 mM (P≤0,05). A quantidade de células totais foi menor apenas para o grupo com suplementação de 2,0 mM (P≤0,01). A citogenética não mostrou diferença entre os grupos. O padrão de metilação não foi diferente para as DMRs dos genes avaliados. Existe um efeito benéfico nas células que receberam os tratamentos com 0,1 mM ou 0,5 mM de procaína, por existir um aumento da quantidade de células viáveis sem apresentar anomalias cromossômicas. Há a possibilidade de ter ocorrido uma desmetilação global, que não foi detectada nas regiões analisadas. A suplementação do meio de cultivo com procaína aumentou a viabilidade de fibroblastos in vitro de bovinos, sem alterar a integridade cromossômica. Isso é importante, pois os próximos estudos poderão contribuir, por exemplo, com um aumento dos índices da transferência nuclear de célula somática, maior obtenção de mamíferos transgênicos e possivelmente de células-tronco a partir de células diferenciadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / After natural fertilization and cloning by nuclear transfer, an epigenetic pattern must be reprogrammed to guarantee viable embryo development. This is the first study to use procaine as a demethylation agent in in vitro culture of of cattle fibroblast cell line. The aim was to investigate the effects of procaine in fibroblast cell line, to evaluate the chromosome integrity and to analyze DNA methylation patterns for DMRs of IGF2 and XIST genes imprinting, by bisulphite tratament followed by sequencing, in Bos taurus indicus. The cell culture with procaine was viable and the supplementation with 0.1 and 0.5 mM led to an increase in the number of cells with intact membrane in comparison to control group and to the treatment with 2.0 mM (P ≤ 0.05). The amount of total cells was lower only for the group supplemented with 2.0 mM (P ≤ 0.01). Cytogenetics showed no difference between groups The methylation pattern was not different for the DMR genes evaluated. We notice a beneficial effect on cells that received treatments with 0.1 mM or 0.5 mM procaine, because there is an increase in number of viable cells which did not present chromosomal abnormalities. It may have occurred a global demethylation, which was not detected in the analyzed regions. Supplementation of medium culture with procaine increased the viability of in vitro culture of bovine fibroblasts, with no alteration in chromosomal integrity. The results obtained here may contribute to increase the levels of cloning and transgenic mammals and possibly stem cells from differentiated cells.