Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-06T16:49:28Z No. of bitstreams: 1 Carliane Rebeca Coelho da Silva.pdf: 651758 bytes, checksum: 506ff1f0f3de99e3225d876176740f3b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T16:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carliane Rebeca Coelho da Silva.pdf: 651758 bytes, checksum: 506ff1f0f3de99e3225d876176740f3b (MD5) Previous issue date: 2011-02-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The pests are big economic problems in the management of major crops. This is because, depending on the occurrence, the losses are considerable, incurring even the loss of the crop. The effective control is through chemical insecticides that raises between 20% and 40% production costs and causing several damages to man and environment. Due to the great difficulty of getting crops with effective resistance to insects by means of conventional techniques several research institutions have invested in the acquisition of resistance via transgenesis, to be safe, effective and economical. In 2007, the Biotechnology team of the Cotton Embrapa edited and inserted the Bt cry1Ia gene in cotton cultivar BRS 293 in order to make it resistant to some insects in particular the caterpillar Spodoptera frugiperda. In this work was performed a comprehensive molecular study and expression analysis in T0 cotton plants, resulting of the transformation work the BRS 293 in order to verify the integration and expression of the protein-coding in selected transgenes through toxicity bioassays against Spodoptera frugiperda and by ELISA and western blot. Among the events analyzed, only five named BRS 293 T0-34, BRS 293 T0-49, BRS 293 T0-56, BRS 293 T0-57 and BRS T0-66, showed mortality rate above 50%, highlighting BRS 293 T0-34 with 89%. This same event had the highest protein concentration, with values similar to the Bollgard I in three growth stage analyzed by ELISA. / As pragas agrícolas são um dos grandes problemas econômicos no manejo das grandes lavouras. Isso porque, dependendo da incidência, os prejuízos são consideráveis, incorrendo até mesmo na perda da lavoura. O controle mais efetivo se dá por meio de inseticidas químicos que oneram entre 20 e 40% o custo de produção, além de causar vários prejuízos ao homem e ao ambiente. Devido a grande dificuldade de se conseguir culturas agrícolas com resistência efetiva à insetos por meio das técnicas convencionais, várias instituições de pesquisa têm investido na aquisição de resistência via transgenia, por ser segura, efetiva e econômica. Em 2007, a equipe de biotecnologia da Embrapa Algodão editou e inseriu o gene cry1Ia de Bt em uma cultivar de algodão BRS 293 de modo a torná-la resistente a alguns insetos em especial a lagarta Spodoptera frugiperda. Neste trabalho foi realizado um amplo estudo molecular e de expressão em plantas T0 de algodão, resultantes dos trabalhos de transformação da cultivar BRS 293 de modo a constatar a integração e expressão da proteína codificante nos transgenes selecionados, por meio de bioensaios de toxicidade contra Spodoptera frugiperda e por imunodetecção via ELISA. Entre os eventos analisados, apenas cinco denominados de BRS 293 T0-34, BRS 293 T0-49, BRS 293 T0-56, BRS 293 T0-57 e BRS 293 T0-66 apresentaram taxa de mortalidade acima de 50%, destacando-se a BRS 293 T0-34 com taxa de 89%. Este mesmo evento apresentou a mais alta concentração da proteína, com valores similares a da Bollgard I em três fases fenológicas analisadas via ELISA.

Submitted by BRUNA DE OLIVEIRA VASCONCELOS null (bruna.olivasco@gmail.com) on 2016-04-19T22:29:05Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_bruna_de_oliveira_vasconcelos.pdf: 2275149 bytes, checksum: 4d00665f221aeffea15e3edda524b5d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-26T13:25:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vasconcelos_bo_me_dra.pdf: 2275149 bytes, checksum: 4d00665f221aeffea15e3edda524b5d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T13:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vasconcelos_bo_me_dra.pdf: 2275149 bytes, checksum: 4d00665f221aeffea15e3edda524b5d2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição entre os tecidos maternos e fetais, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre a mãe e o feto e pela síntese de hormônios fundamentais para a manutenção da gestação. Para o crescimento placentário e a nutrição fetal é necessário um delicado equilíbrio entre proliferação e morte das células placentárias. Essas células possuem propriedades específicas em relação a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas sendo fundamentais para o desenvolvimento adequado do concepto ao longo da prenhez e seu nascimento. Gestações de animais clonados frequentemente apresentam anormalidades como hidroâmnio, hidroalantoide, edema placentário, retenção de placenta e abortos. Neste estudo, foi avaliada a ocorrência de apoptose (morte celular) em placentônios provenientes de conceptos bovinos transgênicos clonados (n=5) e de gestações naturais (n=18), nos períodos de 60 e 90 dias de gestação, que tiveram seu desenvolvimento interrompido para remoção do útero gestante. As amostras de placentônio foram segmentadas e fixadas em solução aquosa de paraformoldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M e pH 7.4, para verificação da morfologia pela coloração HE e realização da técnica de imunoistoquímica. Os resultados obtidos foram comparados entre bovinos clonados transgênicos e de gestações naturais. Todos os grupos e idades gestacionais analisados apresentaram a mesma composição celular com epitélio uterino simples cúbico onde nota-se a presença de células trofoblásticas gigantes mononucleadas e células trofoblásticas gigantes binucleadas migradas do epitélio fetal, estroma endometrial bem desenvolvido, epitélio trofoblástico com células cuboides típicas de epitélio e quantidade acentuada de células trofoblásticas gigantes e gigantes binucleadas migrando para o epitélio materno e mesênquima. Em todos os grupos e períodos gestacionais, o epitélio materno apresentou maior marcação positiva para apoptose. Aos 60 dias a marcação positiva no epitélio uterino das gestações manipuladas foi menos evidente em relação às de gestações naturais, assim como aos 90 dias, que apresentou maior imunorreatividade em comparação aos 60 dias e dos animais de gestação natural sobre os manipulados. Na ultima idade gestacional foi possível observar reação em padrão de fileiras no epitélio uterino e para ambos os grupos não foram encontradas marcações nos tecidos fetais. Neste estudo foi demonstrado desequilíbrio nos padrões de apoptose nos conceptos bovinos clonados transgênicos, pois no início da gestação (60 dias) apresentaram menor atividade apoptóticas e aos 90 dias um aumento, podendo ser este fato um dos fatores que levam às anormalidades placentárias. Desse modo os resultados da verificação da apoptose, nas fases de gestação estudadas, e seu entendimento são importantes para a compreensão de possíveis falhas no desenvolvimento gestacional em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a produção de animais transgênicos e clonados. / The placenta in mammals is a transitional organ formed by the justaposition between maternal and fetal tissues, it is responsible for physiological exchanges between mother and fetus and the synthesis of hormones essential for maintaining gestation. For the fetal placental growth and nutrition are requires a delicate balance between proliferation and death cells of the placenta. These cells have specific properties in relation to its metabolic functions, endocrine and angiogenic and it is critical to the proper development of the fetus throughout pregnancy and birth. Cloned animals often have abnormal pregnancies as hidroamnion, hidroalantois, placental edema, retained placenta and abortion. In this study, placentomes the occurrence of apoptosis (death cells) was avaluate from fetuses cloned transgenic cattle (n = 5) and natural pregnancies (n = 18) in periods of 60 and 90 days of gestation that had their intermited development to remove the pregnant uterus. Placentome samples were segmented and fixed in aqueous 4% paraformaldehyde in sodium phosphate buffer (PBS) pH 7.4 and 0.1M, to check the morphology of HE staining and the immunohistochemistry. The results were compared between transgenic cloned cattle and natural gestations. In all groups and gestational ages analyzed showed the same cellular composition with simple cubic uterine epithelium, it is noted the presence of trophoblast giant cells mononuclear and giant trophoblast cells binucleated migrated from fetal epithelium, endometrial stroma well developed, trophoblastic epithelium with typical cuboid cell epithelium and severe amount of giants and giant binucleated trophoblastic cells migrating into maternal epithelium and mesenchyme. All groups and gestational periods, maternal epithelium showed higher positive staining for apoptosis. At 60 days the positive staining in the uterine epithelium is less evident manipulated pregnancies in relation to natural pregnancies as well as at 90 days, with the highest immunoreactivity when it is compared to 60 days and in the animals of natural pregnancy in ratio to manipulated animals. In the last gestational age was observed in response pattern rows in the uterine epithelium and both groups fetal side tags were not found either in or on the epithelium and mesenchyme. This study demonstrated an imbalance in apoptosis patterns in transgenic cloned cattle fetuses as early in pregnancy (60 days) showed less apoptotic activity and an increase at 90 days and may be this fact one of the factors leading to placental abnormalities. Thereby the results of the verification of apoptosis at the stages of pregnancy studied and comprehension are important for the understanding of possible failure in gestational development in advanced embryonic manipulation techniques, such as the production of transgenic and cloned animals.

Orientador: Flávia Thomaz Verechia Pereira / Resumo: A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição entre os tecidos maternos e fetais, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre a mãe e o feto e pela síntese de hormônios fundamentais para a manutenção da gestação. Para o crescimento placentário e a nutrição fetal é necessário um delicado equilíbrio entre proliferação e morte das células placentárias. Essas células possuem propriedades específicas em relação a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas sendo fundamentais para o desenvolvimento adequado do concepto ao longo da prenhez e seu nascimento. Gestações de animais clonados frequentemente apresentam anormalidades como hidroâmnio, hidroalantoide, edema placentário, retenção de placenta e abortos. Neste estudo, foi avaliada a ocorrência de apoptose (morte celular) em placentônios provenientes de conceptos bovinos transgênicos clonados (n=5) e de gestações naturais (n=18), nos períodos de 60 e 90 dias de gestação, que tiveram seu desenvolvimento interrompido para remoção do útero gestante. As amostras de placentônio foram segmentadas e fixadas em solução aquosa de paraformoldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M e pH 7.4, para verificação da morfologia pela coloração HE e realização da técnica de imunoistoquímica. Os resultados obtidos foram comparados entre bovinos clonados transgênicos e de gestações naturais. Todos os grupos e idades gestacionais analisados apresentaram a mesma composição celular com epitélio uterino... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The placenta in mammals is a transitional organ formed by the justaposition between maternal and fetal tissues, it is responsible for physiological exchanges between mother and fetus and the synthesis of hormones essential for maintaining gestation. For the fetal placental growth and nutrition are requires a delicate balance between proliferation and death cells of the placenta. These cells have specific properties in relation to its metabolic functions, endocrine and angiogenic and it is critical to the proper development of the fetus throughout pregnancy and birth. Cloned animals often have abnormal pregnancies as hidroamnion, hidroalantois, placental edema, retained placenta and abortion. In this study, placentomes the occurrence of apoptosis (death cells) was avaluate from fetuses cloned transgenic cattle (n = 5) and natural pregnancies (n = 18) in periods of 60 and 90 days of gestation that had their intermited development to remove the pregnant uterus. Placentome samples were segmented and fixed in aqueous 4% paraformaldehyde in sodium phosphate buffer (PBS) pH 7.4 and 0.1M, to check the morphology of HE staining and the immunohistochemistry. The results were compared between transgenic cloned cattle and natural gestations. In all groups and gestational ages analyzed showed the same cellular composition with simple cubic uterine epithelium, it is noted the presence of trophoblast giant cells mononuclear and giant trophoblast cells binucleated migrated from fetal epithel... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-08-27T14:35:38Z No. of bitstreams: 1 Taiza da Cunha Soares.pdf: 1857026 bytes, checksum: 4789b4e7d475cfe2c472e70e3d859355 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taiza da Cunha Soares.pdf: 1857026 bytes, checksum: 4789b4e7d475cfe2c472e70e3d859355 (MD5) Previous issue date: 2018-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The release of transgenic cultivars of recalcitrant species such as cotton can be delayed due to the difficulty in regenerating the transformed tissue. Existing regeneration protocols are limited to a few responsive varieties, such as Coker, commonly used as recipients during genetic transformation. One of the factors that may be related to recalcitrance is the inefficiency in the activation of different genes during in vitro culture that may be associated with the acquisition of embryogenic competence. Among the genes mentioned in the literature, the Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) is shown to be responsible for the transition from the somatic cell state to the embryogenic in different plant species. The potential of this gene as a marker of somatic embryogenesis has been investigated. In this work, the relationship of the levels of GhSERK1 expression with the acquisition of embryogenic competence in cotton genotypes was analyzed. For this, a short sequence (186 bp) of this gene was selected from the conserved region between cotton and five other dicotyledons (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max and Phaseolus vulgaris) in order to allow the probe can be applied in the selection of other cultures. Initially, the RT-qPCR gene expression tests were performed in six genotypes with known embryogenic capacity (embryogenic - Coker 312, BRS Rubi and BRS Seridó and non-embryogenic - BRS 201, CNPA Precoce 1 and BRS Topázio), from RNA extracted from meristematic zygotic tissues. The aforementioned genotypes were induced to somatic embryogenesis in medium supplemented with naphthaleneacetic acid and kinetin. Corroborating with the result obtained via RT-qPCR, somatic embryos were formed only in Coker 312, BRS Seridó and BRS Rubi. In the latter, the percentage of fertile plants obtained was higher (50%) than Coker 312 (41.6%). The selective applicability of GhSERK1 was validated in four genotypes top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 and CNPA BA 2247) with unknown in vitro behavior. Simultaneously, we performed induction tests on somatic embryogenesis to verify the expression results. In the genotypes in which the relative expression was higher (Coker 312 and CNPA BA 139), somatic embryos were formed. A nonradioactive probe was then grown from the 186 bp fragment and attested for its efficiency via Southern Blot in the top line genotypes, robust spots were observed in Coker 312 and CNPA BA 139. Based on these results, the latter was selected as the recipient genotype in future transformation studies. In addition, the sequence used allowed to identify genotypes responsive to somatic embryogenesis from zygotic tissues, optimizing time and costs. This work provides collaborations for the understanding of factors that may be involved in the acquisition of embryogenic competence generating perspectives of new studies to strengthen the programs of genetic improvement of the culture. / O lançamento de cultivares transgênicas de espécies recalcitrantes como o algodoeiro pode ser retardado devido à dificuldade em regenerar o tecido transformado. Os protocolos de regeneração existentes limitam-se a poucas variedades responsivas, como a Coker, normalmente utilizadas como receptoras durante a transformação genética. Um dos fatores que podem estar ligados à recalcitrância, é a ineficiência na ativação de diferentes genes durante o cultivo in vitro que podem estar associados à aquisição de competência embriogênica. Dentre os genes citados na literatura, destaca-se o Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) retratado como responsável pela transição do estado celular somático para embriogênico em diferentes espécies de plantas. A potencialidade deste gene como marcador de embriogênese somática tem sido investigada. Neste trabalho, foram analisadas a relação dos níveis de expressão de GhSERK1 com a aquisição de competência embriogênica em genótipos de algodoeiro. Para isto, uma sequência curta (186 pb) deste gene foi selecionada a partir de região conservada entre o algodão e cinco outras dicotiledôneas (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max e Phaseolus vulgaris) de modo a permitir que a sonda também possa ser aplicada na seleção de outras culturas. Inicialmente, os testes de expressão gênica via RT-qPCR foram realizados em seis genótipos com capacidade embriogênica conhecida (embriogênicos – Coker 312, BRS Rubi e BRS Seridó e não embriogênicos – BRS 201, CNPA Precoce 1 e BRS Topázio), a partir de RNA extraído de tecidos zigóticos meristemáticos. Os genótipos supracitados foram induzidos à embriogênese somática em meio suplementado com ácido naftalenoacético e kinetina. Corroborando com o resultado obtido via RT-qPCR, embriões somáticos formaram-se apenas na Coker 312, BRS Seridó e BRS Rubi. Nesta última, o percentual de plantas férteis obtidas foi maior (50%) do que o Coker 312 (41,6%). A aplicabilidade seletiva do GhSERK1 foi validada em quatro genótipos top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 e CNPA BA 2247) com comportamento in vitro desconhecido. Simultaneamente, realizamos ensaios de indução à embriogênese somática para comprovar os resultados de expressão. Nos genótipos em que a expressão relativa foi maior (Coker 312 e CNPA BA 139) houve a formação de embriões somáticos. Uma sonda não radioativa foi então desenvolvida a partir do fragmento de 186 pb e atestada sua eficiência via Southern Blot nos genótipos top lines, manchas robustas foram observadas em Coker 312 e CNPA BA 139. Com base nestes resultados, este último foi selecionado como genótipo receptor em futuros estudos de transformação. Além disso, a sequência utilizada permitiu identificar os genótipos responsivos à embriogênese somática a partir de tecidos zigóticos, otimizando o tempo e os custos. Este trabalho fornece colaborações para a compreensão de fatores que podem estar envolvidos na aquisição de competência embriogênica gerando perspectivas de novos estudos para fortalecer os programas de melhoramento genético da cultura.

A produção de animais transgênicos possui aplicações que envolvem desde a pesquisa básica à produção agropecuária. O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo previamente modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, estudo da expressão gênica e adequada seleção da célula doadora de núcleo na TN não somente pode garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também pode evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção do inserto em regiões codificantes do genoma, em decorrência da inserção aleatória das técnicas de transferência gênica mais comuns. Este trabalho teve como objetivo geral produzir animais transgênicos a partir de transferência nuclear utilizando como células doadoras de núcleo fibroblastos modificados geneticamente por transdução lentiviral. Objetivos específicos foram a produção e caracterização de linhagens de fibroblasto fetal portadores do gene da Proteína Fluorescente Verde (eGFP) quanto à seleção da expressão do transgene, passagem celular e posição da inserção do transgene e sua utilização na técnica de transferência de núcleos para a análise da competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. Para tal, fibroblastos fetais bovinos foram transduzidos pelo sistema lentiviral. Células expressando o gene da eGFP foram selecionadas por citometria de fluxo e utilizadas como doadoras de núcleo na TN. Foram analisados o efeito do período de cultivo dos fibroblastos, assim como o efeito da reclonagem na competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. O cultivo celular submetido à reclonagem foi analisado quanto à posição de inserção do transgene, sendo constatado nos fetos produzidos neste experimento a presença de uma inserção única em região não transcrita do cromossomo 14. Não houve efeito neste experimento do tempo de cultivo na competência de desenvolvimento a blastocisto, mas houve efeito benéfico da reclonagem celular. Além disso, foram obtidos 4 fetos, sendo 3 transgênicos, dos embriões transferidos provenientes das TNs que utilizaram células transgênicas de inserção aleatória em baixas e altas passagens e 6 fetos dos 37 embriões transferidos provenientes das TN que utilizaram células reclonadas, sendo todos transgênicos. Conclui-se que a produção de células transgênicas mediante mecanismo de transdução lentiviral, pode resultar, após TNCS, em embriões geneticamente idênticos à células doadora capazes de sustentar o desenvolvimento in vitro a blastocisto e o estabelecimento de gestações. Finalmente, são discutidos fatores ligados ao processo de seleção e reclonagem que aumentam a eficiência da produção de gestações por TNCS. / Genetically modified animals have numerous applications ranging from basic research to agriculture production. Recent progress in animal cloning by nuclear transfer (NT) has made possible the production of transgenic animals using previously genetically modified cell lineages. The possibility of genetic manipulation, gene expression studies and adequate selection of the nuclei donor cell for NT not only can guarantee the presence of the gene construction in the offspring, but also can avoid the production of animals that carries undesirable characteristics, often as a result of the random insertion of transgenes in transcripted areas of the genome. General objective of this study was to produce transgenic animals by nuclear transfer using lentivirus-genetically modified nuclei donor fibroblasts. Specifically, objectives were the production and characterization of fetal fibroblasts lineages expressing eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP) gene in different cell passages regarding transgene insertion position and its use for the nuclear transfer procedure. The potential of blastocyst development and pregnancy establishment were analyzed in embryos reconstructed with late and early passages and with clonal or random insertion of transgenes (recloning). For that, bovine fetal fibroblasts were transduced with lentiviruses. eGFP expressing cells were selected by flow citometry sorting and used as nuclei donor cells for NT. Transgene integration site of the cell culture submitted to recloning was analised. It was observed that an unique insertion in a non-transcribed área of chromossome 14 was present in the fetuses recovered in this recloning experiment. No effect of culture time on development of blastocysts was observed, however, there was a beneficial effect of the cell recloning Besides, 4 fetuses (3 of them were transgenic) were obtained when 64 embryos reconstructed with random transgene position cells in late and early passages were transferred and 6 fetuses were obtained when 37 embryos reconstructed with recloned cells were transferred (all of them were transgenic). In conclusion, lentivirus transduction was able to produce transgenic cells with a stable expression of the transgene. These cells, when used for SCNT, can be reprogrammed and genetically identical embryos able to sustain in vitro culture, pregnancy establishment and recognition. Finally, recloning and cell selection procedures are discussed as a possible approach to increase pregnancy efficiency after TNCS.

Atualmente o Brasil ocupa lugar de destaque entre os produtores de citros sendo o maior produtor de laranja doce do mundo. Entretanto, essa produção vem sendo gravemente afetada, por doenças como o huanglongbing (HLB), que tem causado perdas significativas para toda cadeia citrícola. O HLB está associado a bactérias Gram-negativas, restritas ao floema das plantas, denominadas Candidatus Liberibacter spp., que além de reduzir a produção de frutos, podem, em casos mais severos da doença, ocasionar a morte da planta. Uma importante estratégia para controle desta doença é a produção de plantas transgênicas expressando genes, especificamente no local de colonização do patógeno. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de Citrus sinensis cvs. \'Pera\' e \'Natal\', contendo o gene atacina A (attA) que codifica um peptídeo antibacteriano, dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema: AtSuc2 (transportador de sacarose) ou AtPP2 (proteína de floema 2), clonados de Arabidopsis thaliana, ou CsPP2 (proteína de floema 2) clonado de Citrus sinensis. A identificação de 65 plantas transgênicas foi realizada, por meio da análise de PCR. Foi verificado um número menor de eventos transgênicos, utilizando-se a construção gênica pCAtSuc2/attA em relação ao número de eventos transgênicos obtidos com as construções gênicas pCCsPP2/attA e pCAtPP2/attA. Plantas identificadas como transgênicas pela análise de PCR, foram aclimatizadas e transferidas para casa-devegetação certificada para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de Southern blot foram realizadas em plantas aclimatizadas que apresentaram desenvolvimento suficiente, confirmando-se a integração do gene attA. A expressão do gene attA foi confirmada pela análise de RT-qPCR. As plantas transgênicas obtidas neste trabalho, contendo o gene attA dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema, serão avaliadas em uma etapa futura para resistência a Candidatus Liberibacter spp. / Currently, Brazil is a major citrus producer and the world\'s largest producer of sweet oranges. However, diseases, such as huanglongbing (HLB) have seriously affected this production, causing significant losses in citrus production chain. HLB is associated with Gram-negative bacterias, restricted to the phloem of plants, called Candidatus Liberibacter spp., which besides reducing fruit production, can lead to plant death. An important strategy to control this disease is the production of transgenic plants expressing genes, specifically at the region of pathogen colonization. The aim of this study was to obtain transgenic plants of Citrus sinensis cv. \'Natal\' and \'Pera\', containing the gene attacin A (attA) that encodes an antibacterial peptide, driven by preferentially expressed in phloem promoters: AtSuc2 (sucrose transporter) or AtPP2 (phloem protein 2), cloned from Arabidopsis thaliana, or CsPP2 (phloem protein 2) cloned from Citrus sinensis. The identification of 65 transgenic plants was performed by PCR analysis. A lower number of transgenic events were verified using the gene construct pCAtSuc2/attA in relation events obtained with the gene constructs pCCsPP2/attA and pCAtPP2/attA. Plants identified as transgenic by PCR analysis were acclimatized and transferred to a greenhouse certified for growing transgenic plants. The Southern blot analyses were performed in acclimatized plants, which had sufficiently developed, confirming the integration of attA gene. The expression of attA gene was confirmed by RT-qPCR analysis. The transgenic plants obtained in this work, containing the gene attA directed by preferentially expressed in phloem promoters, will be further evaluated for resistance to Candidatus Liberibacter spp.

A produção de animais transgênicos possui aplicações que envolvem desde a pesquisa básica à produção agropecuária. O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo previamente modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, estudo da expressão gênica e adequada seleção da célula doadora de núcleo na TN não somente pode garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também pode evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção do inserto em regiões codificantes do genoma, em decorrência da inserção aleatória das técnicas de transferência gênica mais comuns. Este trabalho teve como objetivo geral produzir animais transgênicos a partir de transferência nuclear utilizando como células doadoras de núcleo fibroblastos modificados geneticamente por transdução lentiviral. Objetivos específicos foram a produção e caracterização de linhagens de fibroblasto fetal portadores do gene da Proteína Fluorescente Verde (eGFP) quanto à seleção da expressão do transgene, passagem celular e posição da inserção do transgene e sua utilização na técnica de transferência de núcleos para a análise da competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. Para tal, fibroblastos fetais bovinos foram transduzidos pelo sistema lentiviral. Células expressando o gene da eGFP foram selecionadas por citometria de fluxo e utilizadas como doadoras de núcleo na TN. Foram analisados o efeito do período de cultivo dos fibroblastos, assim como o efeito da reclonagem na competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. O cultivo celular submetido à reclonagem foi analisado quanto à posição de inserção do transgene, sendo constatado nos fetos produzidos neste experimento a presença de uma inserção única em região não transcrita do cromossomo 14. Não houve efeito neste experimento do tempo de cultivo na competência de desenvolvimento a blastocisto, mas houve efeito benéfico da reclonagem celular. Além disso, foram obtidos 4 fetos, sendo 3 transgênicos, dos embriões transferidos provenientes das TNs que utilizaram células transgênicas de inserção aleatória em baixas e altas passagens e 6 fetos dos 37 embriões transferidos provenientes das TN que utilizaram células reclonadas, sendo todos transgênicos. Conclui-se que a produção de células transgênicas mediante mecanismo de transdução lentiviral, pode resultar, após TNCS, em embriões geneticamente idênticos à células doadora capazes de sustentar o desenvolvimento in vitro a blastocisto e o estabelecimento de gestações. Finalmente, são discutidos fatores ligados ao processo de seleção e reclonagem que aumentam a eficiência da produção de gestações por TNCS. / Genetically modified animals have numerous applications ranging from basic research to agriculture production. Recent progress in animal cloning by nuclear transfer (NT) has made possible the production of transgenic animals using previously genetically modified cell lineages. The possibility of genetic manipulation, gene expression studies and adequate selection of the nuclei donor cell for NT not only can guarantee the presence of the gene construction in the offspring, but also can avoid the production of animals that carries undesirable characteristics, often as a result of the random insertion of transgenes in transcripted areas of the genome. General objective of this study was to produce transgenic animals by nuclear transfer using lentivirus-genetically modified nuclei donor fibroblasts. Specifically, objectives were the production and characterization of fetal fibroblasts lineages expressing eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP) gene in different cell passages regarding transgene insertion position and its use for the nuclear transfer procedure. The potential of blastocyst development and pregnancy establishment were analyzed in embryos reconstructed with late and early passages and with clonal or random insertion of transgenes (recloning). For that, bovine fetal fibroblasts were transduced with lentiviruses. eGFP expressing cells were selected by flow citometry sorting and used as nuclei donor cells for NT. Transgene integration site of the cell culture submitted to recloning was analised. It was observed that an unique insertion in a non-transcribed área of chromossome 14 was present in the fetuses recovered in this recloning experiment. No effect of culture time on development of blastocysts was observed, however, there was a beneficial effect of the cell recloning Besides, 4 fetuses (3 of them were transgenic) were obtained when 64 embryos reconstructed with random transgene position cells in late and early passages were transferred and 6 fetuses were obtained when 37 embryos reconstructed with recloned cells were transferred (all of them were transgenic). In conclusion, lentivirus transduction was able to produce transgenic cells with a stable expression of the transgene. These cells, when used for SCNT, can be reprogrammed and genetically identical embryos able to sustain in vitro culture, pregnancy establishment and recognition. Finally, recloning and cell selection procedures are discussed as a possible approach to increase pregnancy efficiency after TNCS.

Atualmente o Brasil ocupa lugar de destaque entre os produtores de citros sendo o maior produtor de laranja doce do mundo. Entretanto, essa produção vem sendo gravemente afetada, por doenças como o huanglongbing (HLB), que tem causado perdas significativas para toda cadeia citrícola. O HLB está associado a bactérias Gram-negativas, restritas ao floema das plantas, denominadas Candidatus Liberibacter spp., que além de reduzir a produção de frutos, podem, em casos mais severos da doença, ocasionar a morte da planta. Uma importante estratégia para controle desta doença é a produção de plantas transgênicas expressando genes, especificamente no local de colonização do patógeno. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de Citrus sinensis cvs. \'Pera\' e \'Natal\', contendo o gene atacina A (attA) que codifica um peptídeo antibacteriano, dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema: AtSuc2 (transportador de sacarose) ou AtPP2 (proteína de floema 2), clonados de Arabidopsis thaliana, ou CsPP2 (proteína de floema 2) clonado de Citrus sinensis. A identificação de 65 plantas transgênicas foi realizada, por meio da análise de PCR. Foi verificado um número menor de eventos transgênicos, utilizando-se a construção gênica pCAtSuc2/attA em relação ao número de eventos transgênicos obtidos com as construções gênicas pCCsPP2/attA e pCAtPP2/attA. Plantas identificadas como transgênicas pela análise de PCR, foram aclimatizadas e transferidas para casa-devegetação certificada para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de Southern blot foram realizadas em plantas aclimatizadas que apresentaram desenvolvimento suficiente, confirmando-se a integração do gene attA. A expressão do gene attA foi confirmada pela análise de RT-qPCR. As plantas transgênicas obtidas neste trabalho, contendo o gene attA dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema, serão avaliadas em uma etapa futura para resistência a Candidatus Liberibacter spp. / Currently, Brazil is a major citrus producer and the world\'s largest producer of sweet oranges. However, diseases, such as huanglongbing (HLB) have seriously affected this production, causing significant losses in citrus production chain. HLB is associated with Gram-negative bacterias, restricted to the phloem of plants, called Candidatus Liberibacter spp., which besides reducing fruit production, can lead to plant death. An important strategy to control this disease is the production of transgenic plants expressing genes, specifically at the region of pathogen colonization. The aim of this study was to obtain transgenic plants of Citrus sinensis cv. \'Natal\' and \'Pera\', containing the gene attacin A (attA) that encodes an antibacterial peptide, driven by preferentially expressed in phloem promoters: AtSuc2 (sucrose transporter) or AtPP2 (phloem protein 2), cloned from Arabidopsis thaliana, or CsPP2 (phloem protein 2) cloned from Citrus sinensis. The identification of 65 transgenic plants was performed by PCR analysis. A lower number of transgenic events were verified using the gene construct pCAtSuc2/attA in relation events obtained with the gene constructs pCCsPP2/attA and pCAtPP2/attA. Plants identified as transgenic by PCR analysis were acclimatized and transferred to a greenhouse certified for growing transgenic plants. The Southern blot analyses were performed in acclimatized plants, which had sufficiently developed, confirming the integration of attA gene. The expression of attA gene was confirmed by RT-qPCR analysis. The transgenic plants obtained in this work, containing the gene attA directed by preferentially expressed in phloem promoters, will be further evaluated for resistance to Candidatus Liberibacter spp.

Orientador: Marco Aurélio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maciel_BrunaCarolineMiranda_M.pdf: 2287580 bytes, checksum: 69534e40c093aed8660eb365cf0fa8f6 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Tendo em vista que a prática da transgenia reflete uma realidade mundial no setor agrícola, o principal objetivo desse trabalho de Dissertação é avaliar algumas espécies de proteínas diferenciais entre folhas de Arabidopsis thaliana não transgênica (NT) e transgênica (T), ambas irrigadas com uma solução de Selênio (Se), frente a uma condição controle. De maneira a averiguar as diferenças entre as folhas NT e T, usando como parâmetros o efeito da transgenia e do estresse oxidativo induzido por Se, um estudo proteômico comparativo foi desenvolvido por meio da metodologia 2-D DIGE, uma variante da técnica de separação por 2-D PAGE, que oferece vantagens, tais como na detectabilidade das proteínas de baixa abundância e precisão para análise quantitativa entre as intensidades diferenciais dos spots proteicos, resultando, com efeito, um mapa proteômico mais representativo destas folhas. Quatro grupos de plantio foram combinados para análise comparativa, de tal forma que NT x T, NT x Se-NT, Se-NT x Se-T e T x Se-T. Embora não tenha sido detectadas espécies de proteínas diferencias no grupo T x Se-T, para os outros, 68 proteínas diferenciais foram detectadas, usando um fator de regulação 1,5 baseado no teste de t para p < 0,05. Dentre este total, 27 proteínas diferenciais foram precisamente identificadas por ESI-QTOF-MS/MS. Estas proteínas estão classificadas quanto às funções metabólicas, energéticas, de transdução de sinal, doenças/defensa vegetal, e algumas delas estão envolvidas nas vias da Glicólise, Fotossistema I e II, e combate à ERO (espécies reativas de oxigênio). Adicionalmente, um imageamento por ablação a laser foi feito para avaliar a distribuição de Se e Enxofre (S) em folhas dos grupos diferentes, corroborando com alguns resultados obtidos, principalmente àquelas proteínas envolvidas nas vias da Glicólise. A partir destes resultados é possível concluir que o vetor inserido também confere à planta a resistência ao estresse oxidativo, no qual o Selênio adicionado foi o efeito mais influente comparado com o efeito da transgenia / Abstract: In view of the techniques related to transgenesis show the global reality in the agricultural sector, the main goal of this Thesis work is to evaluate some differential protein species in non-transgenic (NT) and transgenic (T) Arabidopsis thaliana leaves, both they irrigated with Selenium (Se) solution in front of control condition. In order to estimate the differences between NT and T leaves, using as parameters the transgenesis effect and the oxidative stress induced by Se, a comparative proteomic study was performed using 2-D DIGE methodology, a variant technique of separation by 2-D PAGE that offers ideal advantages, such as detectability of low abundance proteins and accuracy to quantitative analysis among differential intensities of protein spots, resulting in a more representative proteomic map these leaves. Four plant groups were combined to comparative analysis, so that NT x T, NT x Se-NT, Se-NT x Se-T e T x Se-T. Although there differential protein species from T x Se-T group were not detected, for the others, 68 differential protein species were detected, using regulation factor of 1.5, which was based in t test to p < 0.05. Among them, 27 differential proteins were accurately identified by ESI-QTOF-MS/MS. These proteins are classified regarding functions as metabolism, energy, signal transduction, diseases/vegetal defense and some of these were involved in the Glycolysis pathway, Photosystem I and II, and combat the ROS (reactive oxygen species). Additionally an imaging by laser ablation was done to evaluate the Se and Sulfur (S) distribution in leaves of different groups corroborating with some obtained results, mainly those proteins involved in the Glycolysis pathway. From these results, it is possible to conclude that insert vector confers resistance to the T plant regarding oxidative stress where the added Se was the effect more influential than compared with transgenesis effect / Mestrado / Quimica Analitica / Mestra em Química

Submitted by Kian Eghrari Moraes null (kianem@gmail.com) on 2017-03-14T19:44:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Kian_Eghrari_Moraes.pdf: 1379647 bytes, checksum: 5a9daad8a0289711efcdab3175a3dd1e (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-21T19:54:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moraes_ke_me_jabo.pdf: 1379647 bytes, checksum: 5a9daad8a0289711efcdab3175a3dd1e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-21T19:54:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moraes_ke_me_jabo.pdf: 1379647 bytes, checksum: 5a9daad8a0289711efcdab3175a3dd1e (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os híbridos de milho transgênicos, em geral, apresentam o locus transgênico em hemizigose. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do número de alelos transgênicos em híbridos de milho em relação à expressão de Cry1F nas folhas, ataque de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) e a produtividade de grãos, utilizando cinco híbridos isogênicos nas versões transgênicas homozigota e hemizigota, além da versão convencional de um dos híbridos. O nível de expressão da proteína Cry1F (PRYF) foi quantificado pela técnica de ELISA. Nos experimentos de campo, conduzidos na primeira e segunda safras do ano agrícola 2015/2016, avaliou-se o ataque de S. frugiperda em campo (ALC), por infestação natural, e a produtividade de grãos (PG). Dois bioensaios foram realizados em laboratório para avaliar a sobrevivência larval de S. frugiperda de 1º instar (SL) alimentadas com as folhas dos híbridos. Os híbridos transgênicos, homozigotos e hemizigotos, não apresentaram silenciamento gênico. Os híbridos homozigotos apresentaram maior concentração de proteína Cry1F. Quando houve elevado ALC, na primeira safra, os híbridos transgênicos foram superiores à testemunha convencional na PG, entretanto, não houve diferença entre os híbridos homozigotos e hemizigotos. Os híbridos transgênicos também foram superiores à testemunha convencional nos bioensaios, sendo que os homozigotos apresentaram as menores médias de SL. A presença de um alelo transgênico a mais nos híbridos homozigotos propiciou comportamento genético aditivo para a expressão de Cry1F e controle de S. frugiperda, diminuindo ALC e SL, sem diminuir a capacidade produtiva das plantas. Diante do exposto, não há limitações para a utilização de híbridos de milho homozigotos para o transgene, pois apresentaram melhor controle de S. frugiperda em comparação com os híbridos hemizigotos. / Genetically modified (GM) maize hybrids, in general, possess the transgenic locus in a hemizygous state. The aim of the study was to assess the effect of the number of transgenic alleles in maize hybrids regarding the Cry1F leaf expression, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) attack and grain yield, through the evaluation of five isogenic hybrids in the homozygous and hemizygous transgenic versions and a non-GM hybrid. Cry1F protein expression levels (PRYF) were quantified by ELISA. In field experiments conducted during the summer and autumn seasons of 2015/2016, we assessed the leaf-feeding injury of S. frugiperda in the field (LFI) by natural infestation and grain yield (GY). Two bioassays were carried out in the laboratory to evaluate the survival of first-instar S. frugiperda larvae (SL) fed with the maize hybrids. Transgenic hybrids did not present gene silencing. Homozygous hybrids presented higher Cry1F expression levels than hemizygous hybrids. With high LFI during the summer season, transgenic hybrids were superior to the non-GM for GY, however, there was no difference between homozygous and hemizygous hybrids. The transgenic hybrids were superior to the non-GM hybrid in the bioassays, and the homozygotes caused the highest mortality of S. frugiperda. The addition of one transgenic allele in the homozygous hybrids provided an additive genetic effect, increasing PRYF and S. frugiperda control, whereas GY was not affected. In conclusion, there are no limitations to the use of transgenic homozygous maize hybrids, which presented better S. frugiperda control comparing to hemizygous hybrids.