Submitted by Bruno Martinucci null (martinucci.bruno@ibb.unesp.br) on 2017-03-23T12:44:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-23T15:00:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martinucci_b_me_bot.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T15:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martinucci_b_me_bot.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) Previous issue date: 2017-02-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de próstata (CaP) continua a ser uma das principais causas de morte entre os homens. Mesmo com suas altas taxas de mortalidade e incidência, pouco ainda se sabe sobre os aspectos moleculares desta doença. Entre os diversos fatores envolvidos na carcinogênese prostática, elementos da matriz extracelular (MEC) desempenham papel fundamental. Na próstata, a fibronectina (FN), proteína multimodular que tem sido relacionada ao desenvolvimento de múltiplos tipos de câncer, a migração e invasão celular, tem sua expressão restrita ao compartimento estromal. Contudo, no desenvolvimento tumoral, o padrão de expressão da FN é alterado, com secreção desregulada e falta de organização da matriz. Desta forma, para investigar o impacto da FN no CaP, as células neoplásicas LNCaP foram expostas somente à FN solúvel (25μg/mL) e em combinação com uma membrana basal. Nossos resultados demonstraram que quando a FN é o elemento predominante, as células tumorais desenvolvem um comportamento invasivo e resistência à apoptose. No entanto, na presença de uma membrana basal, a FN diminuiu o potencial maligno e metastático destas células, que neste novo ambiente exibiam perfil de expressão gênica mais semelhante às células RWPE-1, linhagem celular que ilustra as características do epitélio prostático normal. Consequentemente, sabendo que a relação entre as células tumorais e a MEC é regulada em múltiplos níveis, os microRNAs emergiram como importantes moléculas reguladoras. Portanto, também investigamos o impacto da FN na expressão de miRNAs em células LNCaP e PC-3. Nossos resultados mostraram que cinco miRNAs apresentavam expressão diferencial (miR-21, miR-29b, miR-125b, miR-221 e miR-222) após exposição à FN. Para uma análise mais profunda, analisamos a expressão regular de possíveis mRNAs alvos destes miRNAs em dados de RNAseq disponíveis, construímos redes de interação protéica baseadas no banco de dados STRING e realizamos as análises de enriquecimentos de via e de função gênica para avaliarmos de maneira mais abrangente os possíveis efeitos desta proteína. De maneira geral, nosso estudo mostrou que a FN pode estar envolvido na progressão do CaP através da modulação de vias de sinalização, como PI3K/AKT, resposta a drogas e hipóxia. Desta forma, acreditamos que nossos resultados fornecem a base para estudos futuros, abordando o papel da FN no crescimento tumoral, particularmente no contexto de evolução/progressão do câncer de um tumor primário sólido para um estado circulante transitório. / Prostate cancer (PCa) continues to be a leading cause of death among men. Even with its high mortality and incidence rates, little is known about the molecular aspects of this disease. Among the various factors involved in the carcinogenesis of the prostate, components of the extracellular matrix (ECM) play key roles. In the prostate, fibronectin (FN), a multimodular protein that has been linked to the development of multiple cancers and involved with cell migration and invasion, has its expression restricted to the stromal compartment. However, in tumor development, the pattern of expression of FN becomes altered, with deregulated secretion and a lack of matrix organization. Thus, in order to investigate the impact of FN on PCa, the neoplastic cells LNCaP were exposed only to soluble FN (25μg/mL) or in combination with a basement membrane. Our results demonstrated that when FN is the predominant element, tumor cells develop an invasive behavior and become resistant to apoptosis. However, in the presence of a basement membrane, FN decreases the malignant and metastatic potential of these cells, which in this new environment displayed a gene expression profile more similar to the RWPE- 1 cells, a cell line that illustrates the characteristics of the normal prostate epithelium. Consequently, knowing that the relationship between tumor cells and the ECM is regulated at multiple levels, microRNAs have emerged as important regulatory molecules. Therefore, we also investigated the impact of FN on the expression of miRNAs in LNCaP and PC-3 cells. Our results showed that five miRNAs exhibited differential expression (miR-21, miR-29b, miR- 125b, miR-221 and miR-222) after exposure to FN. For a more in-depth analysis, we analyzed the basal expression of mRNAs possibly targeted by these miRNAs in published RNAseq data, constructed protein interactions networks based on the STRING database, and performed pathway enrichment and gene function analyzes to evaluate more comprehensively the possible effects of this protein. Overall, our study showed that FN may be involved in the progression of PCa through the modulation of signaling pathways, such as PI3K/AKT, drug response and hypoxia. Thus, we believe that our results provide the basis for future studies addressing the role of FN in tumor development, particularly in the context of cancer progression from a solid primary tumor to a transient circulating state. / FAPESP: 2014/25702-0

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-08-27T14:35:38Z No. of bitstreams: 1 Taiza da Cunha Soares.pdf: 1857026 bytes, checksum: 4789b4e7d475cfe2c472e70e3d859355 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taiza da Cunha Soares.pdf: 1857026 bytes, checksum: 4789b4e7d475cfe2c472e70e3d859355 (MD5) Previous issue date: 2018-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The release of transgenic cultivars of recalcitrant species such as cotton can be delayed due to the difficulty in regenerating the transformed tissue. Existing regeneration protocols are limited to a few responsive varieties, such as Coker, commonly used as recipients during genetic transformation. One of the factors that may be related to recalcitrance is the inefficiency in the activation of different genes during in vitro culture that may be associated with the acquisition of embryogenic competence. Among the genes mentioned in the literature, the Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) is shown to be responsible for the transition from the somatic cell state to the embryogenic in different plant species. The potential of this gene as a marker of somatic embryogenesis has been investigated. In this work, the relationship of the levels of GhSERK1 expression with the acquisition of embryogenic competence in cotton genotypes was analyzed. For this, a short sequence (186 bp) of this gene was selected from the conserved region between cotton and five other dicotyledons (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max and Phaseolus vulgaris) in order to allow the probe can be applied in the selection of other cultures. Initially, the RT-qPCR gene expression tests were performed in six genotypes with known embryogenic capacity (embryogenic - Coker 312, BRS Rubi and BRS Seridó and non-embryogenic - BRS 201, CNPA Precoce 1 and BRS Topázio), from RNA extracted from meristematic zygotic tissues. The aforementioned genotypes were induced to somatic embryogenesis in medium supplemented with naphthaleneacetic acid and kinetin. Corroborating with the result obtained via RT-qPCR, somatic embryos were formed only in Coker 312, BRS Seridó and BRS Rubi. In the latter, the percentage of fertile plants obtained was higher (50%) than Coker 312 (41.6%). The selective applicability of GhSERK1 was validated in four genotypes top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 and CNPA BA 2247) with unknown in vitro behavior. Simultaneously, we performed induction tests on somatic embryogenesis to verify the expression results. In the genotypes in which the relative expression was higher (Coker 312 and CNPA BA 139), somatic embryos were formed. A nonradioactive probe was then grown from the 186 bp fragment and attested for its efficiency via Southern Blot in the top line genotypes, robust spots were observed in Coker 312 and CNPA BA 139. Based on these results, the latter was selected as the recipient genotype in future transformation studies. In addition, the sequence used allowed to identify genotypes responsive to somatic embryogenesis from zygotic tissues, optimizing time and costs. This work provides collaborations for the understanding of factors that may be involved in the acquisition of embryogenic competence generating perspectives of new studies to strengthen the programs of genetic improvement of the culture. / O lançamento de cultivares transgênicas de espécies recalcitrantes como o algodoeiro pode ser retardado devido à dificuldade em regenerar o tecido transformado. Os protocolos de regeneração existentes limitam-se a poucas variedades responsivas, como a Coker, normalmente utilizadas como receptoras durante a transformação genética. Um dos fatores que podem estar ligados à recalcitrância, é a ineficiência na ativação de diferentes genes durante o cultivo in vitro que podem estar associados à aquisição de competência embriogênica. Dentre os genes citados na literatura, destaca-se o Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) retratado como responsável pela transição do estado celular somático para embriogênico em diferentes espécies de plantas. A potencialidade deste gene como marcador de embriogênese somática tem sido investigada. Neste trabalho, foram analisadas a relação dos níveis de expressão de GhSERK1 com a aquisição de competência embriogênica em genótipos de algodoeiro. Para isto, uma sequência curta (186 pb) deste gene foi selecionada a partir de região conservada entre o algodão e cinco outras dicotiledôneas (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max e Phaseolus vulgaris) de modo a permitir que a sonda também possa ser aplicada na seleção de outras culturas. Inicialmente, os testes de expressão gênica via RT-qPCR foram realizados em seis genótipos com capacidade embriogênica conhecida (embriogênicos – Coker 312, BRS Rubi e BRS Seridó e não embriogênicos – BRS 201, CNPA Precoce 1 e BRS Topázio), a partir de RNA extraído de tecidos zigóticos meristemáticos. Os genótipos supracitados foram induzidos à embriogênese somática em meio suplementado com ácido naftalenoacético e kinetina. Corroborando com o resultado obtido via RT-qPCR, embriões somáticos formaram-se apenas na Coker 312, BRS Seridó e BRS Rubi. Nesta última, o percentual de plantas férteis obtidas foi maior (50%) do que o Coker 312 (41,6%). A aplicabilidade seletiva do GhSERK1 foi validada em quatro genótipos top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 e CNPA BA 2247) com comportamento in vitro desconhecido. Simultaneamente, realizamos ensaios de indução à embriogênese somática para comprovar os resultados de expressão. Nos genótipos em que a expressão relativa foi maior (Coker 312 e CNPA BA 139) houve a formação de embriões somáticos. Uma sonda não radioativa foi então desenvolvida a partir do fragmento de 186 pb e atestada sua eficiência via Southern Blot nos genótipos top lines, manchas robustas foram observadas em Coker 312 e CNPA BA 139. Com base nestes resultados, este último foi selecionado como genótipo receptor em futuros estudos de transformação. Além disso, a sequência utilizada permitiu identificar os genótipos responsivos à embriogênese somática a partir de tecidos zigóticos, otimizando o tempo e os custos. Este trabalho fornece colaborações para a compreensão de fatores que podem estar envolvidos na aquisição de competência embriogênica gerando perspectivas de novos estudos para fortalecer os programas de melhoramento genético da cultura.

Orientador: Danillo Pinhal / Resumo: MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores que regulam uma ampla gama de vias biológicas. Esta regulação ocorre através do pareamento complementar entre o miRNA e seu RNA mensageiro (mRNA) alvo, gelramente na região 3’UTR, inibindo a síntese proteica. Diversos trabalhos têm buscado determinar as funções biológicas desempenhadas pelos miRNAs por meio da identificação de seus alvos e posterior análise de enriquecimento funcional. Entretanto, as ferramentas de predição de alvos in silico disponíveis atualmente apresentam resultados pouco robustos e não há um consenso sobre a melhor ferramenta e estratégia para análise dos dados. Adicionalmente, a metodologia de enriquecimento funcional atual não leva em conta diversos fatores fundamentais atuantes na regulação dos alvos dos miRNAs, retornando resultados inconsistentes que culminam em experimentos de validação desnecessários e pouco específicos, com consequente desperdício de tempo e recursos. Desta maneira, o presente trabalho tem como objetivos (i) elaborar metodologia de predição de alvos com alta eficiência utilizando as ferramentas de bioiformática disponíveis e (ii) avaliar a regulação dos processos biológicos controlados pelos miRNAs através da análise de enriquecimento funcional, considerando o foldchange de seus mRNA alvo. Para tal, comparou-se as performances das três ferramentas de predição de alvos atualmente mais utilizadas (TargetScan, miRanda-mirSVR, e Pita), assim como testou-se todas a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Flávia Karina Delella / Resumo: O câncer de próstata (CaP) continua a ser uma das principais causas de morte entre os homens. Mesmo com suas altas taxas de mortalidade e incidência, pouco ainda se sabe sobre os aspectos moleculares desta doença. Entre os diversos fatores envolvidos na carcinogênese prostática, elementos da matriz extracelular (MEC) desempenham papel fundamental. Na próstata, a fibronectina (FN), proteína multimodular que tem sido relacionada ao desenvolvimento de múltiplos tipos de câncer, a migração e invasão celular, tem sua expressão restrita ao compartimento estromal. Contudo, no desenvolvimento tumoral, o padrão de expressão da FN é alterado, com secreção desregulada e falta de organização da matriz. Desta forma, para investigar o impacto da FN no CaP, as células neoplásicas LNCaP foram expostas somente à FN solúvel (25μg/mL) e em combinação com uma membrana basal. Nossos resultados demonstraram que quando a FN é o elemento predominante, as células tumorais desenvolvem um comportamento invasivo e resistência à apoptose. No entanto, na presença de uma membrana basal, a FN diminuiu o potencial maligno e metastático destas células, que neste novo ambiente exibiam perfil de expressão gênica mais semelhante às células RWPE-1, linhagem celular que ilustra as características do epitélio prostático normal. Consequentemente, sabendo que a relação entre as células tumorais e a MEC é regulada em múltiplos níveis, os microRNAs emergiram como importantes moléculas reguladoras. Portanto, também inve... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Prostate cancer (PCa) continues to be a leading cause of death among men. Even with its high mortality and incidence rates, little is known about the molecular aspects of this disease. Among the various factors involved in the carcinogenesis of the prostate, components of the extracellular matrix (ECM) play key roles. In the prostate, fibronectin (FN), a multimodular protein that has been linked to the development of multiple cancers and involved with cell migration and invasion, has its expression restricted to the stromal compartment. However, in tumor development, the pattern of expression of FN becomes altered, with deregulated secretion and a lack of matrix organization. Thus, in order to investigate the impact of FN on PCa, the neoplastic cells LNCaP were exposed only to soluble FN (25μg/mL) or in combination with a basement membrane. Our results demonstrated that when FN is the predominant element, tumor cells develop an invasive behavior and become resistant to apoptosis. However, in the presence of a basement membrane, FN decreases the malignant and metastatic potential of these cells, which in this new environment displayed a gene expression profile more similar to the RWPE- 1 cells, a cell line that illustrates the characteristics of the normal prostate epithelium. Consequently, knowing that the relationship between tumor cells and the ECM is regulated at multiple levels, microRNAs have emerged as important regulatory molecules. Therefore, we also investigated the ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-16Bitstream added on 2014-06-13T19:28:59Z : No. of bitstreams: 1 ucci_ap_me_araiq.pdf: 1107212 bytes, checksum: d5908c197d6d3cb915d0549cd1755e02 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é uma bactéria Gram-negativa responsável pelo o cancro cítrico. A doença causada por este fitopatógeno constitui numa das mais graves doenças da citricultura brasileira, cujas medidas de controle capazes de eliminar completamente a doença são ineficientes até o momento. O sequenciamento e anotação do genoma de Xcc juntamente com estudos relacionados à genômica funcional nesta bactéria realizados em nosso laboratório mostraram a existência, na bactéria, de alguns genes (copA e copB) que codificam proteínas envolvidas com o mecanismo de resistência a cobre (CopA e CopB). Os genes que codificam ambas proteínas estão organizados em um operon, cuja transcrição é induzida por cobre e é específica ao metal. Componentes a base de cobre são comumente usados na agricultura como agentes microbicidas a fim de reduzir a severidade desta e também de outras doenças nas plantas. Contudo, a eficácia do cobre está sendo reduzida pelo aparecimento de linhagens de bactérias resistentes a este metal, portanto, estudos visando a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resistência a cobre em Xcc são de grande importância. Uma pequena ORF (XAC3629) que codifica uma proteína hipotética de 152 aminoácidos e que se localiza upstream aos genes copAB foi identificada. Neste trabalho foi estudado o papel da ORF na regulação do operon copAB. Linhagens mutantes contendo a ORF XAC3629 interrompida por um transposon (XAC3629 / Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is a Gram-negative bacterium that causes citrus canker, one of the most serious diseases in Brazilian crops, and the ways to eliminate it are not efficient. After sequencing and annotation of the Xcc genome our laboratory started to perform functional genomic studies in Xcc. Previous studies identified two genes (copA and copB) that encode proteins involved in the copper resistance mechanism (CopA and CopB). The genes are organized in an operon whose transcription is induced and specific to copper. Copper compounds are commonly used in agriculture in order to control plant diseases, however the copper effectiveness is being reduced due to the emergence of copper resistant bacteria strains. Therefore, studies related to copper resistance mechanism in Xcc are very relevant. A short ORF (XAC3629) which encodes an 152 amino acids hypothetical protein was identified upstream the operon copAB. In this work the role of the ORF in the operon regulation was studied. Mutant strains containing the ORF XAC3629 interrupetd by a transposon (XAC3629

Influência dos sistemas de Quorum Sensing AI-1/AI-2/AI-3 nos fatores de virulência de EPEC atípica de origem animal. A secreção de moléculas sinalizadoras de baixo peso molecular que se acumulam no meio extracelular até atingir um limite crítico de concentração para sua detecção, acarretando em sinalizações intracelulares e respostas efetoras, define o sistema de comunicação bacteriano chamado Quorum Sensing. Este sistema, que regula comportamentos coletivos mostrou-se um mecanismo disseminado em diversas espécies bacterianas. Diversos estudos descreveram a existência de pelo menos 3 sistemas relacionados ao Quorum Sensing em bactérias Gram-negativas, LuxIR/AI-1, LuxS/AI-2 e QseBC/AI-3/Epinefrina/Norepinefrina. Fatores de virulência como formação de biofilme, motilidade e adesão ao epitélio do hospedeiro devem ser controlados de maneira adequada para tirar o melhor proveito da situação em que a bactéria se encontra. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência e a correlação dos genes luxS, qseC e sdiA, relacionados ao sistema de comunicação bacteriana Quorum Sensing, nos principais fatores de virulência de uma amostra de EPEC atípica de origem animal. Foram construídos mutantes pela metodologia baseada na recombinação homóloga mediada pelo sistema Lambda Red, que foram submetidos a ensaios fenotípicos. A sinalização por AI-2 e luxS desempenham papéis na motilidade, formação de biofilme e adesão a células epiteliais. QseC influencia a produção de biofilme pela regulação de componentes da matriz extracelular, e participa de processos de motilidade e adesão. O hormônio epinefrina contribui na alteração de processos de motilidade, formação de biofilme e desenvolvimento da lesão A/E. O gene sdiA também tem um papel importante na regulação de fatores de virulência, mesmo na ausência de AHL. Uma interação antagônica parece existir entre os genes qseC e luxS. A ausência de sistemas de Quorum Sensing promove a produção de um biofilme robusto na amostra AP155. / The secretion of low molecular weight signaling molecules that accumulate in the extracellular medium until reaching a critical concentration limit for its detection, leading to intracellular signaling and effector responses, defines the bacterial communication system called Quorum Sensing. This system regulates collective behaviors and has been proven to be a widespread mechanism in several bacterial species. Several studies have described the existence of at least 3 Quorum Sensing-related systems in Gram-negative bacteria, LuxIR/AI-1, LuxS/AI-2 and QseBC/AI-3/Epinephrine/Norepinephrine. Virulence factors such as biofilm formation, motility and adhesion to the host epithelium should be adequately regulated to make the most of the situation in which the bacterium is found. The aim of this work was to analyze the influence and correlation of luxS, qseC and sdiA genes, related to the bacterial communication system Quorum Sensing, on the main virulence factors of an atypical EPEC strain isolated from an animal. Mutants were obtained through homologous recombination mediated by the Lambda Red system, and then were submitted to phenotypic assays. AI-2 signaling and luxS play roles in motility, biofilm formation, and adhesion to epithelial cells. QseC influences the production of biofilm by the regulation of components of the extracellular matrix, and participates in the processes of motility and adhesion as well. The epinephrine hormone alters the processes of motility, biofilm formation and development of the A/E lesion. The sdiA gene also plays an important role in the regulation of virulence factors, even in the absence of AHL. An antagonistic interaction seems to exist between the qseC and luxS genes. The absence of Quorum Sensing systems promotes the production of a robust biofilm in the AP155 strain.

O iodeto reduz a expressão, cauda poli(A) e taxa de tradução do mRNA da NIS, a partir de 30 min de tratamento. O estudo atual objetivou caracterizar as bases moleculares envolvidas nesses efeitos inibitórios. Células PCCl3 foram tratadas com NaI (10-3M), por diferentes períodos de tempo, e avaliou-se: a meia-vida do mRNA de NIS; o papel das porções 3\'UTR/5\'UTR; o envolvimento de eventos transcricionais; a organização do citoesqueleto de actina; o conteúdo total, meia-vida, degradação, internalização e atividade de NIS; a ativação da via PI3K/Akt. Os resultados evidenciaram que o excesso de iodeto: reduz a meia-vida e interage com a porção 3\'UTR do mRNA de NIS; inibe a atividade do promotor de NIS; desorganiza o citoesqueleto de actina; reduz o conteúdo total, de membrana, a meia-vida e atividade de NIS; aumenta a internalização de NIS por clatrinas, e sua degradação por lissosomos; ativa a via PI3K/Akt. Conclui-se que o iodeto ativa diferentes mecanismos moleculares, transcricionais e pós-transcricionais, para promover o efeito inibitório sobre a expressão de NIS. / Iodide reduces NIS mRNA expression, poly(A) tail length and transcription rate, after 30 min of treatment. The present study aimed to caracterize the molecular basis involved in these inhibitory effects. PCCl3 cells were treated with NaI (10-3M) and assays were performed to evaluate: NIS transcript half-life; the role of NIS mRNA 3\'UTR/5\'UTR; the involvement of transcriptional events; the organization of actin cytoskeleton; the total content, half-life, degradation, internalization and activity of NIS; the activation of PI3K/Akt pathaway. The results indicatred that iodide excess: reduces NIS transcript half-life and interacts with its 3\'UTR portion; inhibits NIS promoter activity; disrupts the actin cytoskeleton; reduces NIS total and membrane content, NIS half-life and NIS activity; induces the internalization of NIS through clathrin and its degradation through lisosomes; activates the PI3K/Akt pathway. In conclusion, iodide activates different molecular mechanisms, transcriptional and post-transcriptional, to promoter the inhibitory effect on NIS expression.

Em eucariotos, o DNA é organizado juntamente com histonas em um complexo nucleoproteico conhecido como cromatina, cuja unidade fundamental corresponde aos nucleossomos. A cromatina apresenta-se de duas maneiras: eucromatina, região estruturalmente menos condensada e, portanto, mais facilmente transcrita, e heterocromatina, região muito condensada e transcricionalmente silenciosa. Na forma de eucromatina, o acesso dos fatores de transcrição a regiões de DNA livres de nucleossomos é facilitado, enquanto que na forma de heterocromatina os fatores de transcrição não conseguem acessar o DNA para ativar ou reprimir a expressão gênica inferindo, assim, que o grau de compactação da cromatina interfere na regulação da expressão gênica e que o nucleossomo atua como silenciador gênico. Neste contexto, os objetivos foram identificar, mapear e caracterizar regiões em eucromatina na musculatura esquelética de bovinos da raça Nelore. As análises foram realizadas em relação ao músculo Longissimus dorsi pela técnica Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-Seq), capaz de isolar regiões livres de nucleossomos a partir do mecanismo enzimático de transposição. A fim de otimizar o protocolo dessa metodologia para tecido muscular, foram testadas concentrações de 50 mil, 75 mil e 100 mil núcleos tratados com transposase. Destes, foram encontrados 6.811, 11.121 e 11.473 picos de eucromatina, respectivamente, e 6.212 regiões de cromatina aberta foram coincidentes nas três amostras. A associação entre regiões eucromáticas, expressão gênica e gordura intrasmuscular foi confirmada a partir da análise de sobreposição com transcriptional start sites (TSS), genes expressos em músculo esquelético, genes diferencialmente expressos (GDE) para gordura intramuscular e regiões de expression quantitative trait loci (eQTL) de tecido muscular reforçando, assim, o potencial regulatório das regiões de eucromatina. / In eukaryotes, DNA is organized along with histones in nucleoproteins complexes known as chromatin, which has nucleosomes as their fundamental unit. Chromatin exists in two forms: euchromatin, corresponding to a lightly condensed structure and an easily transcribed region, and heterochromatin, a highly condensed and transcriptionally silent region. In euchromatin form, transcription factors have free access to nucleosome-depleted DNA regions, while in heterochromatin the transcription factors can not access the DNA for activate or repress genic expression, which suggests that the chromatin compaction degree interferes with regulation of gene expression and that nucleosomes act as gene silencer. In this context, the aims of the present project were to identify, map and characterize euchromatin regions in the skeletal musculature of Nellore cattle. Analyzes were performed considering the muscle Longissimus dorsi using Assay for Transposase-Accessible Chromatin technique (ATAC-Seq), which isolates nucleosome-depleted regions throught transposition enzymatic mechanism. Differente transposase-treated nuclei concentrations were tested: 50 thousand, 75 thousand and 100 thousand. From these, 6.811, 11.121, and 11.473 euchromatin peaks were found, respectively, and 6.212 open chromatin regions were coincident among them. The association between euchromatic regions, gene expression and intrasmuscular fat was confirmed from the overlap analysis with transcriptional start sites (TSS), genes expressed in skeletal muscle, differentially expressed genes (GDE) for intramuscular fat and regions of expression quantitative trait loci (eQTL) of muscle tissue, reinforcing the regulatory potential of the euchromatin regions.

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria com capacidade de colonizar diversos tipos de ambiente e infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Em humanos, comporta-se como um patógeno oportunista,estando frequentemente relacionada à infecções em indivíduos imunocomprometidos e indivíduos portadores de fibrose cística. Um mecanismo importante para a versatilidade de P. aeruginosa é o sistema de percepção de quórum (QS), onde a bactéria pode vincular expressão gênica à densidade populacional e às características do ambiente. Atualmente, sabe-se que muitos outros reguladores estão interligados com QS, entre eles, a proteína reguladora RsmA e os pequenos RNAs RsmZ e RsmY. Além disso, diversos fatores importantes para a patogenicidade da bactéria são reguladas por QS. Em P. aeruginosa PA14, um fator importante para a patogenicidade em diversos hospedeiros é a proteína KerV, cujo envolvimento com QS foi descrito pela primeira vez neste trabalho. A linhagem D12, que possui uma deleção no gene kerV, mostrou alterações em fenótipos regulados por QS, como a maior produção de piocianina, composto que contribui para virulência e persistência das infecções causada por P. aeruginosa. Por ser facilmente detectável e pela regulação de sua síntese não ter sido completamente explorada em PA14, a expressão dos genes responsáveis pela produção de piocianina é um interessante repórter na investigação do possível envolvimento de KerV com QS. Além de piocianina, D12 apresenta níveis reduzidos de ramnolipídeos. Esses fenótipos somados se assemelham aos fenótipos da mutação de rsmA, sugerindo o envolvimento de KerV com os sistemas QS e Gac-Rsm direta ou indiretamente. Neste trabalho, mostramos que KerV exerce um efeito negativo na regulação dos operons phz1 e phz2, responsáveis pela síntese de piocianina, alterando a expressão desses genes. KerV exerce também um efeito positivo na expressão da proteína RsmA, responsável pela repressão de diversos genes alvos, onde RsmA se liga ao sítio de ligação ao ribossomo no mRNA, impedindo a tradução. Ensaios de gel shift mostraram que a ligação direta de RsmA na sequência líder de phzA1 e phzA2 ocorre, elucidando a maneira pela qual KerV está envolvido na regulação da expressão dos operons phz em P. aeruginosa PA14. Mostramos também que phz2 é ativo e contribui para a síntese de piocianina, pois na ausência de phz1, os níveis do pigmento são maiores do que aqueles detectados em PA14. Isso sugere uma maior expressão de phz2 e uma regulação diferencial dos operons de acordo com as condições ambientais como possível estratégia para manter os níveis desse composto. Uma evidência dessa regulação diferencial é vista no mutante lasR. Na fase inicial de crescimento, esse mutante não produz piocianina, porém quando exposto a tempos mais longos de cultivo, a produção de piocianina é maior quando comparada a PA14. Isso é reflexo da ativação da expressão de phz1 no mutante lasR em fase estacionária tardia, enquanto phz2 permanece não expresso. Isso indica que phz2 é dependente de LasR, ainda que indiretamente. Já phz1, embora tenha sua expressão influenciada por LasR no estágio inicial de crescimento, na fase estacionária é regulado por outros fatores independentes de las. / Pseudomonas aeruginosa is a gammaproteobacterium that colonizes several environments and infects phylogenetically distinct hosts. It behaves as an opportunistic pathogen in humans, often related to infection in immunocompromised individuals and cystic fibrosis patients. An important mechanism for P. aeruginosa versatility is the quorum sensing (QS) network, that allows bacteria to link gene expression to population density and environmental traits. Several additional regulators are interconnected with QS, as the regulatory mRNA binding protein RsmA and the non-coding small RNAs RsmZ and RsmY. Futhermore, key factors for pathogenicity are QS-regulated. In P. aeruginosa PA14, an important pathogenicity-related factor is the KerV protein, described for the first time here as involved in QS. D12 strain, that harbor a deletion in the kerV gene, shows alterations in QS-regulated phenotypes, such as high production of pyocyanin, a compound that contributes to virulence and persistence of P. aeruginosa infections. As the production of pyocyanin is easily detected and all mechanisms involved in its synthesis regulation are not fully described, the expression of genes responsible for production of this pigment is a good reporter to investigate KerV involvement in the QS network. Additionally, D12 also shows lower levels of rhamnolipids, another QS-regulated trait. Taken together, these phenotypes resemble the effects of a rsmA mutation, suggesting KerV involvement with QS and Gac-Rsm systems. In this work, we propose that KerV exerts a negative effect in the regulation of phz1 and phz2 operons, responsible for pyocyanin synthesis, by alterating the expression of these genes. KerV also has a positive effect on rsmA expression, responsible for the repression of several genes by blocking the ribosome binding site preventing the translation. Gel shift assays showed that RsmA binds directly in the leader sequence of phzA1 and phzA2, elucidating the manner in which KerV is involved in the regulation of phz operons expression in P. aeruginosa PA14. We also demonstrate that phz2 is actively expressed and contributes to pyocyanin production in PA14, since in the phz1 mutant the levels of pyocyanin are even higher than in the wild type strain. This suggests a phz2 higher expression and a differential regulation of phz operons according to environmental changes as a mechanism to maintain the levels of pyocyanin synthesis. An evidence for this regulation is the synthesis of pyocyanin by the lasR mutant, which does not make pyocyanin at early growth stages. However, at late stationary phase, pyocyanin production is even higher than in the wild-type strain, reflecting the LasR-independent regulation of phz1 expression, while phz2 operon remains silent.

A grande diversidade de organismos que hoje encontramos em nosso planeta se deve à adaptação às diferentes condições ambientais de cada nicho ecológico existente e à resposta adaptativa originária das mudanças dessas condições. Pode-se considerar que a etapa inicial do processo de adaptação seja a reprogramação da expressão gênica dum organismo como resposta imediata a uma nova condição ambiental. De fato parte do genoma de todos os organismos é dedicada à codificação de proteínas relacionadas ao controle dos efeitos nocivos criados por diferentes tipos de estresse como choque térmico, ou osmótico, estresse oxidativo, ou aqueles resultantes de altas concentrações de íons de metais pesados. De forma semelhante, a ausência, ou exaustão, de fontes de macronutrientes, como carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre, exige uma reorganização do padrão de expressão gênica para adequação às novas condições nutricionais, também sendo considerada um estresse ambiental. Visto que a maioria dos estudos de análise da expressão gênica em resposta a estresses ambientais realizados em fungos se refere às leveduras unicelulares Saccharomyces cerevisiae e Schizossacharomyces pombe, nos propusemos a estudar tal resposta no fungo filamentoso multicelular Trichoderma reesei. Dessa forma analisamos por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs a expressão gênica de aproximadamente 2.000 transcritos desse organismo em resposta a choque térmico, à alta concentração de íons de cádmio II e à ausência de fonte de carbono, ou nitrogênio, por período de 2 horas. Em geral, as respostas aos estresses se compuseram da regulação negativa da transcrição de genes envolvidos em processos com alta demanda de energia como a síntese protéica, evidenciada pela repressão da expressão de genes de proteínas ribossomais e do anabolismo. Em contrapartida, genes codificando proteínas relacionadas à defesa celular, como chaperonas, tiveram sua expressão induzida. As respostas ao choque térmico e ao tratamento com cádmio II se mostraram bastantes semelhantes, enquanto a ausência de fonte de nitrogênio também induziu a expressão de genes relacionados à degradação de proteínas e nucleotídeos. Genes relacionados à utilização de reservas lipídicas foram induzidos tanto na ausência de fonte de carbono quanto de nitrogênio. Foram identificados reguladores transcricionais e componentes de vias de sinalização celular com expressão diferenciada frente a esses diferentes estresses ambientais. A maior parte dos genes cuja expressão se alterou em função dos diversos estresses ambientais estudados ainda não tem função celular conhecida, sendo essa observação, portanto, uma contribuição importante para sua anotação funcional. Uma vez que o fungo filamentoso Trichoderma reesei vem se tornando um organismo de valor biotecnológico por sua característica de alto poder de síntese e secreção de proteínas, esperamos que os dados apresentados forneçam um maior entendimento dos processos celulares desse organismo e possam subsidiar futuros projetos visando uma melhor adaptação do mesmo a ambientes industriais. / The diversity of organisms found today in our planet is due to their adaptation to different environmental conditions present in each ecological niche, and to the adaptative response originated from changes in those conditions. The first step in the adaptation process is considered to be the reprogramming of gene expression as an immediate response to a new environmental condition. A fraction of the genome from all living organisms is dedicated to encoding proteins related to the control of deleterious effects created by different types of stresses like heat or osmotic shock, oxidative stress, or by the presence of high concentrations of heavy metal ions. Similarly, the absence or exhaustion of macronutrients as carbon, nitrogen, phosphorous or sulphur sources demand new patterns of gene expression in order to the organisms survive in a limited nutritional condition, which is also considered an environmental stress. Once the gene expression analyses in fungi as a response to environmental stresses have been widely studied in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizossacharomyces pombe, we proposed to study such response in the multicellular filamentous fungus Trichoderma reesei. To this purpose, we have utilized the cDNA microarray technique to analyze the gene expression of approximately 2,000 T. reesei transcripts in response to heat shock, to high concentration of cadmium II ions and to a 2-hour absence of carbon or nitrogen source. As a general response to the four studied stresses, we observed on one hand a negative transcriptional regulation of genes involved in processes that demand great amounts of energy, i.e. a negative regulation of protein synthesis, indicated by strong repression of ribosomal protein genes transcription, as well as a negative regulation of anabolism. On the other hand, genes that encode proteins associated with cellular defense, like chaperones, had their expression induced. The responses to heat shock and to cadmium poisoning were quite similar while nitrogen source absence also induced the expression of genes related to protein and nucleotide degradation. Genes implicated in the consumption of lipid reserves were induced in the absence of both carbon and nitrogen sources. We identified some transcription regulators as well as components of signal transduction pathways that have differential patterns of gene expression caused by these different environmental stresses. Most of the genes that had their expression altered in response to the studied environmental stresses has no known function yet. Their expression patterns towards such stresses are therefore an important contribution to their functional annotation. Since the filamentous fungus Trichoderma reesei has become a microorganism of biotechnological value for its high capacity of synthesis and secretion of proteins, we expect that the data presented on this work can provide a better understanding of its cellular processes and may support future projects for a better adaptation of this organism to industrial conditions.