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Discovery and function of polyomaviral microRNAs

Chen, Chun Jung, Ph. D. 10 August 2015 (has links)
Polyomaviruses are small, DNA tumor viruses that establish persistent infections in their natural hosts. Several members of the virus family are associated with human pathologies such as Progressive Multifocal Leukoencephalopathy (PML), trichodysplasia spinulosa and Merkel cell carcinoma. Polyomaviruses are one of the first virus family known to encode miRNAs. These polyomaviral miRNAs are located antisense to the early transcripts and hence, mediate the autoregulation of the viral early proteins, the T antigens. There are two major questions in the field of polyomaviral miRNAs – What is the biological significance of this miRNA-mediated autoregulation of the early transcripts? Are there other biological significant targets for these polyomaviral miRNAs? This work addressed these two questions through an evolutionary approach. First, examination of SV40 and JCV variants indicated the high conservation of the miRNAs and their autoregulatory functions. Second, miRNA-mediated autoregulation of the early transcripts is conserved in a newly discovered, evolutionarily divergent viruses, the Bandicoot papillomatosis and Carcinomatosis viruses (BPCVs). Third, by inspecting divergent members of the polyomavirus family, we have shown that some non-human polyomaviruses encode miRNAs, with the function to autoregulate the early transcripts conserved. The conservation of miRNAs both among variants of individual member and across divergent members of the polyomavirus family implies importance. More importantly, a conserved function of autoregulating the early transcript further emphasized the biological relevance of the miRNAs in polyomavirus biology. Yet, the lack of replicative differences between miRNA-expressing and miRNA-null SV40 strains during lytic infections suggests a role for the polyomaviral miRNAs under a different setting, perhaps in the establishment of persistent infection of their natural hosts. This work represents an evolutionary study of polyomaviral miRNAs that has demonstrated the conserved nature of miRNA-mediated autoregulation of the early transcripts among various members of the polyomavirus and polyoma-like virus families. These results have implicated a potential role for the polyomaviral miRNAs in the establishment of persistent infection and raised the possibility of using the JCV miRNAs as potential biomarkers as a non-invasive form of diagnostic for PML. / text
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Perfil de microRNAs diferencialmente expressos em meduloblastoma e anencefalia / Differential expression profile of microRNA in medulloblastoma and anencephaly

Lucon, Danielle Ribeiro, 1977- 31 July 2013 (has links)
Orientadores: Jose Andres Yunes, Claudia Vianna Maurer Morell, Denise Pontes Cavalcanti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médica / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucon_DanielleRibeiro_D.pdf: 6878652 bytes, checksum: 72be4de1339573c4cea11e28716998c7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Crianças com anomalias congênitas possuem um risco significativamente aumentado para desenvolver algum tipo de câncer. Anomalias do sistema nervoso central (SNC) estão associadas à maior incidência de tumores também do SNC. A comparação entre tecido 'anômalo', tecido tumoral e tecido normal pode ajudar na identificação dos genes mais importantes na carcinogênese. microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas que atuam negativamente na expressão gênica e têm papel importante no controle do desenvolvimento, diferenciação, apoptose e proliferação celular. Vários miRNAs são expressos no SNC e são conhecidos por serem dinamicamente regulados durante o neurodesenvolvimento. Recentemente, miRNAs foram associados com tumores e malformações do SNC, como o meduloblastoma (MB) e a anencefalia (AN), respectivamente. Ambos tecidos são de origem neuroectodérmica e embrionária. Neste projeto foram estudados os miRNAs diferencialmente expressos no tecido tumoral de MB desmoplástico de pacientes jovens (1-2 anos) versus cerebelo e no tecido cérebro-vascular de fetos com AN versus córtex frontal. Os controles foram obtidos de tecidos normais provenientes de autópsias de fetos e recém-nascidos. As vias gênica-metabólicas importantes na carcinogênese e morfogênese do perfil de miRNAs de MB e AN foram analisados in silico. No primeiro trabalho, apresentado no segundo capítulo, investigamos o perfil de miRNAs de MB que foi predominantemente baixo expresso (64/84 miRNAs) e regulam genes envolvidos com desenvolvimento e/ou câncer. Muitos dos miRNAs baixo expressos (32/64) foram localizados no lócus cromossômico 14q32 (miRNA 14q32). Possíveis mecanismos da baixa expressão de miRNA 14q32 foram investigados por bancos de dados públicos disponíveis. A expressão do gene receptor de estrógeno gama (ESRRG), um regulador transcricional positivo de alguns miRNAs 14q32, foi encontrada baixo expresso em MB desmoplástico. miR-129-5p (11p11.2/7q32.1), miR-206 (6p12.2) e miR-323-3p (14q32.2) foram escolhidos para estudos funcionais em células DAOY. A super expressão do miR-129-5p usando miRNA mimics diminuiu a proliferação das células DAOY. No segundo trabalho, apresentado no terceiro capítulo, analisamos o perfil de expressão de miRNAs em AN que foi predominantemente super expressos (34/52 miRNAs) e regulam genes envolvidos com defeito do tubo neural e/ou câncer. Dentre estes miRNAs estão os miR-21, 34a/c, 182, 500 cluster. miRNAs importantes no desenvolvimento do cérebro (miR-124, 128, 137, 139) foram encontrados baixo expressos nas amostras de AN. A prospecção dos genes alvos destes miRNAs mostrou que eles desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e a diferenciação neural. Por fim, nós comparamos os miRNAs diferencialmente expressos entre MB e AN e identificamos 19 miRNAs em comum (baixo expressos: miR-124, 128, 129*, 129-5p, 138, 138-1*, 138-2*, 139-3p, 490-5p, 650, 770-5p; super expressos: miR-199a-3p, 199b-3p, 199a-5p, 21, 214, 214*, 34a, 574-3p). A maioria destes miRNAs em comum encontrados nas duas patologias fazem parte dos miRNAs mais descritos em câncer e/ou são importantes no desenvolvimento do cérebro. O fato destes miRNAs estarem desregulados em duas condições diferentes (MB e AN) faz pensar que sejam funcionalmente relevantes nestas patologias. Nossos resultados indicam a correlação de assinatura de miRNAs com cada amostra destacando a heterogeneidade molecular e complexidade na sinalização celular regulada por miRNAs, e também revela que o câncer foi a via de sinalização predominante em MB e AN / Abstract: Children with birth defects have a significantly increased risk for developing some type of cancer. Anomalies of central nervous system (CNS) are associated with increased incidence of tumours also from CNS. The comparison between tissue 'anomalous', tumor tissue and normal tissue can help identify genes important in carcinogenesis. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that act negatively on gene expression and play an important role in controlling development, differentiation, apoptosis and cell proliferation. Many miRNAs are expressed in CNS and are known to be dynamically regulated in neurodevelopment. Recently, miRNAs have been associated with CNS tumors and malformations, as meduloblastoma (MB) and anencephaly (AN), respectively. Both tissues are from neuroectodermal and embryonic origins. In this project, we studied the miRNAs differential expressed in tumor tissue of desmoplastic MB of young patients (1-2 years) versus cerebellum and cerebrovascular tissue of fetal with AN versus frontal cortex. The normal tissues were obtained from fetal and newborn autopsy. The gene-metabolic pathways important in carcinogenesis and morphogenesis of miRNAs profile of MB and AN were analyzed in silico. In second chapter, we investigated the MB miRNAs profile that were predominantly downregulated (64/84 miRNAs) and regulates genes involved in development and/or cancer. Most downregulated miRNAs (32/64) were found to belong at the 14q32 locus (14q32 miRNA). Possible mechanisms of 14q32 miRNAs downregulation were investigated by the analysis of publicly available gene expression data sets. The expression of estrogen-related receptor-g (ESRRG), a reported positive transcriptional regulator of some 14q32 miRNAs, was found downregulated in desmoplastic MB. miR-129-5p (11p11.2/7q32.1), miR-206 (6p12.2), and miR-323-3p (14q32.2), were chosen for functional studies in DAOY cells. Overexpression of miR-129-5p using mimics decreased DAOY proliferation. In third chapter we investigated the AN miRNAs profile that were predominantly upregulated (34/52 miRNAs) and regulates genes involved with tube neural defects (DTN) and/or cancer. Between these miRNAs are the miR-21, 34a/c, 182, 500 cluster. miRNAs important in brain development (miR-124, 128, 137, 139) were found downregulated in AN samples. Prospecting for target genes of these miRNAs showed that they play an important role during development and neuronal differentiation. Finally, we compare the miRNAs differential expressed between MB and AN and identified 19 miRNAs in common (underexpression: miR-124, 128, 129 *, 129-5p, 138, 138-1 *, 138-2 *, 139 - 3p, 490-5p, 650, 770-5p; overexpression: miR-199a-3p, 3p-199b, 199a-5p, 21, 214, 214 *, 34a, 574-3p). Most common miRNAs found in MB and AN are known to be involved in cancer and/or are important in brain development. The fact that these miRNAs are deregulated in two different conditions (MB and AN) makes one think that they are functionally relevant in these pathologies. Our results indicate the correlation of miRNAs signature with each sample highlighting the molecular heterogeneity and cellular signaling complexity regulated by miRNAs, and also reveals that the cancer was the predominant signaling pathway in MB and AN / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas
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Evolutionary analysis of animal microRNAs

Guerra Martins dos Santos Assunção, José Afonso January 2013 (has links)
In recent years, microRNAs (miRNAs) have been recognised as important genetic regulators of gene expression in Animals and Plants. They can potentially target a large fraction of the cellular transcriptome, having been shown to be important for diverse biological processes such as development, cell differentiation, proliferation and metabolism. The publication of the Human genome in 2001 marked the start of a great community effort to sequence a variety of other species. These data have great potential for comparative genomics, that can lead to better biological understanding. Some miRNA families are known to be highly conserved, across long evolutionary distances, many found in co-transcribed clusters across the genome. While these phenomena have been previously reported, a large-scale analysis of evolutionary patterns was still lacking. Furthermore, the rate at which new relevant data is being made available makes it challenging to keep up and many of the evolutionary studies performed before are now significantly out of date. This thesis describes a number of approaches taken to analyse miRNA datasets, harnessing the full potential of currently available data for comparative genomics. These were used, not only to revisit many of the notions in the field with a larger and updated dataset, but also to develop novel strategies that enable a coherent view of miRNA evolution at different evolutionary time-scales. A new tool, described within this thesis, was developed for large-scale, species independent miRNA mapping. An assessment of the evolution of the miRNA reper- toire across species was performed, together with detailed sequence conservation analysis and miRNA family clustering. Phylogenetic profile analysis uncovered in- teresting co-evolution between miRNAs and protein coding genes. The genomic organisation of miRNAs and their conservation across species was also studied, pro- viding detailed conserved synteny maps for miRNAs and proteins across more than 80 species. Finally, at the intra-specific level, I analysed the occurrence of single nucleotide polymorphisms affecting miRNA loci or their predicted target sites. All the tools built and integrated in this research were made available to the community and designed to be easily updated, making it easier to keep up with the data that is constantly being made available. Many aspects of miRNA biology are still being uncovered, and the ability to easily put these findings into an evolutionary context will potentially be useful for the community.
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MicroRNoma do carcinoma de pâncreas

Felix, Tainara Francini January 2016 (has links)
Orientador: Patricia Pintor dos Reis / Abstract: Background: Genetic alterations were previously identified and associated with the development and progression of pancreatic carcinoma, however, identification of such alterations has not been currently used for the development of efficient treatment strategies. Therefore, the identification of other genetic and epigenetic changes, such as alterations in non-coding RNA molecules is urgently needed for the development of novel therapies. Recent studies have suggested that microRNAs (miRNAs) are frequently deregulated in several carcinomas and may contribute in the several steps of development and tumor progression. Global miRNA profiling analysis in pancreatic carcinoma and the identification of miRNA target genes may lead to new avenues for the identification of clinically applicable biomarkers. Objectives: To identify global microRNA (miRNA) expression profiles and miRNA predicted target genes in pancreatic carcinoma. Patients and Methods: 30 formalin fixed, paraffin embedded (FFPE) pancreatic carcinoma tissue samples were used, including 24 pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and 6 adenocarcinomas of Vater papilla (AMP) and their paired histologically adjacent normal tissues. Global miRNA expression profiles were determined using the TaqMan Array Human MicroRNA Cards (TLDA) (card A, v3.0) (Life Technologies) platform. Data analysis used the ExpressionSuite Software v1.0.3. Statistical analysis was performed to correlate miRNA expression with relevant clinical data, usin... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Introdução: Alterações genéticas foram previamente identificadas e associadas ao desenvolvimento e progressão dos carcinomas pancreáticos, entretanto, o conhecimento dessas alterações não resultou, até o momento, no desenvolvimento de tratamentos eficazes para os pacientes com essas neoplasias. Sendo assim, torna-se necessária e justificada a identificação de outras alterações, tais como alterações em moléculas reguladoras da expressão gênica, as quais têm o potencial de levar ao delineamento de novas terapias. Estudos recentes têm sugerido que os microRNAs (miRNAs) estão frequentemente desregulados em diversos carcinomas, e podem contribuir em várias etapas do desenvolvimento e progressão tumoral. A análise do perfil de expressão de miRNAs em carcinomas de pâncreas e genes regulados por estes miRNAs, deve fornecer novas direções para a identificação de biomarcadores que possam ser úteis na prática clínica. Objetivos: Identificar perfis globais de expressão de microRNAs (miRNAs) e potenciais genes-alvo regulados por miRNAs em carcinomas de pâncreas. Pacientes e Métodos: Foram incluídas 30 amostras de tecido, fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) de carcinoma de pâncreas, sendo 24 adenocarcinomas de ductos pancreáticos (PDAC) e 6 adenocarcinomas de papila de Vater (AMP) e os tecidos histologicamente normais, adjacentes ao tumor, correspondentes a cada caso. O perfil de expressão de miRNAs das amostras tumorais foi determinado utilizando o ensaio TaqMan Array Hum... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre
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MicroRNAs como reguladores do desenvolvimento em plantas e o papel regulatório em raízes de arroz (Oryza sativa L.) na resposta ao alumínio

Lima, Júlio César de January 2011 (has links)
Diversos trabalhos demonstram que a resposta das plantas ao alumínio é complexa. Porém, nenhum trabalho caracterizou o envolvimento de microRNAs nesta resposta. Parte deste trabalho visou caracterizar o perfil de expressão de diferentes famílias de microRNAs em resposta ao alumínio comparando-se as raízes de plantas de arroz japonica e indica. De um total de dezesseis microRNAs diferencialmente expressos, treze microRNAs tiveram a expressão reduzida e outros seis tiveram a expressão aumentada nas raízes de plantas de arroz japonica tratadas com 450 M de AlCl3 após 8h. Nas plantas de arroz indica tratadas nas mesmas condições, nove microRNAs foram detectados como diferencialmente expressos. Destes, quatro tiveram a expressão aumentada e os outros cinco tiveram a expressão reduzida. Por RT-qPCR foram confirmados dois alvos do miR528. Um dos alvos, o gene L-Ascorbato Oxidase está relacionado com a regulação da divisão celular. Sugere-se que a regulação pelo miR528 pode estar de acordo com a inibição do desenvolvimento das raízes em resposta ao alumínio em plantas sensíveis. Estes resultados demonstram que a resposta dos microRNAs ao tratamento com alumínio também é complexa, pois vários microRNAs, que provavelmente regulam alvos distintos tiveram sua expressão modulada após o tratamento das plantas. Já foi demonstrado que o desenvolvimento de raízes laterais sofre regulação por microRNAs em Arabidopsis. A outra parte deste trabalho visou caracterizar funcionalmente o miR164 e a expressão espacial de diferentes membros da família miR164 em raízes de plantas de arroz. Plantas superexpressando o miR164 apresentaram as raízes laterais reduzidas em comparação com as plantas não transformadas. Interessantemente, a análise por RT-qPCR de dois alvos do miR164 revelaram resultados inversos. A análise das plantas contendo os promotores de três genes da família miR164 fusionados ao gene repórter GUS revelou uma sobreposição da expressão espacial no órgão. Os microRNAs miR164a e miR164d localizam-se nas raízes laterais, e o miR164f está localizado nas raízes laterais e também na raiz primária. Porém, cortes transversais das raízes demonstraram que os miR164a e o miR164f localizam-se na endoderme e no estelo, respectivamente. Uma análise in silico das seqüências dos promotores dos seis membros da família miR164 e de seus respectivos alvos revelou a presença de motivos de DNA provavelmente responsivos a fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de meristemas primários. Com base nestes resultados, sugere-se que os microRNAs miR164a e miR164f devem estar regulando seus alvos em diferentes tecidos da raiz. Este resultado está de acordo com o desenvolvimento inicial das raízes laterais, pois estas se originam do periciclo componente do estelo. Os microRNAs têm função crucial ao longo do desenvolvimento e em resposta a estresses abióticos. O papel regulatório dos microRNAs reside na complexidade e diversidade das respostas a estresses abióticos e ao desenvolvimento, visto que diversos microRNAs, que provavelmente regulam distintos alvos, estão envolvidos em redes complexas na regulação da expressão gênica. / Previous works showed that the response to aluminum (Al) in plants is complex. However, at present, there is no data regarding microRNA expression in this response. Part of this work aimed to characterize the expression profile of different families of microRNAs in response to Al comparing roots of japonica and indica roots. From sixteen microRNAs differentially expressed, thirteen were down-regulated and six were upregulated in japonica rice roots treated with 450 M of AlCl3 after 8h. For the indica rice roots under the same conditions, nine microRNAs were differentially expressed. From these microRNAs, four were up-regulated and five were down-regulated. Two miR528 targets were confirmed by RT-qPCR. One of the targets is the L-AScorbate oxidase gene, which regulate cell divisions. These results help explaining rice root inhibition under Al teatment in sensitive plants. Our results suggest that microRNA response to Al is also complex, because several microRNAs that had their expression modulated probably regulate distinct target genes. It is known that lateral root development is regulated by microRNAs in Arabidopsis. The other part of this work was to characterize the miR164 function and the spatial expression of different members of the miR164 family in rice roots. Plantas overexpressing the miR164 had less lateral roots when compared to the non-transformed plants. Interestingly, the expression by RT-qPCR of two miR164 target was inverse in the miR164 overexpressing plants. The spatial expression analysis of different members of the miR164 family revealed overlapping domains. MicroRNAs miR164a and miR164d localized in the lateral roots, and miR164 is localized in lateral roots and also in primary roots. However, hand-sectioning of the miR164a and miR164f GUS fusion plants demonstrate that miR164a is expressed in the endodermis and miR164f is expressed in the stele. An in silico analysis of promoter sequences of all miR164 genes revealed the presence of DNA motifs probably responsive to transcription factors involved in the development of primary meristems. Base on these results, we suggest that different members of the miR164 family are regulating their targets in different tissues of rice roots. These results are in agreement with the initial development of lateral roots originating from the pericycle cells. The key of the regulatory role of microRNAs in response to abiotic stresses and during development brought complexity to the regulatory networks of gene expression.
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Identificação e análise de expressão de microRNAs em tecidos florais de soja (Glycine max (L.) Merrill)

Gromann, Lorrayne Gomes Molina January 2012 (has links)
A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja. / Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.
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Expressão de micrornas na hipertrofia ventricular esquerda fisiológica

Martinelli, Nidiane Carla January 2011 (has links)
Resumo não disponível
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MicroRNAs em adenocarcinoma ductal pancreático : novos biomarcadores de diagnóstico e prognóstico

Beserra, Bárbara Alemar January 2013 (has links)
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença rara, mas possui uma taxa de incidência muito próxima à taxa de letalidade. Parte da alta mortalidade do ADP se deve ao diagnóstico difícil (muitas vezes somente possível com análise de tecido pancreático) e tardio da doença, que geralmente acontece com o tumor já em estágio avançado. Assim, a descoberta de biomarcadores não-invasivos surge como uma possibilidade de diagnóstico mais seguro e, de preferência, precoce. Recentemente descobriuse que os microRNAS (miRNAs - pequenos RNAs não-codificantes, envolvidos na iniciação e na manutenção de tumores, incluindo o ADP) são estáveis em amostras circulantes, e a diferença em seus níveis de expressão pode discriminar com acurácia a presença ou ausência de determinadas doenças. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de seis miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b e -376a) escolhidos de acordo com dados prévios da literatura, em amostras de soro e saliva de pacientes com e sem ADP, e também em tecido tumoral e não-tumoral de pacientes com ADP. Esta avaliação comparativa teve como objetivo verificar a presença de biomarcadores de diagnóstico, e possivelmente de prognóstico, neste perfil. Os níveis de expressão foram mensurados através de quantificação relativa, por PCR quantitativo em tempo real. Embora os níveis de expressão tenham se mostrado elevados em todas as amostras de tecido tumoral em relação ao tecido não-tumoral, esta diferença não foi significativa. Isso pode ser explicado pelo pequeno tamanho amostral, pela heterogeneidade tumoral e tecidual e pela ampla variabilidade de expressão dos miRNAs. Em amostras de soro, miR-21 e miR-34a foram significativamente mais expressos em pacientes com ADP e ambos foram capazes de discriminar pacientes com e sem doença com sensibilidade e especificidades clinicamente aceitáveis. Nosso estudo mostrou ainda que existe uma correlação forte e positiva entre os níveis de expressão destes dois miRNAs em amostras de soro e tecido, embora o mecanismo responsável por esta correlação seja desconhecido. A ausência de correlação de miR-21 e de miR-34a, quando analisados individualmente em amostras de soro e tecido pareadas, sugere que diferentes mecanismos regulam a expressão destes miRNAs em diferentes tecidos. Nas amostras de saliva, de modo geral, os níveis de miRNA foram muito baixos, e mesmo os miRNA detectáveis não apresentaram valores de expressão significativamente diferentes entre casos e controles. Tais achados sugerem que os miRNAs escolhidos neste estudo não são biomarcadores salivares adequados para diagnóstico, embora seja necessário uma confirmação destes dados em uma série maior de casos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rare disease, whose incidence rates are very close to mortality rates. Part of the high mortality of PDAC is due to its difficult (often only possible with pancreatic tissue analysis) and late diagnosis, when disease is at an advanced stage. Thus, the discovery of noninvasive diagnostic biomarkers emerges as a possibility to perform a safe diagnosis, preferably early in the disease course. Recently, microRNAs (miRNAs - small non-coding RNAs involved in tumors initiation and maintenance, including PDAC) were discovered as stable molecules in circulating samples. Several studies have shown that the difference in their expression levels between cases and controls can accurately discriminate the presence or absence of certain diseases. In this study, we evaluated the expression levels of six miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b and -376a), chosen according to previous literature data, in serum and saliva samples from patients with and without PDAC, and also in non-tumoral and tumoral tissue. The aim of our study was to investigate the presence of diagnostic and/or prognostic biomarkers. Expression levels were measured by relative quantification using real-time quantitative PCR. Although expression levels were increased in tumor tissues, this difference did not reach significance. This can be explained by the small sample size and the heterogeneity of tumor and tissue, beyond the already described wide variability in miRNAs expression levels. In serum, miR-21 and miR-34a were significantly more expressed in samples from patients with ADP and both were able to distinguish patients with and without disease with clinically acceptable sensitivity and specificity. Our study also showed that there is a strong positive correlation between the expression levels of these two miRNAs in serum and tissue. However, the mechanism related to this correlation remains unknown. The absence of correlation between each miR-21 and miR-34a individually, when matched serum and tissue samples were compared, indicates that different mechanisms regulate the expression of these miRNAs in different body compartments. In saliva samples, generally, miRNA levels were very low, and no difference in miRNA expression levels was seen between cases and controls. These findings suggest that the chosen miRNAs are not adequate as diagnostic biomarkers in saliva, although these findings require confirmation in a larger series of cases.
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MicroRNAs de sementes de soja maduras e em germinação e Transfer RNA- derived Fragments (tRFs) associados a proteínas argonautas de Arabidopsis / MicroRNAs from mature and germinating soybean seeds and transfer RNA-derived fragments (TRFS) associated with argonaute proteins in arabidopsis

Morais, Guilherme Loss de January 2013 (has links)
O advento de técnicas de sequenciamento de alta eficiência possibilitou o estudo mais aprofundado de pequenos RNAs, como os microRNAs (miRNAs), a classe melhor caracterizada, e a identificação de novas classes como a dos transfer RNA-derived Fragments (tRFs). Os pequenos RNAs podem atuar como reguladores negativos da expressão gênica do seu transcrito alvo. Este mecanismo, denominado Silenciamento Gênico Pós-Transcricional (PTGS) ou RNA interferência (RNAi), pode ocorrer pela indução da clivagem do transcrito alvo, ou pela repressão da tradução do mesmo. Em soja, ainda não foram descritos miRNAs atuantes na germinação da semente, os quais foram abordados no primeiro capítulo desta tese. Utilizando duas bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência, uma relativa a sementes maduras e outra composta de uma combinação de sementes em germinação (3, 5 e 7 dias), foram identificados um total de 178 microRNAs, sendo 36 inéditos. Dos 178, 8 miRNAs com alvos potencialmente relacionados à germinação da semente, às rotas de auxina, giberelina, metabolismo lipídico, de nitrogênio e homeostase de potencial redox, foram validados por análise de degradoma. O segundo capítulo aborda a caracterização de tRFs em Arabidopsis associados com proteínas Argonauta (AGO), as quais são essenciais ao RNAi. Foram utilizadas 26 bibliotecas de sequenciamento de argonautas imunoprecipitadas (AGO-IP), relativas às AGOs 1, 2, 4, 5, 7 e 9, além de 3 bibliotecas de degradoma. O mapeamento destas sequências nos tRNAs de Arabidopsis revelou que estes pequenos RNAs são majoritariamente associados a AGO1 e 2, sendo a classe 5' de 19 nucleotídeos de comprimento a mais comum. Contudo, estes não obedecem aos critérios de direcionamento a proteínas AGO relativos ao primeiro nucleotídeo do pequeno RNA, como ocorre com miRNAs. Foram identificados quatro transcritos alvos, validados por análise do degradoma, os quais possivelmente sofrem PTGS via tRFs. Ambos os capítulos apresentam uma robusta caracterização in silico de pequenos RNAs em plantas inferindo suas possíveis funções. Contudo, mais experimentos devem ser efetuados para confirmação de seus papeis em soja e Arabidopsis. / The advent of the deep sequencing approach enabled a better characterization of small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), the well-known small RNA class, and the identification of new classes like the transfer RNA-derived Fragments (tRFs). The small RNAs can act as negative regulators of gene expression of their target transcript. This mechanism, known as Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS), involves dicing of the target transcript, or translational repression. In soybean, the microRNAs acting on seed germination are unknown. These miRNAs were described in the first chapter of this thesis. Using two deep sequencing libraries, relative to the mature seeds and a combination of germinating seeds (3, 5 and 7 days). A total of 178 miRNAs were identified, including 36 new ones. Eight miRNAs had targets potentially related to seed germination including some acting on auxin and gibberellin pathways, lipid and nitrogen metabolism and redox homeostasis, and were validated by degradome analysis. The second chapter showed the characterization of Argonaut (AGO) associated tRFs in Arabidopsis. AGO is an essential protein for PTGS. A total of 26 deep sequencing libraries from immunoprecipitated Argonauts (AGO-IP), relative to the AGO 1, 2, 4, 7, and 9, plus 3 degradome libraries were used. The tRFs were mainly associated with AGO1 and 2, and the 5' class of 19 nucleotides in length was the most common one. However the tRFs did not follow the rule for AGO loading, were the first nucleotide lead the microRNA to a specific AGO. We identified four tRF target transcripts validated by degradome analysis, which possibly undergo the PTGS pathway. Both chapters present a robust in silico characterization of small RNAs in plants, inferring their possible functions. However, more experiments should be performed to confirm their roles in soybean and Arabidopsis.
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MicroRNAs circulantes como biomarcadores da insuficiência cardíaca descompensada

Schneider, Stéfanie Ingrid dos Reis January 2014 (has links)
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