Introdução: O Meduloblastoma (MB) é o tumor sólido maligno mais comum do sistema nervoso central em crianças. Corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos, surge no cerebelo e sua origem é embrionária, sendo altamente invasivo. Como tratamento padrão usa-se a ressecção cirúrgica do tumor, quimioterapia e radioterapia crânio-espinhal; porém, a taxa de sobrevida livre de eventos (SLE) em cinco anos para os pacientes de baixo risco é de aproximadamente 70% e a maioria dos pacientes que sobrevivem sofre de efeitos secundários a longo prazo. Portanto, crescem as buscas por novos tratamentos que apresentem menores efeitos colaterais ou que diminuam/eliminem a necessidade de radiação. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão da doença, entre eles, a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs). Essas moléculas regulam diversos processos biológicos, exercendo regulação gênica negativa a nível pós-transcricional; no entanto, seu papel em MB ainda é pouco explorado. Objetivo: Avaliar o perfil de expressão de miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes portadores de MB e correlacionar seus níveis de expressão com características clínicas dos pacientes, assim como identificar possíveis marcadores de prognóstico. Metodologia: Foram selecionados 15 miRNAs a partir de dados prévios obtidos pela técnica de microarranjo. Foi realizada a expressão desses miRNAs por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e feita a comparação com as características clínicas, utilizando amostras de pacientes portadores de MB adultos e pediátricos (N=51) e amostras de cerebelos não neoplásicos fetais (N=10) e não fetais (N=7). A comparação entre os grupos foi feita por teste de Mann-Whitney e a análise de sobrevida livre de eventos (SLE) e sobrevida global (SG) por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para avaliação dos fatores prognósticos. Resultados: Os miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485-5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais e não fetais; o miR-31-5p está hipoexpresso e o miR-199a-5p está hiperexpresso nos tumores em relação ao cerebelos não fetais; o miR-202-3p e o miR-650 estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais. Além disso, os miRNAsmiR-199a-5p e -329 estãoshipoexpressos em pacientes menores que 3 anos, com relação aos maiores de 3 anos; os miRNAs miR-202-3p, -329, -491-4p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes que tiveram grau de ressecção completo do tumor, em comparação aos que tiveram grau incompleto; e os miRNAs miR-202-3p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes classificados como baixo risco em comparação aos classificados como alto risco. Adicionalmente, o miR-211-5p está hipoexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos; e o miR-512-3p está hiperexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos. Expressão do miR-211-5p foi fator prognóstico independente para SLE quando analisada com as variáveis expressão do miR-512-3p e grupo de risco por modelo de regressão de Cox. Conclusão: É possível observar um padrão diferencial de expressão desses miRNAs no MB, podendo ser biomarcadores importantes para esta doença. Estudos futuros serão realizados para investigar o papel desses miRNAs na progressão desse tumor. / Introduction: Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumor of the central nervous system in children,and it arises in the cerebellum with an embrionary origin. MB corresponds to approximately 20% of all pediatric intracranial tumors, and it is highly invasive. The standard treatment relies on tumor surgical resection, chemotherapy and craniospinal radiotherapy; however, the five years event-free survival for low-risk patients is approximately 70%, and most survival patients suffer from long-term side effects. Thus, the search for new treatments with fewer side effects or aiming to reduce/eliminate radiation is of great interest. Several factors contribute to the development and progression of this disease, among them the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs). These molecules regulate diverse biological processes, exerting negative regulation in gene expression at posttranscriptional level, however its role in MB is still poorly explored. Objective: Evaluate the profile of differentially expressed miRNAs in MB samples, correlate their expression levels with patients clinical features, and identify potential prognostic markers. Material and methods: 15 miRNAs were selected based on previous data obtained from a large-scale gene expression analysis using the microarray assay. It was performed their expression and compared with the clinical features of the patients by RT-qPCR. For this, it was used pediatric and adult patients samples (n=51) diagnosed with MB and non-neoplastic fetal (n=10) and non fetal (n=7) cerebellum samples. The comparison between groups was performed by Mann-Whitney test and event-free survival (EFS) analysis and overall survival (OS) by Kaplan-Meier and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to evaluate the prognostic factors. Results: The miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485- 5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p are downregulated in tumors when compared to fetal and nonfetal cerebellum; miR-31-5p is downregulated and miR-199a-5p is upregulated only in tumors compared to non-fetal cerebellum; miR-202-3p and miR-650 are downregulated in tumors only when compared to fetal cerebellum. In addition, miR-199a-5p and miR-329 are downregulated in patients under 3 years old compared to those who are higher than 3 year; miR-202-3p,miR-329, miR-491-5p and miR-512-3p are downregulated in patients who had complete tumor resection compared to those who had incomplete tumor resection; and miR- 202-3p and miR-512-3p are downregulated in low risk patients compared to high risk patients. In addition, miR-211-5p is downregulated and miR-512-3p is upregulated in patients with a poorer event-free survival and overall survival. The expression of miR-211-5p was an independent prognostic factor for EFS when analyzed with the variables miR-512-3p expression and risk group by Cox regression model Conclusion: It is possible to observe a differential pattern of expression of these miRNAs in MB and they may be important biomarkers for this disease. Further studies will be conducted to investigate the role of these miRNAs in the progression of this tumor.

Introdução: Os meningiomas são neoplasias intracranianas de crescimento lento que se originam das células meningoteliais da aracnoide e representam os tumores intracranianos mais comuns, contabilizando 13-26% deste total, sendo um dos primeiros tumores sólidos a terem alterações genéticas identificadas. Inúmeros tem sido os avanços para a melhor compreensão das vias moleculares correlacionadas com a tumorigênese e progressão tumoral dos meningiomas, neste contexto tem se destacado o papel dos microRNAs que são RNAs não-codificantes (ncRNAs) constituídos por 19 a 25 nucleotídeos, cuja função é o silenciamento do RNAm em nível póstranscricional. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi avaliar a expressão tecidual e plasmática dos miRNAs miR-181d, miR-181c e miR-130a. Pacientes e métodos: Os miRNAs miR-181d, miR-181c e miR-130a foram selecionados a partir de estudo prévio do nosso grupo pela técnica de análise em larga escala de microarrays, onde foram comparados meningiomas grau I com amostras controles de aracnóides. Neste trabalho foi avaliada expressão destes miRNAs no tecido tumoral e plasma de meningiomas grau I, II e III. Resultados: O miR-181d apresentou-se hiperexpresso nos grupos estudados, no tecido tumoral quanto no plasma. O nível de expressão foi maior de acordo com a progressão do grau do tumor. Os miR-181c e miR-130a não apresentaram diferença estatística nos grupos estudados em ambos tecido tumoral e plasma. Conclusões: O miR-181d tem potencial para ser utilizado como biomarcador para meningiomas e está associado com sua progressão tumoral. / Introduction: Meningiomas are intracranial tumors of slow growth that originate from meningothelial arachnoid cells and represents the most common intracranial tumors, accounting for 13-26% of this total, beeing one of the first solid tumors to have identified genetic alterations There are technological advances available to a better understanding of the molecular pathways correlated with tumorigenesis and tumor progression of meningiomas. The role of microRNAs in this process is very importante. MicroRNAs are non-coding RNAs (ncRNAs) consisting of 19 to 25 nucleotides, with function of mRNA silencing post-transcriptional level. The aim of our study was to evaluate the tissue expression and plasma of miRNAs miR-181d, miR-181c and miR-130a. Patients and methods: The miRNAs miR-181d, miR-181c and miR-130a were selected from a previous study of our group by analysis technique on large scale called microarrays, which were compared meningiomas grade I with arachnoid controls samples. In this study, we evaluated expression of these miRNAs in tumor tissue and plasma meningiomas grade I, II and III. Results: The miR-181d was presented upregulated in the all groups in both tumor tissue and in plasma. The level of expression was increased according to the progression of tumor grade. The miR-181c and miR-130a showed no statistical difference in the groups studied in both tumor tissue and plasma. Conclusions: The miR-181d has potential as a biomarker for meningiomas and is associated with tumor progression.

SIMTar (SNPs Interfering in MicroRNA Targets) é uma ferramenta computacional que realiza a predição de interferência de SNPs em sítios alvos de miRNAs. Dada uma lista de SNPs, SIMTar analisa uma janela ao redor de cada SNP e verifica se tal SNP cria ou rompe um sítio de miRNA utilizando como base programas de predição de sítios de miRNAs nos vários alelos desta janela. Se o resultado da predição para um dado miRNA é diferente para diferentes alelos, então tal SNP está potencialmente interferindo em tal sítio. O presente trabalho teve como objetivo melhorar o processo de identificação de interferência de SNPs em sítios alvos de miRNAs, usando um novo programa de predição de sítios de miRNAs, assim como a incorporação de resultados biológicos experimentais. A hipótese deste trabalho é que com estas modificações poderia-se diminuir a expectativa de falsos positivos sem diminuir a sensibilidade. Os resultados obtidos validam a hipótese e ainda mostram que o SIMTar possui vantagens quando comparado com outras ferramentas ou bancos de dados de propósito similar. / SIMTar (SNPs Interfering in MicroRNA Targets) is a computational tool that performs the prediction of SNPs interference in miRNA target sites. Given a list of SNPs, SIMTar analyzes a window around each SNP and checks whether such SNP creates or breaks a miRNA site based on miRNA target prediction programs in the various alleles of this window. If the prediction result for a given miRNA is different for different alleles, then such SNP is potentially interfering in such site. The present study had the aim to improve the SNPs interference identification in miRNA sites, using a new prediction program of miRNAs targets, as well as the incorporation of experimental biological results. The hypothesis of this study is that with these modifications the expectation of false positives could be reduced without diminishing the sensitivity. The results obtained validate the hypothesis and also show that the SIMTar has advantages when compared to other tools or databases with similar purpose.

A hipertrofia cardíaca é um dos principais mecanismos de adaptação do coração frente a uma sobrecarga de trabalho e pode advir de estímulos patológicos como a hipertensão arterial levando a um prejuízo funcional ou por estímulos fisiológicos como o treinamento físico que por outro lado, promove adaptações benéficas no coração. Na última década uma nova classe de moléculas, os miRNAs, vem sendo estudada como reguladores da expressão gênica em diversos tipos celulares, inclusive os cardiomiócitos. Entretanto, estudos sobre a participação de miRNAs nas adaptações induzidas pelo treinamento físico ainda são escassos. O presente trabalho teve como principal objetivo avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio no perfil de expressão de miRNAs no coração de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) bem como selecionar miRNAs com padrão alterado no SHR e revertido pelo treinamento físico e analisar seu papel funcional através de aplicativos de bioinformática. Os animais foram divididos em três grupos: ratos espontaneamente hipertensos sedentários (SHR-S), SHR treinados (SHR-T) e um grupo normotenso sedentário (WKY-S). O grupo SHR-T desempenhou um protocolo de treinamento de natação de 60 minutos, 5 vezes por semana durante 10 semanas e com um sobrecarga de 5% do peso corporal na cauda. Foram feitas análises hemodinâmicas (pressão arterial, PA e freqüência cardíaca de repouso, FC), funcionais (capacidade física, consumo de oxigênio, ecocardiograma), bioquímicas a expressão de miRNAs (microarray, Real Time-PCR) e computacionais (predição de alvos e anotação de vias de sinalização). Os principais resultados foram: 1. A PA e FC reduziu no grupo SHR-T em relação aos animais sedentários; 2. A capacidade de tolerância ao esforço, VO2 pico aumentou no grupo SHR-T; 3. Análise ecocardiográfica mostrou que a onda E, Onda A e razão E/A melhoram no grupo SHR-T. 4. Análise de microarray encontrou 6 diferentes padrões no perfil de expressão de miRNAs na comparação dos grupos WKY-S, SHR-S e SHR-T; 5. 6 miRNAs alterados no SHR-S tiveram sua expressão revertida no SHR-T (miR-1, 22, 27a, 27b, 29c e 451); 7. Análise bioinformática mostrou que esse grupo de miRNAs tem como alvo predito diversas vias de sinalização relacionados com o remodelamento cardíaco como MAPK, TGF-beta e Wnt, além de vias relacionadas com estrutura do citoesqueleto e metabolismo energético. Em conclusão, nossos resultados sugerem que os miRNAs: 1, 22, 27a, 27b, 29c e 451 podem estar governando vias de sinalização celular envolvidas no processos de reversão do quadro patológico. Esse fato abre novas perspectivas a respeito da utilização dessas moléculas como forma de terapias / Cardiac hypertrophy is a major mechanism of adaptation of the heart by the increased workload and may result from pathological stimuli such as high blood pressure leading to functional impairment or by physiological stimuli such as physical training, that on other hand promotes beneficial adaptations on the heart. In the last decade a new class of molecules, miRNAs, has been studied as regulators of gene expression in different cell type, including cardiomyocytes. However, few studies have investigated the miRNAs involved in adaptations to physical training. This study aimed to evaluate the effect of aerobic exercise training on expression profiling of miRNAs in the heart of spontaneously hypertensive rats (SHR) as well as select miRNAs with altered pattern in SHR and reversed by physical training and analyze their functional role through bioinformatics applications. The animals were divided into 3 groups: sedentary hypertensive rats (SHR-S), trained SHR (SHR-T) and sedentary Wistar Kyoto rats (WKY-S). The SHR-T group performed a swimming training protocol of 60 minutes, 5 times a week for 10 weeks and with overload of 5% of body weight in the tail. We analyzed hemodynamic (blood pressure, BP and resting heart rate, HR), functional (physical capacity, oxygen consumption and echocardiogram), biochemical (microarray and Real Time-PCR to miRNAs) and computational (prediction of targets and annotation cell signaling pathways) parameters. The main findings were: 1. The BP and HR decreased in SHR-T group compared to the sedentary animals; 2. The exercise tolerance and peak VO2 increased in SHR-T group; 3.Echocardiographic analysis showed that the E wave, A wave and E/A ratio improved in SHR-T group; 4. Microarray analysis found six different miRNAs expression profile in the comparison groups WKY-S, SHR-S and SHR-T; 5. Six miRNAs were altered in SHR-S and were reversed in the SHR-T (miR-1,22, 27a, 27b, 29c and 451); 7. Bioinformatics analysis showed that this miRNA cluster has multiple predicted targets in signaling pathways related to cardiac remodeling as MAPK, Wnt and TGF-beta and others genes associate to cytoskeletal structure and energetic metabolism. In conclusion, our results suggest that miRNAs: 1, 22, 27a, 27b, 29c and 451 can be controlling cell signaling pathways involved in the process of reversing the disease. These results open new perspectives on the use of these molecules as a therapeutic treatment

INTRODUÇÃO: As adaptações cardiovasculares decorrentes do treinamento físico aeróbio de natação são bem descritas na literatura, entre ela temos a angiogênese. O treinamento físico aeróbio é um dos estímulos que promove angiogênese. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNA não codificadora de proteínas de diferentes células em diversos tecidos e estão envolvidos em processos angiogênicos, mas o papel dos miRNAs na angiogênese cardíaca decorrente ao treinamento aeróbico ainda não foi esclarecido. OBJETIVO: Analisar os efeitos de diferentes volumes de treinamento físico de natação sobre a expressão de microRNAs envolvidos na angiogênese cardíaca de ratos. MATERIAIS E MÉTODOS: Ratas Wistar (n=21) foram divididas em grupos Sedentário (SC), Treinado 1 (P1): natação 60min/dia, 5x/sem/10sem, com 5% de sobrecarga, Treinado 2 (P2): mesmo protocolo P1 até a 8ªsem, 9ªsem 2x/dia, e na 10ªsem 3x/dia. Após o período de treinamento, os corações foram retirados e o RNA total foi isolado para a análise da expressão de miRNAs no coração por microarray de miRNA e os miR-126, -let-7f, -221 e -222 foram confirmados por RT-PCR em tempo real. Analisamos ainda os alvos do miR-126, Spred-1 e PI3KR2, e a expressão de proteínas que compõem as vias de sinalização em que esses alvos interferem por Western Blotting. Avaliamos também: Frequência cardíaca (FC) e pressão arterial (PA) por pletismografia caudal, VO2 pico, hipertrofia cárdica (HC) pelo peso do Ventrículo esquerdo/Peso corporal (mg/g), razão capilar/fibra (C/F) por histologia, expressão proteica de VEGF e seus receptores. RESULTADOS: O treinamento aeróbico diminuiu a FC sem alterar a PA, VO2 pico aumentou 11% e 15% em P1 e P2, a HC foi de 17% e 30% em P1 e P2, a razão C/F aumentou 57% e 100% em P1 e P2, acompanhada de um aumento da expressão de VEGF (P1 =42%, P2 =109%). A expressão do miR-let-7f foi aumentada em P2 (140%) comparado aos outros dois grupos (SC = 100%; P1 = 113%), o miR- 221 teve sua expressão diminuida em ambos os grupos treinados comparados xiii ao grupo SC (SC = 100%; P1 = 71%; P2 = 74%), o miR-222 não apresentou diferença na sua expressão entre os grupos (SC = 100%; P1 = 76%; P2 = 81%) e a expressão do miR-126 foi aumentada em P1 (126%) e P2 (142%) comparados ao grupo SC, a expressão de ambos os alvos desse miRNA foi diminuida nos grupos treinados (Spred-1 SC = 100 ± 12,4; P1 = 60 ± 5,6; P2 = 61 ± 8,4; PI3KR2 100 ± 12,3; P1 = 61 ± 12,3; P2 = 21 ± 7,1). Essa diminuição da expressão dos alvos desse miRNA favoreceu um aumento da expressão de proteínas pertencentes as vias de sinalização da PIK3 e MAPKs. CONCLUSÃO: O treinamento aeróbico foi eficaz em promover um aumento da angiogênese cardíaca comprovada por uma maior razão capilar/fibra no coração dos animais treinados e por maior expressão proteica de VEGF, sendo ainda mais evidente nos animais que realizaram um maior volume de treinamento. Os miRNAs relacionados à angiogênese parecem estar envolvidos na regulação desse processo. Além disso, o miR-126 parece ser um dos principais miRNAs envolvidos nesse processo / INTRODUCTION: The cardiovascular adaptations resulting from aerobic physical swimming training are well described in the literature, between these adaptations we have the angiogenesis. The aerobic physical training is one of the stimulus that promotes angiogenesis. The micro RNAs are a class of non coding protein RNAs of different cells in different tissues and are involved in angiogenic processes, but the role of micro RNAs in cardiac angiogenesis due to aerobic training is not clear. OBJECTIVE: To analyze the effects of different volumes of swimming physical training on the expression of micro RNAs involved in angiogenesis in heart of rats. MATERIALS AND METHODS: Wistar female rats (n=21) were divided into groups Sedentary (SC), Trained 1 (P1): 60min/day swimming, 5x/week/10weeks with 5% overload, Trained 2 (P2): same protocol of P1 until the 8th week, 9th week 2x/day, and at 10th week 3x/day. After the training period, the hearts were removed and the total RNA was isolated to analyze the miRNAs expression in the heart by microarray of miRNA and the miRs-126, -let-7f, -221 and -222 were confirmed by real time RT-PCR. We also analyzed the targets miR-126, Spred-1 and PI3KR2, and the protein expression that form the signaling pathways that affect those targets by Western Blotting. We evaluated: heart rate (HR) and blood pressure (BP) by tail plethysmography, peak VO2, cardiac hypertrophy (CH) by weight left ventricle/ corporal weight (mg/g), capillary/fiber (C/P) ratio for histology, VEGF protein expression and its receptors. RESULTS: The aerobic training decreased the HR without change the BP, peak VO2 increased 11% and 15% in P1 and P2, the HR was 17% and 30% in P1 and P2, the ratio C/F increased 57% and 100% in P1 and P2, followed by an increase of VEGF expression (P1=42%, P2=109%). The miR-let-7f had its expression increased in P2 (140%) compared to the other two groups (SC = 100%; P1 = 113%), o miR-221 had its expression decreased in both trained groups compared to SC group (SC = 100%; P1 = 71%; P2 = 74%), the miR-222 showed no difference on its expression between the groups (SC = 100%; P1 = 76%; P2 = 81%) and the miR-126 expression xv was higher in P1 (126%) and P2 (142%) compared to SC group, the expression of both targets of this miRNA was decreased on trained groups (Spred-1 SC = 100 ± 12,4; P1 = 60 ± 5,6; P2 = 61 ± 8,4; PI3KR2 100 ± 12,3; P1 = 61 ± 12,3; P2 = 21 ± 7,1). This decrease of expression of this miRNA targets favor an increase of protein expression belonging to the PIK3 and MAPKs signaling pathways. CONCLUSIONS: The aerobic training was effective on promoting an increased of cardiac angiogenesis comproved by a higher ratio capillary/ fiber on the heart of trained animals and by a higher VEGF protein expression, being even more evident in animals that realized a higher volume training. The miRNAs related to angiogenesis seem to be involved in the regulation of this process. Besides that, the miR-126 seems to be one of the principal miRNA involved on this process

Introdução: Os meningiomas são neoplasias intracranianas de crescimento lento que se originam das células meningoteliais da aracnoide e representam os tumores intracranianos mais comuns, contabilizando 13-26% deste total, sendo um dos primeiros tumores sólidos a terem alterações genéticas identificadas. Inúmeros tem sido os avanços para a melhor compreensão das vias moleculares correlacionadas com a tumorigênese e progressão tumoral dos meningiomas, neste contexto tem se destacado o papel dos microRNAs que são RNAs não-codificantes (ncRNAs) constituídos por 19 a 25 nucleotídeos, cuja função é o silenciamento do RNAm em nível póstranscricional. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi avaliar a expressão tecidual e plasmática dos miRNAs miR-181d, miR-181c e miR-130a. Pacientes e métodos: Os miRNAs miR-181d, miR-181c e miR-130a foram selecionados a partir de estudo prévio do nosso grupo pela técnica de análise em larga escala de microarrays, onde foram comparados meningiomas grau I com amostras controles de aracnóides. Neste trabalho foi avaliada expressão destes miRNAs no tecido tumoral e plasma de meningiomas grau I, II e III. Resultados: O miR-181d apresentou-se hiperexpresso nos grupos estudados, no tecido tumoral quanto no plasma. O nível de expressão foi maior de acordo com a progressão do grau do tumor. Os miR-181c e miR-130a não apresentaram diferença estatística nos grupos estudados em ambos tecido tumoral e plasma. Conclusões: O miR-181d tem potencial para ser utilizado como biomarcador para meningiomas e está associado com sua progressão tumoral. / Introduction: Meningiomas are intracranial tumors of slow growth that originate from meningothelial arachnoid cells and represents the most common intracranial tumors, accounting for 13-26% of this total, beeing one of the first solid tumors to have identified genetic alterations There are technological advances available to a better understanding of the molecular pathways correlated with tumorigenesis and tumor progression of meningiomas. The role of microRNAs in this process is very importante. MicroRNAs are non-coding RNAs (ncRNAs) consisting of 19 to 25 nucleotides, with function of mRNA silencing post-transcriptional level. The aim of our study was to evaluate the tissue expression and plasma of miRNAs miR-181d, miR-181c and miR-130a. Patients and methods: The miRNAs miR-181d, miR-181c and miR-130a were selected from a previous study of our group by analysis technique on large scale called microarrays, which were compared meningiomas grade I with arachnoid controls samples. In this study, we evaluated expression of these miRNAs in tumor tissue and plasma meningiomas grade I, II and III. Results: The miR-181d was presented upregulated in the all groups in both tumor tissue and in plasma. The level of expression was increased according to the progression of tumor grade. The miR-181c and miR-130a showed no statistical difference in the groups studied in both tumor tissue and plasma. Conclusions: The miR-181d has potential as a biomarker for meningiomas and is associated with tumor progression.

Orientadores: Eliana Cotta de Faria, Helena Coutinho Franco de Oliveira, Daniel Zanetti Scherrer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zago_VanessaHelenadeSouza_D.pdf: 5059555 bytes, checksum: 854d9d1d1674a14d2ebcf5798acc31b3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Dado o importante papel desempenhado pelos transportadores ATP binding cassete A1 (ABCA1), G1 (ABCG1), G5 (ABCG5), G8 (ABCG8) e pelo scavenger receptor class B type I (SR-BI) para a homeostase corpórea de colesterol e desenvolvimento da aterosclerose, este trabalho se propôs a: (i) investigar a relação dos polimorfismos rs2275543 (ABCA1), rs1893590 (ABCG1), rs6720173 (ABCG5), rs6544718 (ABCG8) e rs5888 (SCARB1) com gênero, idade e índice de massa corpórea (IMC) e suas interações sobre variáveis clínicas e bioquímicas (n=654); (ii) determinar a repercussão destes polimorfismos sobre os parâmetros estudados na população total e de forma gênero-específica (n=590) e (iii) avaliar se os miRNAs hsa-miR-33a e hsa-miR-128a são diferencialmente expressos em um subgrupo da população (n=51) e averiguar sua associação com as concentrações plasmáticas do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL-C), aterosclerose subclínica e expressão de ABCA1, ABCG1 e SCARB1. Para tanto, foram selecionados voluntários normolipidêmicos e assintomáticos, de ambos os gêneros, com idade entre 20 e 75 anos. Dados clínicos e antropométricos foram obtidos, assim como sangue venoso periférico para as determinações bioquímicas e extração de DNA e RNA. O subgrupo de 51 voluntários foi classificado de acordo com HDL-C (mg/dL) em hipoalfalipoproteinêmicos (hipo, HDL-C?39), hiperalfalipoproteinêmicos (hiper, HDL-C?68) e controles (CTL, HDL-C?40<68) e determinadas a espessura íntimo-medial das artérias carótidas e proteínas relacionadas ao metabolismo de HDL. Determinamos que o rs1893590 interage com a idade e o IMC, modulando as concentrações de HDL-C, bem como o tamanho e volume da partícula, sugerindo que este pode modificar seu metabolismo e composição. Nas análises comparativas o rs2275543 apresentou efeitos diferentes, porém benéficos para ambos os gêneros; adicionalmente, o rs6720173 determinou um fenótipo lipoproteico proaterogênico no gênero masculino, enquanto as variantes rs5888 e rs6544718 repercutiram sobre marcadores de adiposidade no gênero feminino. A análise dos cinco polimorfismos nesta população fornece evidências de que estes atuam em diferentes vias do metabolismo lipoproteico, e tem na maioria dos casos características gênero-específicas. Adicionalmente, a avaliação da expressão de hsa-miR-33a, hsa-miR-128a, ABCA1, ABCG1 e SCARB1 revelou que os indivíduos hiper apresentam um aumento da expressão de ABCA1 e ABCG1 em relação ao grupo CTL, somado a uma redução de 72% na expressão do hsa-miR-33a; em conjunto, estes resultados indicam um potencial papel regulatório deste miRNA em indivíduos assintomáticos, possivelmente contribuindo para o aumento do efluxo e do transporte reverso de colesterol / Abstract: Given the important role played by ATP binding cassete transporters A1 (ABCA1), G1 (ABCG1), G5 (ABCG5), G8 (ABCG8) and by scavenger receptor class B type I (SR-BI) on body cholesterol homeostasis and atherosclerosis development, this study proposes to: (i) investigate the relationship of polymorphisms rs2275543 (ABCA1), rs1893590 (ABCG1), rs6720173 (ABCG5), rs6544718 (ABCG8) e rs5888 (SCARB1) with gender, age and body mass index (BMI) and its interactions with clinical and biochemical variables (n=654); (ii) determine the effects of these polymorphisms on the studied parameters in the total population and in a gender-specific manner (n=590) and (iii) evaluate if miRNAs hsa-miR-33a e hsa-miR-128a are differentially expressed in a subgroup of the population (n=51) and verify its association with plasma levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), subclinical atherosclerosis plus ABCA1, ABCG1 and SCARB1 expression. Thus, normolipidemic and asymptomatic volunteers from both genders, with ages ranging from 20 to 75 years were selected. Clinical and anthropometric data were obtained, as well as peripheral venous blood for biochemical determinations plus DNA and RNA extraction. The subgroup of 51 individuals was classified according HDL-C (mg/dL) in hypoalphalipoproteinemics (hypo, HDL-C?39), hyperalphalipoproteinemics (hyper, HDL-C?68) and controls (CTL, HDL-C?40<68); then, were determinated the carotid intima-media thickness and proteins related to HDL metabolism. The polymorphism rs1893590 interacts with age and BMI, modulating HDL-C levels as well as the particle size and volume, suggesting its role on HDL metabolism and composition. Comparative analysis demonstrated that rs2275543 has different, but beneficial repercussions in both genders; furthermore, rs6720173 determines a pro-atherogenic lipoprotein profile in males, while the variants rs5888 and rs6544718 affect positively adiposity markers in females. The analyses of the five studied polymorphism in this population provide evidences of its role in several pathways of lipoproteins metabolism, in most cases in a gender-specific manner. Moreover, the ABCA1, ABCG1, SCARB1, hsa-miR-33a and hsa-miR-128a expression analysis revealed that hyper group presents a significant increase of ABCA1 and ABCG1 expression in relation to the control group; additionally, hsa-miR-33a decreased by 72%. Together, these results indicate a potential regulatory role of this miRNA in asymptomatic individuals, probably contributing to increased cholesterol efflux and reverse cholesterol transport / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Com base na interação especifica entre o fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e o 5’ CAP monometilguanosina (MMGcap) do mRNA foi desenvolvido um eficiente sistema para purificação de mRNA usando um mutante da proteína humana eIF4E. Apesar de o MMGcap ser o mais comum nos mRNAs eucarióticos, em nematoides e platelmintos devido ao processo de trans-splicing há também a presença do 5’ CAP trimetilguanosina (TMGcap). Tendo em vista a capacidade única da eIF4E de helmintos em interagir com ambos MMGcap e TMGcap, nesse trabalho foram analisadas as sequências peptídicas das eIF4E de platelmintos e a aplicação da proteína recombinante eIF4E de Echinococcus granulosus como uma ferramenta para o enriquecimento de amostras com mRNAs a partir de RNA total do parasito. As sequências preditas das eIF4E de platelmintos foram obtidas para 18 platelmintos parasitos e apenas uma isoforma da proteína foi encontrada em cada organismo. Na análise filogenética, essas proteínas formaram um ramo único e divergente, inclusive dos platelmintos de vida livre. A sequência codificante da proteína eIF4E de E. granulosus foi clonada por recombinação in vivo e a proteína recombinante (EgReIF4E) em fusão com a glutationa S-transferase (GST) foi expressa em Escherichia coli. A proteína em fusão foi recuperada a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade, sendo obtido o rendimento de 12,8 mg de proteína por 1 L de cultura. No ensaio de captura de mRNAs através do 5’ CAP pela GST-EgReIF4E foi usado RNA total de E. granulosus e de E. ortleppi. A capacidade da EgReIF4E em capturar mRNAs foi avaliada por RT-qPCR de forma comparativa ao RNA total e aos resultados obtidos de um kit comercial de Oligo-dT. Foram avaliados tanto os genes relacionados ao processo de trans-splicing como os genes que não passam por este processo. Também foi avaliado a presença dos rRNAs nas amostras. Nossos dados preliminares indicam que a EgReIF4E foi capaz de purificar os mRNAs e reduzir os níveis dos rRNAs. Porém, houve perdas significativas de mRNAs, que precisam ser corrigidas. Apesar de promissora para platelmintos, a aplicação dessa metodologia precisa ser melhor padronizada visando o aumento do rendimento global do sistema. / Based on the specific interaction between the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) and the mRNA 5 'CAP monometilguanosina (MMGcap), an efficient system for mRNA purification using a mutant of the human protein eIF4E has been developed. Despite of the MMGcap be the most common in eukaryotic mRNAs, in in parasitic nematodes and flatworms due to the trans-splicing process there is also the 5 'CAP trimetilguanosina (TMGcap). Due to this peculiarity and unique ability of the helminthes eIF4E in interacting with both MMGcap and TMGcap, in this work was analyzed the sequences of eIF4E from flatworms and evaluated the using of eIF4E from E. granulosus (Eg-eIF4E) be used as a tool for purification of mRNA derived from total RNA of the parasite. The predicted sequence of the eIF4E flatworms was obtained for 18 parasitic flatworms and only one protein isoform was found for each species. In phylogenetic analysis of these proteins was formed a unique and divergent branch, even when compared with the free-living flatworms. The coding sequence of the E. granulosus eIF4E protein was cloned by in vivo recombination and the recombinant protein (EgReIF4E) fused to glutathione S-transferase (GST) was expressed using Escherichia coli. The fusion protein was recovered from the soluble fraction by affinity chromatography and the yield was 12.8 mg of protein per 1 L of culture. For the mRNAs capture assay using the 5 'CAP by GST-EgReIF4E were used total RNA from E. granulosus and E. ortleppi. The ability of EgReIF4E to capture mRNAs was evaluated by RT-qPCR compared with the total RNA and the results obtained with the commercial Oligo-dT kit. For comparison and analyzed were selected both genes related to trans-splice process as genes that do not undergo this process. The levels of rRNAs in the samples were also assessed. Our preliminary data indicate that EgReIF4E was able to purify the mRNAs and reduce the levels of rRNA. However, there was a significant loss in the level of mRNAs and it need to be adjusted. Despite of being a promising for flatworms, the implementation of this alternative methodology should be further standardized to increase the overall efficiency of the system.

O genoma humano tem um tamano aproximado de 3,2 Gb e aproximadamente 74% das suas sequências são transcritas em RNAs. Destes transcritos, cerca de 33 mil não são traduzidos em proteínas, desempenhando seu papel funcional na célula na forma de RNAs. Dentre os trancritos que não codificam proteínas estão os lncRNAs, os pseudogenes e os circRNAs. Inicialmente considerados como ruídos transcricionais, esses RNAs têm chamado cada vez mais a atenção da comunidade científica e têm sido atribuídos a um série de funções celulares. Apesar do crescente número de trabalhos enfocando estes RNAs, pouco se sabe sobre essas moléculas em células-tronco embrionárias (CTEs) humanas, tanto no que se refere ao conjunto de moléculas expressas quanto sobre a função por elas desempenhada. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo identificar os lncRNAs, pseudogenes e circRNAs expressos em células-tronco embrionárias humanas a partir de dados de RNA-seq depositados no banco de dados GEO e inferir, através de ferramentas de bioinformática, as possíveis funções desempenhadas por estas moléculas no estado tronco. As análises revelaram, ao todo 1182 ncRNAs pertencentes as três classes em estudo (lncRNA, n=317; pseudogene, n=585; e circRNA, n=280) no conjunto de dados principal. Quando este foi comparado a outros conjuntos de dados, 87 lncRNAs, 51 pseudogenes e 10 circRNAs foram detectados como transcritos comuns. Dentre os lncRNAs e os pseudogenes, 15 foram selecionados para inferência de função pela abordagem de guilty by association. Foi possível associar RNA selecionados a processos como splicing, organização de cromatina, mitose, ciclo celular, biogênese de ribossomos, reparo de DNA e resposta ao dano, apoptose, organização do citoesqueleto, desenvolvimento embrionário e regulação da diferenciação celular. Além disso, alguns dos RNAs em estudo mostraram-se fortes candidatos a atuarem como competidores endógenos de mRNAs expressos em CTEs. Análises de correlação, de força de ligação ao miRNA e do tipo de seed do sítio de ligação apontaram os pares de mRNAs e ncRNAs AHCY-RP11-253E3.3, F2RL1-EEF1A1P6, HSPD1-SNHG5, INO80-RP11-20D14.6, PARP1-RP11-20D14.6 e PRIM2-GAS5, juntamente com o RNA circular circ-HIPK3, como os RNAs com maior potencial para competirem pelos miRNAs expressos em CTEs. Estes resultados voltam a atenção da pesquisa básica para uma parte pouco conhecida da biologia das CTEs e direcionam futuros experimentos visando a elucidação da função de ncRNAs nesse contexto celular. Ensaios de modulação da expressão dos ncRNAs e a observação concomitante da respostas dos RNAs e proteínas a eles relacionados são o próximo passo para desvendar os mecanismos moleculares através dos quais estes RNAs desempenham seus papeis em CTEs. / The human genome has an average size of 3.2 Gb and approximately 74% of its sequences are transcribed into RNAs. From this transcripts, around 33 thousand are not translated into proteins, performing their cellular roles as RNAs molecules. Among the non-protein coding transcripts are the lncRNAs, the pseudogenes and the circRNAs. Inicially thought to be transcription noise, these molecules have been drawing attention of the scientific comunity and several cellular functions have been attributed to them. Although the rising number of studies focusing on these RNAs, little is known about them in human embryonic stem cells (ESCs), includind the set of expressed non-coding RNAs (ncRNA) and their functions. In this sense, this study aimed to identify lncRNAs, pseudogenes and circRNAs expressed in human ESCs from RNA-seq data deposited in GEO public database and infer, through bioinformatic tools, the possible functions played by these molecules in the stem state. The analyzis revealed 1182 ncRNAs belonging to the three classes (lncRNA, n=317; pseudogene, n=585; and circRNA, n=280) studied in the main dataset. When compared to other datasets, 87 lncRNAs, 51 pseudogenes and 10 circRNAs were detected as common to all datasets. Among the lncRNAs and the pseudogenes, 15 were selected for function inference through the guilty by association method. It was possible to associate the selected RNAs to cellular processes as RNA splicing, chromatin organization, mitosis, cell cycle, ribosome biogenesis, DNA repair and DNA damage response, apoptosis, cytoskeletton organization, embryonic development and regulation of cell differentiation. Moreover, some of the RNAs showed to be strong candidates to act as endogenous competitors of the ESCs-expressed mRNAs. Pearson correlation analysis and investigation of the miRNA seed type and binding strenght indicate the following ncRNA-mRNA pairs AHCY-RP11-253E3.3, F2RL1-EEF1A1P6, HSPD1-SNHG5, INO80-RP11-20D14.6, PARP1-RP11-20D14.6 e PRIM2-GAS5, together with the circular RNA circ-HIPK3, as the RNAs with major potential to act as competing endogenous RNAs in ESCs. These results shift the attentions to a poorly known part of ESCs biology and give directions to future experiments aiming to elucidate the ncRNAs function in this cellular context. ncRNAs expression modulation assays and the concomitant observation of the positively correlated mRNAs response to these alterations are the next step in the unraveling of the specific molecular mechanisms through which ncRNAs exert their roles in ESCs.

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