Em eucariotos, o DNA é organizado juntamente com histonas em um complexo nucleoproteico conhecido como cromatina, cuja unidade fundamental corresponde aos nucleossomos. A cromatina apresenta-se de duas maneiras: eucromatina, região estruturalmente menos condensada e, portanto, mais facilmente transcrita, e heterocromatina, região muito condensada e transcricionalmente silenciosa. Na forma de eucromatina, o acesso dos fatores de transcrição a regiões de DNA livres de nucleossomos é facilitado, enquanto que na forma de heterocromatina os fatores de transcrição não conseguem acessar o DNA para ativar ou reprimir a expressão gênica inferindo, assim, que o grau de compactação da cromatina interfere na regulação da expressão gênica e que o nucleossomo atua como silenciador gênico. Neste contexto, os objetivos foram identificar, mapear e caracterizar regiões em eucromatina na musculatura esquelética de bovinos da raça Nelore. As análises foram realizadas em relação ao músculo Longissimus dorsi pela técnica Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-Seq), capaz de isolar regiões livres de nucleossomos a partir do mecanismo enzimático de transposição. A fim de otimizar o protocolo dessa metodologia para tecido muscular, foram testadas concentrações de 50 mil, 75 mil e 100 mil núcleos tratados com transposase. Destes, foram encontrados 6.811, 11.121 e 11.473 picos de eucromatina, respectivamente, e 6.212 regiões de cromatina aberta foram coincidentes nas três amostras. A associação entre regiões eucromáticas, expressão gênica e gordura intrasmuscular foi confirmada a partir da análise de sobreposição com transcriptional start sites (TSS), genes expressos em músculo esquelético, genes diferencialmente expressos (GDE) para gordura intramuscular e regiões de expression quantitative trait loci (eQTL) de tecido muscular reforçando, assim, o potencial regulatório das regiões de eucromatina. / In eukaryotes, DNA is organized along with histones in nucleoproteins complexes known as chromatin, which has nucleosomes as their fundamental unit. Chromatin exists in two forms: euchromatin, corresponding to a lightly condensed structure and an easily transcribed region, and heterochromatin, a highly condensed and transcriptionally silent region. In euchromatin form, transcription factors have free access to nucleosome-depleted DNA regions, while in heterochromatin the transcription factors can not access the DNA for activate or repress genic expression, which suggests that the chromatin compaction degree interferes with regulation of gene expression and that nucleosomes act as gene silencer. In this context, the aims of the present project were to identify, map and characterize euchromatin regions in the skeletal musculature of Nellore cattle. Analyzes were performed considering the muscle Longissimus dorsi using Assay for Transposase-Accessible Chromatin technique (ATAC-Seq), which isolates nucleosome-depleted regions throught transposition enzymatic mechanism. Differente transposase-treated nuclei concentrations were tested: 50 thousand, 75 thousand and 100 thousand. From these, 6.811, 11.121, and 11.473 euchromatin peaks were found, respectively, and 6.212 open chromatin regions were coincident among them. The association between euchromatic regions, gene expression and intrasmuscular fat was confirmed from the overlap analysis with transcriptional start sites (TSS), genes expressed in skeletal muscle, differentially expressed genes (GDE) for intramuscular fat and regions of expression quantitative trait loci (eQTL) of muscle tissue, reinforcing the regulatory potential of the euchromatin regions.

A grande diversidade de organismos que hoje encontramos em nosso planeta se deve à adaptação às diferentes condições ambientais de cada nicho ecológico existente e à resposta adaptativa originária das mudanças dessas condições. Pode-se considerar que a etapa inicial do processo de adaptação seja a reprogramação da expressão gênica dum organismo como resposta imediata a uma nova condição ambiental. De fato parte do genoma de todos os organismos é dedicada à codificação de proteínas relacionadas ao controle dos efeitos nocivos criados por diferentes tipos de estresse como choque térmico, ou osmótico, estresse oxidativo, ou aqueles resultantes de altas concentrações de íons de metais pesados. De forma semelhante, a ausência, ou exaustão, de fontes de macronutrientes, como carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre, exige uma reorganização do padrão de expressão gênica para adequação às novas condições nutricionais, também sendo considerada um estresse ambiental. Visto que a maioria dos estudos de análise da expressão gênica em resposta a estresses ambientais realizados em fungos se refere às leveduras unicelulares Saccharomyces cerevisiae e Schizossacharomyces pombe, nos propusemos a estudar tal resposta no fungo filamentoso multicelular Trichoderma reesei. Dessa forma analisamos por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs a expressão gênica de aproximadamente 2.000 transcritos desse organismo em resposta a choque térmico, à alta concentração de íons de cádmio II e à ausência de fonte de carbono, ou nitrogênio, por período de 2 horas. Em geral, as respostas aos estresses se compuseram da regulação negativa da transcrição de genes envolvidos em processos com alta demanda de energia como a síntese protéica, evidenciada pela repressão da expressão de genes de proteínas ribossomais e do anabolismo. Em contrapartida, genes codificando proteínas relacionadas à defesa celular, como chaperonas, tiveram sua expressão induzida. As respostas ao choque térmico e ao tratamento com cádmio II se mostraram bastantes semelhantes, enquanto a ausência de fonte de nitrogênio também induziu a expressão de genes relacionados à degradação de proteínas e nucleotídeos. Genes relacionados à utilização de reservas lipídicas foram induzidos tanto na ausência de fonte de carbono quanto de nitrogênio. Foram identificados reguladores transcricionais e componentes de vias de sinalização celular com expressão diferenciada frente a esses diferentes estresses ambientais. A maior parte dos genes cuja expressão se alterou em função dos diversos estresses ambientais estudados ainda não tem função celular conhecida, sendo essa observação, portanto, uma contribuição importante para sua anotação funcional. Uma vez que o fungo filamentoso Trichoderma reesei vem se tornando um organismo de valor biotecnológico por sua característica de alto poder de síntese e secreção de proteínas, esperamos que os dados apresentados forneçam um maior entendimento dos processos celulares desse organismo e possam subsidiar futuros projetos visando uma melhor adaptação do mesmo a ambientes industriais. / The diversity of organisms found today in our planet is due to their adaptation to different environmental conditions present in each ecological niche, and to the adaptative response originated from changes in those conditions. The first step in the adaptation process is considered to be the reprogramming of gene expression as an immediate response to a new environmental condition. A fraction of the genome from all living organisms is dedicated to encoding proteins related to the control of deleterious effects created by different types of stresses like heat or osmotic shock, oxidative stress, or by the presence of high concentrations of heavy metal ions. Similarly, the absence or exhaustion of macronutrients as carbon, nitrogen, phosphorous or sulphur sources demand new patterns of gene expression in order to the organisms survive in a limited nutritional condition, which is also considered an environmental stress. Once the gene expression analyses in fungi as a response to environmental stresses have been widely studied in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizossacharomyces pombe, we proposed to study such response in the multicellular filamentous fungus Trichoderma reesei. To this purpose, we have utilized the cDNA microarray technique to analyze the gene expression of approximately 2,000 T. reesei transcripts in response to heat shock, to high concentration of cadmium II ions and to a 2-hour absence of carbon or nitrogen source. As a general response to the four studied stresses, we observed on one hand a negative transcriptional regulation of genes involved in processes that demand great amounts of energy, i.e. a negative regulation of protein synthesis, indicated by strong repression of ribosomal protein genes transcription, as well as a negative regulation of anabolism. On the other hand, genes that encode proteins associated with cellular defense, like chaperones, had their expression induced. The responses to heat shock and to cadmium poisoning were quite similar while nitrogen source absence also induced the expression of genes related to protein and nucleotide degradation. Genes implicated in the consumption of lipid reserves were induced in the absence of both carbon and nitrogen sources. We identified some transcription regulators as well as components of signal transduction pathways that have differential patterns of gene expression caused by these different environmental stresses. Most of the genes that had their expression altered in response to the studied environmental stresses has no known function yet. Their expression patterns towards such stresses are therefore an important contribution to their functional annotation. Since the filamentous fungus Trichoderma reesei has become a microorganism of biotechnological value for its high capacity of synthesis and secretion of proteins, we expect that the data presented on this work can provide a better understanding of its cellular processes and may support future projects for a better adaptation of this organism to industrial conditions.

Em eucariotos, o DNA é organizado juntamente com histonas em um complexo nucleoproteico conhecido como cromatina, cuja unidade fundamental corresponde aos nucleossomos. A cromatina apresenta-se de duas maneiras: eucromatina, região estruturalmente menos condensada e, portanto, mais facilmente transcrita, e heterocromatina, região muito condensada e transcricionalmente silenciosa. Na forma de eucromatina, o acesso dos fatores de transcrição a regiões de DNA livres de nucleossomos é facilitado, enquanto que na forma de heterocromatina os fatores de transcrição não conseguem acessar o DNA para ativar ou reprimir a expressão gênica inferindo, assim, que o grau de compactação da cromatina interfere na regulação da expressão gênica e que o nucleossomo atua como silenciador gênico. Neste contexto, os objetivos foram identificar, mapear e caracterizar regiões em eucromatina na musculatura esquelética de bovinos da raça Nelore. As análises foram realizadas em relação ao músculo Longissimus dorsi pela técnica Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-Seq), capaz de isolar regiões livres de nucleossomos a partir do mecanismo enzimático de transposição. A fim de otimizar o protocolo dessa metodologia para tecido muscular, foram testadas concentrações de 50 mil, 75 mil e 100 mil núcleos tratados com transposase. Destes, foram encontrados 6.811, 11.121 e 11.473 picos de eucromatina, respectivamente, e 6.212 regiões de cromatina aberta foram coincidentes nas três amostras. A associação entre regiões eucromáticas, expressão gênica e gordura intrasmuscular foi confirmada a partir da análise de sobreposição com transcriptional start sites (TSS), genes expressos em músculo esquelético, genes diferencialmente expressos (GDE) para gordura intramuscular e regiões de expression quantitative trait loci (eQTL) de tecido muscular reforçando, assim, o potencial regulatório das regiões de eucromatina. / In eukaryotes, DNA is organized along with histones in nucleoproteins complexes known as chromatin, which has nucleosomes as their fundamental unit. Chromatin exists in two forms: euchromatin, corresponding to a lightly condensed structure and an easily transcribed region, and heterochromatin, a highly condensed and transcriptionally silent region. In euchromatin form, transcription factors have free access to nucleosome-depleted DNA regions, while in heterochromatin the transcription factors can not access the DNA for activate or repress genic expression, which suggests that the chromatin compaction degree interferes with regulation of gene expression and that nucleosomes act as gene silencer. In this context, the aims of the present project were to identify, map and characterize euchromatin regions in the skeletal musculature of Nellore cattle. Analyzes were performed considering the muscle Longissimus dorsi using Assay for Transposase-Accessible Chromatin technique (ATAC-Seq), which isolates nucleosome-depleted regions throught transposition enzymatic mechanism. Differente transposase-treated nuclei concentrations were tested: 50 thousand, 75 thousand and 100 thousand. From these, 6.811, 11.121, and 11.473 euchromatin peaks were found, respectively, and 6.212 open chromatin regions were coincident among them. The association between euchromatic regions, gene expression and intrasmuscular fat was confirmed from the overlap analysis with transcriptional start sites (TSS), genes expressed in skeletal muscle, differentially expressed genes (GDE) for intramuscular fat and regions of expression quantitative trait loci (eQTL) of muscle tissue, reinforcing the regulatory potential of the euchromatin regions.

A grande diversidade de organismos que hoje encontramos em nosso planeta se deve à adaptação às diferentes condições ambientais de cada nicho ecológico existente e à resposta adaptativa originária das mudanças dessas condições. Pode-se considerar que a etapa inicial do processo de adaptação seja a reprogramação da expressão gênica dum organismo como resposta imediata a uma nova condição ambiental. De fato parte do genoma de todos os organismos é dedicada à codificação de proteínas relacionadas ao controle dos efeitos nocivos criados por diferentes tipos de estresse como choque térmico, ou osmótico, estresse oxidativo, ou aqueles resultantes de altas concentrações de íons de metais pesados. De forma semelhante, a ausência, ou exaustão, de fontes de macronutrientes, como carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre, exige uma reorganização do padrão de expressão gênica para adequação às novas condições nutricionais, também sendo considerada um estresse ambiental. Visto que a maioria dos estudos de análise da expressão gênica em resposta a estresses ambientais realizados em fungos se refere às leveduras unicelulares Saccharomyces cerevisiae e Schizossacharomyces pombe, nos propusemos a estudar tal resposta no fungo filamentoso multicelular Trichoderma reesei. Dessa forma analisamos por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs a expressão gênica de aproximadamente 2.000 transcritos desse organismo em resposta a choque térmico, à alta concentração de íons de cádmio II e à ausência de fonte de carbono, ou nitrogênio, por período de 2 horas. Em geral, as respostas aos estresses se compuseram da regulação negativa da transcrição de genes envolvidos em processos com alta demanda de energia como a síntese protéica, evidenciada pela repressão da expressão de genes de proteínas ribossomais e do anabolismo. Em contrapartida, genes codificando proteínas relacionadas à defesa celular, como chaperonas, tiveram sua expressão induzida. As respostas ao choque térmico e ao tratamento com cádmio II se mostraram bastantes semelhantes, enquanto a ausência de fonte de nitrogênio também induziu a expressão de genes relacionados à degradação de proteínas e nucleotídeos. Genes relacionados à utilização de reservas lipídicas foram induzidos tanto na ausência de fonte de carbono quanto de nitrogênio. Foram identificados reguladores transcricionais e componentes de vias de sinalização celular com expressão diferenciada frente a esses diferentes estresses ambientais. A maior parte dos genes cuja expressão se alterou em função dos diversos estresses ambientais estudados ainda não tem função celular conhecida, sendo essa observação, portanto, uma contribuição importante para sua anotação funcional. Uma vez que o fungo filamentoso Trichoderma reesei vem se tornando um organismo de valor biotecnológico por sua característica de alto poder de síntese e secreção de proteínas, esperamos que os dados apresentados forneçam um maior entendimento dos processos celulares desse organismo e possam subsidiar futuros projetos visando uma melhor adaptação do mesmo a ambientes industriais. / The diversity of organisms found today in our planet is due to their adaptation to different environmental conditions present in each ecological niche, and to the adaptative response originated from changes in those conditions. The first step in the adaptation process is considered to be the reprogramming of gene expression as an immediate response to a new environmental condition. A fraction of the genome from all living organisms is dedicated to encoding proteins related to the control of deleterious effects created by different types of stresses like heat or osmotic shock, oxidative stress, or by the presence of high concentrations of heavy metal ions. Similarly, the absence or exhaustion of macronutrients as carbon, nitrogen, phosphorous or sulphur sources demand new patterns of gene expression in order to the organisms survive in a limited nutritional condition, which is also considered an environmental stress. Once the gene expression analyses in fungi as a response to environmental stresses have been widely studied in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizossacharomyces pombe, we proposed to study such response in the multicellular filamentous fungus Trichoderma reesei. To this purpose, we have utilized the cDNA microarray technique to analyze the gene expression of approximately 2,000 T. reesei transcripts in response to heat shock, to high concentration of cadmium II ions and to a 2-hour absence of carbon or nitrogen source. As a general response to the four studied stresses, we observed on one hand a negative transcriptional regulation of genes involved in processes that demand great amounts of energy, i.e. a negative regulation of protein synthesis, indicated by strong repression of ribosomal protein genes transcription, as well as a negative regulation of anabolism. On the other hand, genes that encode proteins associated with cellular defense, like chaperones, had their expression induced. The responses to heat shock and to cadmium poisoning were quite similar while nitrogen source absence also induced the expression of genes related to protein and nucleotide degradation. Genes implicated in the consumption of lipid reserves were induced in the absence of both carbon and nitrogen sources. We identified some transcription regulators as well as components of signal transduction pathways that have differential patterns of gene expression caused by these different environmental stresses. Most of the genes that had their expression altered in response to the studied environmental stresses has no known function yet. Their expression patterns towards such stresses are therefore an important contribution to their functional annotation. Since the filamentous fungus Trichoderma reesei has become a microorganism of biotechnological value for its high capacity of synthesis and secretion of proteins, we expect that the data presented on this work can provide a better understanding of its cellular processes and may support future projects for a better adaptation of this organism to industrial conditions.

A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.

Le facteur bactérien Rho est une ARN hélicase toroïdale utilisant l’énergie issue de l’hydrolyse d’ATP pour transloquer le long de brins ARN et dissocier les obstacles moléculaires se trouvant sur son chemin. La fonction majeure de Rho est de provoquer la terminaison de la transcription. Les nombreuses études du facteur Rho d’E. coli (EcRho) ont montré que l’enzyme se fixe aux régions nues des transcrits naissants au niveau de sites Rut (Rho utilization) et utilise son activité de translocase ATPase-dépendante pour rattraper l’ARN polymérase et provoquer la dissociation du complexe d’élongation de la transcription. EcRho est impliquée dans 20 à 50 % des évènements de terminaison de la transcription chez E. coli et contribue à la régulation globale ainsi qu’à la protection du génome bactérien via divers mécanismes complexes. Le spectre d’activité restreint de la Bicyclomycine (BCM) – un antibiotique inhibant la fonction ATPase de Rho – suggère que Rho, bien qu’essentielle chez la plupart des espèces Gram- comme E. coli, est superflue chez la plupart des espèces Gram+. Pour vérifier cette hypothèse et mieux comprendre l’importance de Rho au sein de la diversité bactérienne, nous avons évalué la distribution et la conservation phylogénétique de Rho en utilisant les banques publiques de données génomiques et protéomiques. Nous avons observé que ~92% des espèces analysées (représentant la plupart des phyla bactérien) possèdent Rho (ou un gène rho) et que la présence de ce dernier semble être corrélée avec la complexité du génome, du programme de régulation et de l’écosystème de la bactérie. Cette complexité est illustrée par notre découverte que la protéine régulatrice CsrA contrôle la terminaison Rho-dépendante dans la partie 5’ UTR de l’opéron pgaABCD dont l’expression est critique pour la formation de biofilms par E. coli. En parallèle de ce travail, nous avons testé la proposition récente que le facteur Rho de Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) opère par un mécanisme atypique indépendant de son activité ATPase, ce qui le rendrait insensible à la BCM. Nos résultats réfutent cette hypothèse et démontrent sans équivoque que MtbRho utilise un mécanisme similaire à celui de EcRho, pouvant être inhibé par la BCM (mais nécessitant des doses particulièrement élevées). L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles informations illuminant le rôle, le mécanisme et l’importance de Rho au sein de la biodiversité et conforte Rho comme cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques. / The bacterial Rho factor is a ring-shaped, hexameric RNA helicase which uses the energy derived from ATP hydrolysis to translocate along RNA strands, disrupting molecular roadblocks in its way. A major function of Rho is to induce termination of transcription. Extensive studies of the prototypical Rho factor from E. coli (EcRho) indicate that the enzyme binds naked regions of nascent RNA transcripts at the level of Rut (Rho utilization) sites and, then, uses its ATPase-dependent translocase activity to catch up with RNA polymerase and to trigger dissociation of the transcription elongation complex. EcRho is implicated in 20 to 50 % of all transcription termination events in E. coli and contributes to the global regulation and protection of the bacterial genome through various sophisticated mechanisms. The limited spectrum of activity of the antibiotic Bicyclomycin (BCM) – an inhibitor of Rho’s ATPase – suggests that Rho, while critical in many Gram- species such as E. coli, is dispensable in most Gram+ species. To verify this assumption and better understand the importance of Rho across the biodiversity, we assessed the phylogenetic distribution and conservation of Rho using public ‘omics’ databases. We found Rho (or a rho ORF) in ~92% of analyzed species (representing most bacterial phyla), its presence seemingly related to the complexity of the bacterial genome, regulatory program, and ecosystem. An illustration of this complexity is our discovery that regulatory protein CsrA mediates Rho-dependent termination in the 5’UTR of the pgaABCD operon whose expression is critical for biofilm formation by E. coli. In parallel, we tested the recent proposal that the Rho factor of Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) operates by an atypical, ATPase-independent mechanism that would make it immune to BCM. Our results rule out this possibility and unambiguously show that MtbRho uses a mechanism similar to that of EcRho, one that can be inhibited by BCM (albeit at unusually high concentrations). Overall, this work provides key, new information to better understand the role, mechanism, and importance of Rho across the bacterial diversity and endorses Rho as a promising target for the development of new antibiotics.

Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.