Les ribosomes sont les molécules présentes dans toutes les cellules du règne vivant. Ils résultent de l'assemblage d'ARN ribosomiques (ARNr) et de protéines ribosomiques, constituant des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Ils jouent un rôle majeur en décodant l'information génétique contenue dans les ARN messagers (ARNm) afin de les traduire en protéines lors du processus de traduction. La production des ribosomes chez les eucaryotes est initiée par la transcription par l'ARN pol I d'un pré-ARNr ribosomique (pré-ARNr) précurseur des ARNr matures 18S, 5.8S et 25S/28S, qui sera modifié chimiquement et digéré par des endo- et exoribonucléases pour aboutir aux ARNr matures. Le pré-ARNr en cours de synthèse s'associe avec des protéines ribosomiques, des petites particules ribonucléoprotéiques (snoRNP) et des protéines dites " non ribosomiques " conduisant à l'assemblage de la particule 90S initiale. Cette particule est ensuite scindée en particules pré-ribosomiques pré-40S et pré-60S, qui vont suivre des voies de maturation indépendantes pour aboutir aux sous unités ribosomiques 40S et 60S mature. La production des ribosomes eucaryotes requiert l'intervention de plus de 200 protéines dites " non ribosomiques ", qui s'associent avec les particules pré-ribosomiques et sont absentes des ribosomes cytoplasmiques matures. Des données obtenues en collaboration suggèrent que cinq protéines non-ribosomiques impliquées dans les étapes précoces de la formation de la grande sous-unité ribosomique, Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment un complexe en l'absence d'ARN ribosomique. Il s'agirait du plus gros complexe connu composé uniquement de protéines, requis pour la formation des sous unités ribosomiques. Nop8p contient un domaine de liaison à l'ARN et pourrait permettre de fixer le complexe au pré-ARNr, et Dbp6p est une potentielle ARN hélicase. Les composants du complexe pourraient constituer des régulateurs et/ou des cibles de Dbp6p. Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer si les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment effectivement un complexe en dehors des pré-ribosomes, de caractériser les interactions protéine/protéine au sein du complexe et sa structure et d'étudier les fonctions de ses composants. Au cours de ma thèse, j'ai mis en évidence que Nop8p, Dbp6p et Rsa3p sont associées aux pré-ARNr 35S, 32S et 27SA2 et font donc partie des mêmes particules pré-ribosomiques que Npa1p et Npa2p. Les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p et Rsa3p forment un complexe stable, qui persiste une fois dissocié des particules pré-ribosomiques. L'observation au microscope électronique à transmission des complexes purifiés révèle la présence de deux types de complexes de tailles différentes. Par ailleurs, l'hélicase Dbp6p interagit avec ce complexe, mais de manière plus labile car elle en est dissociée en présence d'une forte concentration en magnésium. Les analyses de déplétion de chaque membre du complexe montrent que l'absence de Nop8p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Npa2p et Rsa3p, et que l'absence de Npa2p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Nop8p et Rsa3p. En revanche, l'absence de Npa1p déstabilise totalement le complexe. La perte d'expression de Dbp6p affecte également l'efficacité de co-précipitation de ces pré-ARNr, mais dans une moindre mesure. En parallèle, nous avons débuté une étude des interactions protéine/protéine qui s'établissent entre les membres du complexe. Des données préliminaires suggèrent des interactions directes entre Npa1p, Npa2p et Dbp6p et entre Npa1p et Rsa3p. Nous avons également commencé à effectuer des tests d'activité in vitro de l'hélicase Dbp6p qui suggèrent qu'elle présente une activité ATPase. Enfin, nous avons également localisé le site de fixation sur le pré-ARNr de Npa1p situé à proximité de la protéine ribosomique Rpl3, suggérant qu'ils pourraient collaborer dans la compaction du pré-ARNr. / Ribosomes are huge molecular complexes present in all cells of living things. They result from the assembly of ribosomal RNA (rRNA) and ribosomal proteins, constituting ribonucleoproteins (RNP). They play a major role in decoding the genetic information contained in messenger RNA (mRNA) to translate them into proteins during translation. Production of eukaryotic ribosomes is initiated by transcription of a pre-ribosomal rRNA (pre-rRNA) precursor of mature 18S rRNA, 5.8S and 25S / 28S by RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed with endo- and exoribonucleases, in order to form mature rRNAs. The nascent pre-rRNA associates with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and proteins called "non-ribosomal", leading to the assembly of an initial pre-90S particle. This particle is then split into pre-ribosomal pre-40S and pre-60S particles that follow independent maturation pathways leading to mature ribosomal 40S and 60S subunits. Synthesis of eukaryotic ribosomes requires the intervention of more than 200 non-ribosomal proteins that associate with pre-ribosomal particles and are absent from mature cytoplasmic ribosomes. Data obtained in collaboration suggest that five non-ribosomal proteins involved in the early maturation steps of the large ribosomal subunit Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p form a complex in the absence of ribosomal RNA. It would be the biggest and only known protein module required for the formation of ribosomal subunits. Nop8p contains a RNA binding domain and could tether the complex with pre-rRNA, and Dbp6p is a putative RNA helicase. Components of the complex may constitute regulators and / or Dbp6p targets. The objectives of my thesis were to determine whether Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p can form a complex outside the context of pre-ribosomes, characterize protein / protein interactions within the complex, and also to study its structure and function. During my thesis, I demonstrated that Nop8p, Dbp6p and Rsa3p are associated with 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, and are therefore constitutive of the same pre-ribosomal particles than Npa1p and Npa2p. Npa1p, Npa2p, Nop8p and Rsa3p can form a stable complex that exists once dissociated pre-ribosomal particles. Electron microscopic observation reveal two types of complexes. Furthermore, Dbp6p helicase can interact with this complex, but in a more labile fashion, since it is dissociated in presence of a high concentration of magnesium. Depletion experiments show that the absence of Nop8p does not prevent interactions with Npa1p, Npa2p and Rsa3p, and that the absence of Npa2p does not prevent interactions with Npa1p, Nop8p and Rsa3p. However, the absence of Npa1p strongly destabilizes the complex. Loss of expression of Dbp6p also affects the efficiency of co-precipitation of 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, but to a lesser extent. In parallel, we began a study of protein / protein interactions between members of the complex. Preliminary data suggest a direct interaction between Npa1p or Npa2p and Dbp6p, and Npa1p and Rsa3p. We also began conducting an in vitro study of Dbp6p that suggest it has a helicase activity. Finally, by CRAC analysis we show that Npa1p binds adjacent to large ribosomal protein Rpl3 on 25S rRNA, and could collaborate with it in local rRNA folding.

La protéine nucléolaire Dbp4 est impliquée dans la biogenèse de l'ARN ribosomique (ARNr) 18S chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle présente une interaction génétique avec le petit ARN nucléolaire (snoRNA) U14. Dbp4 est une RNA hélicase de la famille «DEAD-box» et elle est hautement conservée dans l'évolution. Son homologue chez l'humain (DDX10) serait impliqué dans certains types de cancers. La plupart des «DEAD-box » RNA hélicases sont essentielles à la croissance de la levure indiquant ainsi une absence de redondance de leurs fonctions sur leurs substrats spécifiques. De façon plus intéressante, il a été démontré que plusieurs hélicases seraient aussi impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Les protéines «DEAD-box» sont caractérisées par la présence de neuf motifs conservés formant la région centrale catalytique de l'enzyme. Cette dernière est flanquée par deux extensions de composition variable aux extrémités N- et C-terminales. Ces extensions joueraient un rôle déterminant dans la reconnaissance du substrat et/ou la liaison de cofacteurs. Nos analyses bioinformatiques prédisent la présence d'un domaine d'interaction protéine-protéine appelé domaine «coiled-coil» (CC) à chacune des extrémités N-et C-terminale. Notre hypothèse est que Dbp4 serait associé à des protéines par l'intermédiaire de ces domaines CC. Afin d'identifier les partenaires protéiques potentiels de Dbp4, nous avons utilisé le système double hybride chez la levure en criblant une banque génomique de Saccharomyces cerevisiae. Parmi les clones positifs, nous avons identifié la présence des protéines Ifh1, Rrn5, Rps20, Rps2 et Msb2. Curieusement à l'exception de Msb2, toutes ces protéines sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes et renferment des domaines CC comme Dbp4. Cela suggère que ces protéines sont des partenaires potentiels de Dbp4 pour la biogenèse des ribosomes. Pour confirmer ces résultats de double hybride, nous avons réalisé des tests in vivo par co-immunoprécipitation dont les résultats préliminaires n'ont pas été concluants. Des études complémentaires seront nécessaires afin d'éclaircir ces résultats. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Saccharomyces cerevisiae, Nucléole, Ribosomes, RNA hélicases, Dbp4.

Les mécanismes qui entrent en jeu dans la maturation de l'ARN ribosomique (ARNr) restent toujours obscurs. Dbp4 est une ARN hélicase putative qui fait partie du groupe des hélicases « DEAD-box ». Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Dbp4 aurait un rôle à jouer dans la maturation du pré-ARNr 35S. Les ARN hélicases ont généralement une activité ATPasique dépendante de la présence d'ARN. De plus, la plupart des hélicases possèdent des domaines supplémentaires en N-et en C-terminal qui pourraient être nécessaires pour l'activité et/ou pour conférer la spécificité pour un substrat. Nous désirons déterminer les caractéristiques biochimiques de Dbp4. Cette enzyme est pourvue d'un très long domaine C-terminal qui contient un motif de liaison protéique « coiled-coil ». La présence de ce motif suggère que Dbp4 pourrait nécessiter l'assistance de protéine(s) cofacteur(s) pour avoir une activité ATPasique et/ou hélicasique. Des tests d'interaction dans le système double hybride de levure ont permis d'identifier une interaction entre Dbp4 et les protéines Bfr2, Esf1 et Enp2. Les conditions optimales pour l'activité ATPasique sont une incubation à 37 °C dans un tampon HEPES à pH 7.5 avec 10 µg d'ARN total de levure. Dbp4 possède une activité ATPasique qui augmente de quatre à cinq fois en présence d'ARN. La protéine Dbp4 recombinante sans la section C-terminale a été produite et des tests d'activité ATPasique ont été effectués. Selon nos observations, la section C-terminale de Dbp4 joue un rôle important pour l'activité ATPasique. Finalement, la production d'anticorps anti-Dbp4 chez le lapin nous a donné deux anticorps, A et B, capables de détecter Dbp4. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hélicase, ATPase, ARNr, DEAD-box, Dbp4, Saccharomyces cerevisiae, Double hybride et coloration au vert de malachite.

Les hélicases sont des enzymes extrêmement répandues qui sont essentielles pour mener à bien l'ensemble des processus cellulaires impliquant des acides nucléiques. Ces protéines parviennent à annihiler les structures secondaires et tertiaires qui peuvent se former dans l'ADN ou l'ARN grâce à l'énergie puisée par l'hydrolyse de l'ATP. Les hélicases ne sont toutefois pas l'exclusivité des organismes eucaryotes et procaryotes, mais bon nombre de virus codent aussi pour des enzymes possédant cette fonction. La famille des Flaviviridae ne fait pas exception à ce groupe puisque l'ensemble des virus de cette famille code pour une hélicase nommée NS3. La famille des Flaviviridae est une famille virale d'une importance monumentale étant donné la présence de nombreux pathogènes humains parmi ses rangs. On y dénote le virus de l'hépatite C, le virus de la dengue et le virus du Nil occidental pour ne nommer que ceux-là. Ces virus ont aussi un autre point en commun, le manque criant d'une thérapie efficace pour traiter les patients atteints. La protéine NS3 et plus particulièrement son activité hélicase est une cible potentielle envisageable pour le traitement de ces virus étant donné l'aspect essentiel de cette activité dans le cycle de réplication de ceux-ci. L'étude présentée dans ce mémoire a pour dessein d'étudier le site d'hydrolyse de l'ATP de la protéine NS3 du virus du Nil occidental. Le but final est de découvrir les déterminants moléculaires qui mènent à la sélection du substrat à hydrolyser, tant au niveau du substrat qu'au niveau de la protéine. Du côté du substrat, une panoplie d'analogues de purines fut testée pour déterminer la capacité de ces molécules à compétitionner pour le site actif de la protéine ainsi que pour la faculté de la protéine à hydrolyser ces substrats. Du côté de la protéine, une gamme de mutants de NS3 fut exprimée et l'habileté de ces mutants à discriminer entre les différents substrats qui lui étaient présentés a été mesurée. Les acides aminés qui ont été sélectionnés pour être mutés l'ont été soit pour leur ressemblance à un motif de reconnaissance de l'ATP chez d'autres hélicases, soit pour leur proximité du substrat, déterminée grâce à un modèle de la protéine bâti sur la structure cristallisée de la protéine NS3 du virus de la dengue. L'ensemble des résultats obtenus a permis de dresser le portrait des atomes de l'ATP qui sont liés par la protéine en plus de mettre à jour plusieurs acides aminés qui sont impliqués directement ou indirectement dans la sélection du substrat par NS3. Il semble en effet que la présence d'un groupement donneur de liaison hydrogène soit nécessaire à la position six d'une purine pour permettre un bon niveau d'hydrolyse de la molécule, permettant ainsi à la protéine de faire la distinction entre l'ATP et le GTP. Aussi, l'apport insoupçonné dans le processus d'hydrolyse d'acides aminés tels que Arg202, Ans417 ou encore Arg185 a été démontré. Finalement, différentes expériences permettant d'élargir les connaissances sur la protéine NS3 ainsi que sur les hélicases en général sont proposées. Des recherches visant à déterminer les ressemblances et les différences au niveau de la discrimination entre sources d'énergie à utiliser entre les diverses protéines NS3 des Flaviviridae vont permettre d'amener à un autre niveau la compréhension du mécanisme d'hydrolyse de cette protéine. Des études s'appliquant à modifier différents acides aminés afin de façonner la protéine NS3 pour qu'elle hydrolyse des analogues particuliers ou qu'elle lie des acides nucléiques précis pourraient aussi permettre de mieux comprendre les bases de la reconnaissance des substrats de NS3 en plus de fournir éventuellement des outils moléculaires voués à des fonctions multiples.

La déstabilisation des structures G-quadruplex au niveau des acides nucléiques a des répercussions physiologiques importantes. L’accentuation des connaissances concernant les processus cellulaires associés au métabolisme des structures des G4 est primordiale. Une panoplie d’hélicases à G4 est impliquée dans le métabolisme des structures G4, notamment l’hélicase humaine DHX36. Il a été déterminé au préalable par certains groupes de recherche que l’hélicase DHX36 se lie à son substrat l’ARN G4 et utilise des nucléosides triphosphates afin de catalyser le dépliement de la structure G-quadruplex. Toutefois, l’interaction avec l’ARN G4 a été sommairement caractérisée et la spécificité nucléotidique n’a toujours pas été évaluée. Ainsi, nous avons décidé d’approfondir les connaissances du mécanisme de dépliement de la structure du G4 d’ARN par l’hélicase DHX36. Notamment, en évaluant la thermodynamique de l’interaction entre l’hélicase et l’ARN G4 afin de révéler particulièrement l’efficacité de liaison mais également en évaluant la spécificité nucléotidique de l’hélicase DHX36 afin d’effectuer le dépliement de l’ARN G4. La combinaison des analogues de nucléotides et le modèle structural permettent de révéler les caractéristiques structurales et fonctionnelles de l’interaction entre l’hélicase humaine DHX36 et l’ATP. Nos analyses permettent de constater que l’enzyme DHX36 est en mesure d’utiliser autant l’ATP que GTP afin de dérouler les structures G4 d’ARN ayant, par contre, une spécificité accrue pour la molécule d’ATP.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez E. coli, Rho est un facteur essentiel qui contrôle l’expression de multiples unités transcriptionnelles via le phénomène de terminaison de la transcription. Rho est un moteur moléculaire ATP-dépendant ayant une activité ARN hélicase caractéristique de sa capacité à dissocier des obstacles (comme l’ARN polymérase) lors de sa translocation le long de sa piste ARN. Il existe différentes structures de Rho en interaction avec l’ARN qui suggèrent des mécanismes de translocation contradictoires. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons utilisé deux approches complémentaires pour identifier les fonctionnalités moléculaires importantes au sein de l’ARN et de Rho : l’approche NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) développée au laboratoire et la mutagenèse dirigée. Nos résultats excluent une organisation de l’anneau hexamérique en «trimère de dimère» (ainsi que les mécanismes de translocation qui en découlent) mais sont compatibles avec différents aspects rencontrés dans une structure en anneau asymétrique plus récente. Toutefois, nos résultats ne supportent pas le mécanisme d’escorte nucléotide par nucléotide qui découle de cette structure asymétrique. Ainsi, nous montrons que Rho contacte la chaîne ARN de façon hétérogène et ne nécessite un groupement 2’-OH que tous les sept nucléotides en moyenne. Par ailleurs, nous avons exploré l’interactome d’E. coli dans le but d’identifier d’éventuels régulateurs de la fonction de Rho. Nous montrons que la protéine hexamèrique Hfq présente une similitude topologique avec les protéines endogènes NusG et YaeO et que, comme elles, Hfq s’associe à Rho pour en réguler la fonction. L’interaction Hfq:Rho inhibe les activités enzymatiques de Rho. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d’anti-terminaison de la transcription avec diverses implications possibles dans le métabolisme bactérien et/ou la virulence de germes pathogènes. / In E. coli, Rho is an essential factor that controls the expression of multiple transcriptional units via the phenomenon of transcription termination. Rho is an ATP-dependent molecular motor displaying RNA helicase activity, a feature typical of Rho’s ability to dissociate obstacles (such as RNA polymerase) during translocation along its RNA track. Different structures of the Rho-RNA complex have been published and suggest contradictory mechanisms of translocation. In order to understand these mechanisms, we have used two complementary approaches to identify functionality molecular comports in RNA and Rho : the NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) approach developed in the laboratory and site-directed mutagenesis. Our results exclude that Rho forms a functional "trimer of dimer" ring (which rules out related translocation mechanisms) but are compatible with various aspects encountered in a recent asymmetric ring structure. However, our results do not support the "nucleotide by nucleotide" escort mechanism inferred from this asymmetric structure. Indeed, we show that Rho forms heterogonous contacts with the RNA chain and only requires a 2'-OH every seven nucleotides on average. Furthermore, we explored the interactome of E. coli in order to identify potential regulators of Rho function. We show that the hexameric protein Hfq displays topological similarity with the endogenous proteins NusG and YaeO and, that, like them, Hfq associates with Rho to regulate Rho function. The Hfq:Rho interaction inhibits the enzymatic activities of Rho. These results reveal a novel mechanism of transcription anti-termination with potentially important implications in bacterial metabolism and/or virulence of pathogens.

Bacillus cereus est une bactérie largement disséminée dans la nature, contaminant ainsi les aliments en contact avec le sol. En France, cette bactérie est considérée comme le quatrième agent de toxi infection alimentaire collective. Pour être pathogène, B. cereus doit être capable de se multiplier lors des différentes étapes de transformation et notamment au cours de la réfrigération. Le but de cette étude a été d'étudier les mécanismes moléculaires de la réponse adaptative au froid et en particulier le rôle des hélicases à ARN de B. cereus ATCC 14579. Le gène cshA, codant pour une hélicase à ARN putative, a été identifié par une approche de mutagénèse aléatoire, comme jouant un important dans l’adaptation au froid de B. cereus. La souche ATCC 14579 possède 5 gènes codant pour des hélicases à ARN, cshA à cshE qui sont tous fortement surexprimés à 10°C par rapport à 37°C et quel que soit le stade de croissance considéré. La délétion simple des gènes cshA, cshB et cshC conduit à l’apparition de phénotypes cryosensibles, se traduisant par une incapacité d'adaptation au froid par rapport à la souche sauvage, associée à une modification de la morphologie cellulaire. De plus, CshA, CshB et CshC possèdent chacune un domaine de température où leur action est prépondérante. Elles semblent également être impliquées dans l’adaptation au stress oxydant et au stress basique, alors que CshD et E n’ont pas de rôle dans l’adaptation aux stress testés. Nous avons montré que CshA est indispensable à basse température, pour permettre le maintien de la stabilité des ribosomes avec lesquels elle interagit directement, mais aussi pour réguler la dégradation des ARNr. L’identification des partenaires protéiques interagissant avec CshA suggérent qu'elle puisse être également impliquée dans un complexe de dégradation des ARN / Bacillus cereus is a widespread bacteria, thus contaminating all raw materials in contact with soil. In France, B. cereus is considered as the fourth causative agent of foodborne illness. To be pathogenic, B. cereus should multiply during the various stages of food processing and particularly during preservation at low temperature. The aim of this study was to study molecular mechanisms of the adaptive response at low temperature and more precisely the involvement of the B. cereus ATCC 14579 RNA helicases. The cshA gene encoding a putative RNA helicase was identified by a random mutagenesis approach, as playing a major role in cold adaptation of B. cereus. The ATCC 14579 strain possesses 5 genes encoding putative RNA helicases, cshA to cshE, which were all strongly overexpressed at 10°C versus 37°C, whatever the growth stage. The simple deletion of cshA, cshB, and cshC lead to a cold-sensitive phenotype, resulting in an inability to adapt at 10 °C compared to the wild type strain, associated to a huge modification of cell morphology. In addition, CshA, CshB and CshC have a temperature range where their action is decisive. The role of these three RNA helicases also appears to be important in adaptation to oxidative and basic stresses while CshD and E did not appear to be involved in the adaptation to the tested stresses. The RNA helicase CshA has the most important role in adaptation to cold. We demonstrated that CshA is essential at low temperature to allow the maintenance of ribosome stability. CshA interacts directly with ribosomes, and also regulate rRNA degradation. The identification of protein partners that interact with CshA suggests that it could be involve in a complex of RNA decay

Les télomères sont des structures nucléo-protéiques présentes à l'extrémité des chromosomes. Ils sont un des facteurs garant de la stabilité génomique. Ils assurent la protection des extrémités des chromosomes et leur entière réplication. Les dysfonctionnements du télomère sont impliqués dans la tumorigénèse et le vieillissement.Un des rôles majeurs des télomères est d'éviter que les extrémités des chromosomes ne soient reconnues comme des cassures double brin de l'ADN et traitées comme telles par la machinerie de réparation. Cependant, de nombreuses protéines impliquées dans la reconnaissance et le métabolisme des cassures double brin, comme la protéine Tel1 et le complexe MRX par exemple, sont présentes au niveau des télomères et participent au maintien de leur taille par la télomérase. En s'appuyant sur cette analogie, j'ai étudié le rôle télomérique de l'endonucléase Sae2 et de l'hélicase Sgs1, impliquées dans l'étape de dégradation du brin 5' qui précède la réparation des cassures double brin de l'ADN par recombinaison.Les rôles des protéines Sae2 et Sgs1 ont été étudiés sur les télomères natifs et sur les télomères érodés lors de la sénescence réplicative. L'ensemble de mes résultats suggèrent que, bien que les télomères érodés en absence de télomérase soient reconnus comme une cassure double brin de l'ADN et traités comme tels par les nucléases et hélicases, le rôle majeur de Sae2 et Sgs1 au niveau des télomères natifs serait de les protéger contre des recombinaisons illégitimes au cours de leur réplication. / Telomeres are nucleoprotein complexes that protect the extremities of linear chromosomes, avoiding end-to-end fusions and nucleolytic degradation of chromosome ends. The failure of cells to properly maintain telomeres can be an important source of chromosome instability involved in cancer progression and aging.A major role of telomeres is to prevent chromosome ends from being recognized as damage-induced double-strand DNA breaks (DSBs). However, many proteins involved in recognition and processing of DSBs are also involved in telomeres maintenance, like Tel1 and MRX. Based on this analogy, I have studied the role at telomeres of the role of the endonuclease Sae2 and the helicase Sgs1, two proteins that have a key function in the processing of DSBs through nucleolytic degradation of their 5' end.The role of protein Sae2 and Sgs1 has been studied at native and eroded telomeres. My results showed that eroded telomeres, in telomerase deficient cells, are recognized and resected as a double-strand break DNA by a set of nucleases and helicases including Sae2 and sgs1. In contrast, the main role of Sae2 and Sgs1 at native telomeres would be to protect telomeres against illegitimate recombination during replication.

Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.