La transcription fidèle d’un gène lors de son activation nécessite l’assemblage d’un ensemble de protéines autour du promoteur. Parmi ces protéines, le complexe TFIIH joue un rôle central et important au travers de ses sous-unités enzymatiques. Des mutations dans les sous-unités XPB, XPD et p8/TTD-A de TFIIH conduisent à trois maladies autosomiques récessives distinctes : xeroderma pigmentosum (XP), parfois associés avec le syndrome de Cockayne (XP/CS) et la trichothiodystrophie (TTD). En étudiant différentes mutations dans ces trois sous unités de TFIIH, nous avons montré que chaque mutation analysée conduit à une dérégulation transcriptionnelle spécifique du gène RARβ2, gène cible des RAR. L’intégrité architecturale et enzymatique de TFIIH conditionne le bon recrutement du complexe TFIIH et également des facteurs de réparation par excision de nucléotides (NER). TFIIH muté perturbe leur recrutement et par conséquence compromet le remodelage de la chromatine médiée par les facteurs NER tels que les modifications post-traductionnelles (PTMs) des histones, l’induction des cassures de l’ADN, la déméthylation de l’ADN et les boucles de chromatine. Par conséquence, en plus de ses activités enzymatiques, TFIIH forme une plate-forme afin de recruter les facteurs NER et orchestres les fonctions connexes de la transcription. Cette pénétrance variable parmi les mutants donne lieu à un gradient de phénotype observé chez les patients TTD, XP ou XP/CS. / Fidelity in transcription of the gene requires assembly of set of proteins around the promoter,upon gene activation. The TFIIH complex is central among these proteins and plays a key role through its enzymatic subunits. Mutations in TFIIH subunits XPB, XPD and p8/TTD-A leads to three distinct autosomal recessive disorders: xeroderma pigmentosum (XP), sometimes associated with Cockayne’s syndrome (XP/CS) and trichothiodystrophy (TTD). By studying the different mutation in these three subunits of TFIIH from mentioned genetic disease models, we have shown that each mutation analyzed led to a specific transcriptional dysregulation of theRAR-target gene RAR 2. The architectural and enzymatic integrity of TFIIH condition the appropriate recruitment of TFIIH complex and further the arrival of the Nucleotide ExcisionRepair (NER) factors. By disturbing their recruitment, mutated TFIIH consequently compromised the chromatin remodeling mediated by NER factors such as histones posttranslational modifications (PTMs), DNA breaks induction, DNA demethylation and genelooping. Hence it can be concluded that in addition to its enzymatic activities, TFIIH provide a platform to recruit the NER factors and orchestrates the related functions in transcription. Such varying penetrance among mutants gives rise to a phenotype gradient as observed in TTD, XPor XP/CS patients.

L'ARN polymérase II sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PIC

La synthèse des ARN messagers est un processus hautement régulé. Pendant l’initiation de la transcription, un nombre important de protéines est recruté au niveau du promoteur des gènes, comprenant l’ARN polymérase II, les facteurs généraux de transcription comme TFIIH, des co-activateurs et des remodeleurs de la chromatine. L’assemblage du complexe de pré-initiation sur les promoteurs est suivi par leur ouverture. Les modèles acceptés à ce jour suggéraient que la transcription des gènes de classe II nécessite les activités ATPase et hélicase de la sous-unité XPB de TFIIH afin d’ouvrir le promoteur. Or nous avons observé que l’expression des ARNm s’accommode de l’absence de XPB mais nécessite son activité ATPase. Ces observations concordent avec un modèle alternatif dans lequel l’activité ATPase de XPB est utilisée pour transloquer la protéine en amont du site d’initiation et lever un blocage, imposé par la présence de XPB, de l’ouverture du promoteur. De plus, nous avons découvert un nouveau rôle de TFIIH dans le remodelage de la chromatine lors de l’initiation de la transcription. Nous avons mis en évidence un lien étroit entre TFIIH et l’histone acétyltransférase KAT2A, permettant le contrôle de la structure de la chromatine et l’expression des gènes, apportant en outre de nouvelles informations sur le Xeroderma pigmentosum combiné au syndrome de Cockayne, une maladie de la réparation avec une prédisposition au cancer. / The synthesis of messenger RNA is a highly regulated process. During transcription initiation, a large number of proteins are recruited to gene promoter including RNA polymerase II, general transcription factors like TFIIH, co-activators and chromatin remodelers. The assembly of pre-initiation complex on promoters is followed by their opening. Accepted models to date suggested that transcription of class II genes requires TFIIH XPB subunit ATPase and helicase activities to actively open the promoter. However, we have observed that mRNA expression is compatible with the absence of XPB but requires its ATPase activity. These observations are consistent with an alternative model in which the ATPase activity of XPB is used to translocate the protein upstream of the initiation site, alleviating a block, imposed by the presence of XPB, of the promoter opening. Moreover, we found a new role for TFIIH in chromatin remodeling during transcription initiation. We highlighted a tight connection between TFIIH and the histone acetyltransferase KAT2A that controls higher-order chromatin structure and gene expression and provide new insights into transcriptional misregulation in combined Xeroderma Pigmentosum and Cockayne syndrome, a cancer-prone DNA repair-deficient disorder.

Thesis (Ph.D. in Molecular Biology) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 185-214). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome. Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée. Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines. Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.

La synthèse d’ARN messagers résulte d’une cascade d’évènements temporellement et spatialement orchestrée. Au moment de l’initiation de la transcription, divers facteurs tels que les facteurs généraux de transcription, le complexe Médiateur, des co-activateurs, des facteurs de remodelage de la chromatine ainsi que l’ARN polymérase II sont recrutés au niveau de la région promotrice du gène. Certains facteurs de la voie NER de réparation de l’ADN sont également recrutés. En utilisant des cellules de patients porteurs de mutations dans les gènes MED12 (sous-unité du Médiateur) ou XPC (facteur initiant la voie NER), nous avons pu étudier le rôle de ces protéines dans la transcription. Les patients MED12 sont notamment caractérisés par une lourde déficience intellectuelle et des malformations congénitales. Nous avons montré que MED12 est impliqué dans le contrôle de certains gènes de réponse immédiate comme JUN, qui contribue notamment au développent et à la plasticité cérébrale. L’expression de ce dernier est affectée par les mutations de MED12, mais différemment en fonction de la position de la mutation, apportant une possible indication sur l’origine des variations phénotypiques observées chez les patients. En parallèle, les patients XPC se caractérisent par une forte photosensibilité. Nous avons montré que la protéine XPC, en collaboration avec le facteur E2F1, est impliquée dans le recrutement de l’histone acetyl-transférase GCN5 au niveau du promoteur d’un certain nombre de gènes. Cette dernière permet notamment l’a modification de l’environnement chromatinien, en coopération avec le facteur général de transcription TFIIH et participe ainsi à l’initiation de la transcription. En plus d’approfondir la compréhension des mécanismes régissant la transcription, ces résultats ont permis de mieux comprendre l’étiologie des maladies associées aux mutations. / The synthesis of messenger RNA is a highly regulated process. During transcription initiation, a large number of proteins are recruited to gene promoter, including the RNA polymerase II, general transcription factors, co-activators, chromatin remodellers and the Mediator complex. Some DNA repair factors from the NER pathway are also recruited. Using cells derived from patients bearing mutations in either MED12 gene or XPC gene, we studied the roles of such proteins in transcription. MED12 patients are mostly characterised by intellectual disability and developmental delay. We showed that MED12 is implicated in the transcription regulation of immediate early genes like JUN, known for its role in neurological development and neuronal plasticity. JUN expression is markedly altered by MED12 mutations. We also showed that the position of the mutation influences this alteration, bringing possible explanation for inter-patients symptom variability. Meanwhile, XPC patients are mostly characterized by photosensitivity. We showed that XPC protein, which engages one of the NER pathways, is implicated in chromatin post-translational modification. Together with E2F1, it helps the recruitment of GCN5 acetyl-transferase to promoter of a certain set of genes. On the promoter, GCN5 notably cooperates with TFIIH to modify the chromatin environment during transcription initiation. In addition to help the comprehension of the transcription mechanisms, these results bring knew insight into the aetiology of mutations associated diseases.

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L'ARN polymérase II sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PIC.

Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

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