L'ARN polymérase II sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PIC

RNA polymerase II, the polymerase responsible for transcribing protein coding genes in eukaryotes, possesses an ability to discriminate between correct (complementary to the DNA template) and incorrect substrates (selectivity), and as well as remove incorrect substrates that have been erroneously incorporated into the nascent RNA transcript (proofreading). Although these features of pol II are not as robust as those observed for DNA polymerases, the accurate utilization of genetic information is of obvious importance to the cell. The role of the small RNA polymerase II subunit Rpb9 in transcriptional proofreading was assessed in vitro. Transcription elongation complexes in which the 3'-end of the RNA is not complementary to the DNA template have a dramatically reduced rate of elongation, which provides a fidelity checkpoint at which the error can be removed. The efficiency of such proofreading depends on competing rates of error propagation (extending the RNA chain without removing the error) and error excision, a process that is facilitated by TFIIS. In the absence of Rpb9, the rate of error propagation is increased by 2- to 3-fold in numerous sequence contexts, compromising the efficiency of proofreading. In addition, the rate and extent of TFIIS-mediated error excision is also significantly compromised in the absence of Rpb9. In at least some sequence contexts, Rpb9 appears to enhance TFIIS-mediated error excision by facilitating efficient formation of a conformation necessary for RNA cleavage. If a transcription error is propagated by addition of a nucleotide to the mismatched 3'-end, the rate of further elongation increases but remains much slower than that of a complex with a fully base-paired RNA, which provides a second potential fidelity checkpoint. The absence of Rpb9 also affects both error propagation and TFIIS-mediated error excision at this potential fidelity checkpoint in a manner that compromises transcriptional fidelity. The trigger loop, a mobile structural element of the largest subunit of RNA polymerase II is important for maintaining fidelity. The pol II specific toxin α-amanitin targets the trigger loop, and was used to distinguish trigger loop -independent and -dependent Rpb9 functions, in vitro. Rpb9 decreases the correct nt extension rate when trigger loop movement is restricted by α-amanitin. This occurs in the context of a RNA with a matched or mismatched 3’-end, which indicates that Rpb9’s contribution to correct nt extension occurs in a manner independent of the trigger loop. In addition, the effect on mismatch extension indicates that the trigger loop is not required for Rpb9 to facilitate recognition of proofreading ‘checkpoints’ after mismatches occur. Rpb9 also decreases the rate of misincorporation, but this effect is dependent on the trigger loop. Rpb9’s role in selectivity was tested by utilizing several assays to estimate nt discrimination. Rpb9 does not have a significant effect on nt discrimination for the sequence contexts tested, which suggests the role Rpb9 plays in fidelity is in large part due to its proofreading capabilities. Lastly, the charged residues of Rpb9’s C-terminal “loop” region, proposed in the prevailing model to be important for trigger loop interaction, are dispensable for Rpb9 function in vivo and in vitro.

Chez les eucaryotes, l’ARN polymérase (RNAP) III transcrit les ARN de transferts, l’ARN ribosomique 5S, et plusieurs douzaines d’autres ARNs non traduits. Le génome des mammifères contient plusieurs milliers d’éléments répétés, les SINEs. In vitro, leur transcription dépend de la RNAP III. Le taux de transcription de la RNAP III détermine la croissance et la prolifération cellulaires, sa dérégulation a été associée à de nombreux cancers. Afin de caractériser la distribution sur l’ensemble du génome de la RNAP III et de ses facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC, nous avons développé un protocole très spécifique de ChIP-seq en tandem. Nous avons déterminé l’ensemble des gènes liés par la RNAP III dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cet ensemble est bien inférieur au nombre de gènes prédits dans le génome. Nous avons également observé la RNAP III et ses facteurs de transcription liés à 30 régions non annotées, seule une d’entre elles est conservée chez l’humain. Un très faible nombre de SINEs sur un demi-million prédits est associé à la RNAP III. Notre étude révèle de nombreux sites liés uniquement par TFIIIC, nommés « extra-TFIIIC loci », ETC chez la levure. Ces sites sont associés à la protéine CTCF, et à la cohésine. La cohésine occupe les sites liés par CTCF, et contribue à la formation de boucles ADN, associées à la répression ou à l’activation de l’expression des gènes. Ces données suggèrent que TFIIIC peut jouer un rôle dans l’organisation de l’architecture chromosomique chez les souris. Nous avons également démontré que TCEA1, l’isoforme ubiquitaire de TFIIS, le facteur d’élongation de la RNAP II, est associée aux gènes actifs de classe III. Ceci suggére que TFIIS est un facteur de transcription de classe III. Finalement, la distribution de TFIIS aux gènes de classe II indique que le recrutement de TFIIS n’est pas suffisant pour contrôler la transition de la RNAP II pausée en 5’ des gènes en élongation. / In eukaryotes, RNA polymerase (RNAP) III transcribes the tRNAs, the 5S ribosomal RNA and a half a dozen known untranslated RNA. Mammalian genome contains several thousand of repeated elements, the Short interspersed repetitive elements (SINE). In vitro, they are transcribed by RNAP III. RNAP III transcription levels determine cell growth and proliferation and, importantly, its deregulation is associated with cancer. Looking at the genome-wide distribution of RNAP III and its transcription factors, TFIIIB and TFIIIC, we develop a highly specific tandem ChIP-sequencing method. We have determined the set of genes that are transcribed by RNAP III in mouse embryonic stem cells. We discovered that not all known class III genes were transcribed in ES cells. We also observed that RNAP III and its transcription factors were present at thirty unannotated sites on the mouse genome, only one of which was conserved in human. Only a couple of hundreds of SINEs out of more than half a million are associated with RNAP III in mouse ES cells. Our study reveals numerous ‘TFIIIC-only’ sites, called ETC for extra-TFIIIC loci in yeast. These sites are correlated with association of CTCF and the cohesin. Cohesin has been shown to occupy sites bound by CTCF and to contribute to DNA loop formation associated with gene repression or activation. This observation suggests that TFIIIC may play a role in chromosome organization in mouse. We also demonstrated that TCEA1, the ubiquitous isoform of TFIIS RNAP II elongation factor, is associated with active class III genes suggesting that TFIIS is a RNAP III transcription factor in mammals. Finally, the distribution of TFIIS on RNAP II-transcribed genes indicated that its recruitment does not control the transition of RNAP II paused at genes 5’ end into elongation.

L'ARN polymérase II sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PIC.

Chez les eucaryotes, l'ARN polymérase (RNAP) III transcrit les ARN de transferts, l'ARN ribosomique 5S, et plusieurs douzaines d'autres ARNs non traduits. Le génome des mammifères contient plusieurs milliers d'éléments répétés, les SINEs. In vitro, leur transcription dépend de la RNAP III. Le taux de transcription de la RNAP III détermine la croissance et la prolifération cellulaires, sa dérégulation a été associée à de nombreux cancers. Afin de caractériser la distribution sur l'ensemble du génome de la RNAP III et de ses facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC, nous avons développé un protocole très spécifique de ChIP-seq en tandem. Nous avons déterminé l'ensemble des gènes liés par la RNAP III dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cet ensemble est bien inférieur au nombre de gènes prédits dans le génome. Nous avons également observé la RNAP III et ses facteurs de transcription liés à 30 régions non annotées, seule une d'entre elles est conservée chez l'humain. Un très faible nombre de SINEs sur un demi-million prédits est associé à la RNAP III. Notre étude révèle de nombreux sites liés uniquement par TFIIIC, nommés " extra-TFIIIC loci ", ETC chez la levure. Ces sites sont associés à la protéine CTCF, et à la cohésine. La cohésine occupe les sites liés par CTCF, et contribue à la formation de boucles ADN, associées à la répression ou à l'activation de l'expression des gènes. Ces données suggèrent que TFIIIC peut jouer un rôle dans l'organisation de l'architecture chromosomique chez les souris. Nous avons également démontré que TCEA1, l'isoforme ubiquitaire de TFIIS, le facteur d'élongation de la RNAP II, est associée aux gènes actifs de classe III. Ceci suggére que TFIIS est un facteur de transcription de classe III. Finalement, la distribution de TFIIS aux gènes de classe II indique que le recrutement de TFIIS n'est pas suffisant pour contrôler la transition de la RNAP II pausée en 5' des gènes en élongation.

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.