A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

O Adenovírus (Ad) é um agente etiológico que causa infecções em diversas espécies e também pode ser utilizado na forma de vetor como ferramenta tecnológica para terapia gênica. O Controle sobre a replicação de Ad pode trazer beneficio para o combate de infecções e para as tecnologias de transferência genica. Porém, poucas ferramentas existem que podem inibir a replicação de Ad. Uma aplicação importante seria a inibição da replicação de Adenovírus helper utilizado na produção de Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV), assim minimizando contaminação da produção de rAAV com o virus helper. Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi investigar se há inibição da replicação do Ad mediada por RNA de interferência (RNAi) direcionada para alvos adenovirais chaves. Para isso foram construídos vetores lentivirais que codificam shRNAs para os genes hexon, IVa2 e pol. Em seguida foram criadas linhagens que expressam constitutivamente os shRNAs em 293T, células onde os vetores adenovirais conseguem se replicar. Os shRNAs específicos para hexon e IVa2 promoverem significantemente a redução dos níveis destes mRNAs conforme revelado utilizando RT-qPCR para quantificação dos transcritos adenovirais. Em seguida, knockdown do gene hexon se mostrou promissor em inibir a replicação do Ad, visto como redução de vírus produzido em células 293T anti-hexon. O knockdown do transcrito de hexon e a redução em replicação de Adenovírus foram mais acentuados após cell sorting e obtenção de clones celulares a partir da linhagem anti-hexon. O clone anti-hexon mostrou significante redução na quantidade de partículas adenovirais visualizadas por microscopia eletrônica e redução de 92% das partículas infecciosas em relação a 293T quando a produção foi realizada em larga escala. Esses resultados indicam que a tecnologia de shRNA para inibir a replicação do Ad é promissora e representa o primeiro passo de desenvolvimento de uma estratégia para a produção de rAAV livre de contaminação com Ad helper / Adenovirus (ad) is an etiologic agent that causes infections in diverse species and can also be used as a technologic resource, such as a vector applied in gene therapy. Control over Ad replication could be beneficial for the combat of infections and for the technology of gene transfer. However, few tools exist that may useful for the inhibition of Ad replication. One important application would be to impede replication of helper adenovirus utilized in the production of recombinant Adenoassociated Virus (rAAV), thus minimizing the contamination of the rAAV production with helper virus. The objective of the study was to investigate the use of RNA interference (RNAi) directed against key adenoviral targets as an inhibitor of Ad replication. For this, lentiviral vectors encoding shRNAs for hexon, IVa2 and pol were constructed. Next, constitutive expression of the shRNAs was established in 293T cells, the parental cell line that is permissive for adenovirus replication. The shRNAs specific for hexon or IVa2 significantly promoted reduction in the level of these mRNAs as revealed by RT-qPCR quantification of the adenoviral transcripts. Next, knockdown of hexon was shown to be promising as an inhibitor of Ad replication, seen as the reduction of Ad produced in the 293T anti-hexon cell line. Both the knockdown of the hexon transcript and reduction in adenovirus replication were accentuated after cell sorting and isolation of cellular clones from the anti-hexon cell line. The anti-hexon clone showed significant reduction in the quantity of adenovirus particles when visualized by electron microscopy and 92% fewer infectious particles as compared to the parental 293T cells when full scale production was made. These results indicate that the use of shRNA technology for the inhibition of Ad replication is promising and represents the first step for the development of a strategy for the production of rAAV free from helper virus contamination

O Adenovírus (Ad) é um agente etiológico que causa infecções em diversas espécies e também pode ser utilizado na forma de vetor como ferramenta tecnológica para terapia gênica. O Controle sobre a replicação de Ad pode trazer beneficio para o combate de infecções e para as tecnologias de transferência genica. Porém, poucas ferramentas existem que podem inibir a replicação de Ad. Uma aplicação importante seria a inibição da replicação de Adenovírus helper utilizado na produção de Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV), assim minimizando contaminação da produção de rAAV com o virus helper. Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi investigar se há inibição da replicação do Ad mediada por RNA de interferência (RNAi) direcionada para alvos adenovirais chaves. Para isso foram construídos vetores lentivirais que codificam shRNAs para os genes hexon, IVa2 e pol. Em seguida foram criadas linhagens que expressam constitutivamente os shRNAs em 293T, células onde os vetores adenovirais conseguem se replicar. Os shRNAs específicos para hexon e IVa2 promoverem significantemente a redução dos níveis destes mRNAs conforme revelado utilizando RT-qPCR para quantificação dos transcritos adenovirais. Em seguida, knockdown do gene hexon se mostrou promissor em inibir a replicação do Ad, visto como redução de vírus produzido em células 293T anti-hexon. O knockdown do transcrito de hexon e a redução em replicação de Adenovírus foram mais acentuados após cell sorting e obtenção de clones celulares a partir da linhagem anti-hexon. O clone anti-hexon mostrou significante redução na quantidade de partículas adenovirais visualizadas por microscopia eletrônica e redução de 92% das partículas infecciosas em relação a 293T quando a produção foi realizada em larga escala. Esses resultados indicam que a tecnologia de shRNA para inibir a replicação do Ad é promissora e representa o primeiro passo de desenvolvimento de uma estratégia para a produção de rAAV livre de contaminação com Ad helper / Adenovirus (ad) is an etiologic agent that causes infections in diverse species and can also be used as a technologic resource, such as a vector applied in gene therapy. Control over Ad replication could be beneficial for the combat of infections and for the technology of gene transfer. However, few tools exist that may useful for the inhibition of Ad replication. One important application would be to impede replication of helper adenovirus utilized in the production of recombinant Adenoassociated Virus (rAAV), thus minimizing the contamination of the rAAV production with helper virus. The objective of the study was to investigate the use of RNA interference (RNAi) directed against key adenoviral targets as an inhibitor of Ad replication. For this, lentiviral vectors encoding shRNAs for hexon, IVa2 and pol were constructed. Next, constitutive expression of the shRNAs was established in 293T cells, the parental cell line that is permissive for adenovirus replication. The shRNAs specific for hexon or IVa2 significantly promoted reduction in the level of these mRNAs as revealed by RT-qPCR quantification of the adenoviral transcripts. Next, knockdown of hexon was shown to be promising as an inhibitor of Ad replication, seen as the reduction of Ad produced in the 293T anti-hexon cell line. Both the knockdown of the hexon transcript and reduction in adenovirus replication were accentuated after cell sorting and isolation of cellular clones from the anti-hexon cell line. The anti-hexon clone showed significant reduction in the quantity of adenovirus particles when visualized by electron microscopy and 92% fewer infectious particles as compared to the parental 293T cells when full scale production was made. These results indicate that the use of shRNA technology for the inhibition of Ad replication is promising and represents the first step for the development of a strategy for the production of rAAV free from helper virus contamination