Nesta tese, mostramos que o modelo estocástico binário para expressão gênica, por um gene auto-regulado, possui solução completa. A solução dependente do tempo é escrita via expansão em termos das funções de Heun confluentes. Apresentamos um exemplo de dinâmica estocástica desse gene. Para tal, desenvolvemos uma relação de recorrência entre derivadas arbitrárias das funções de Heun confluentes. Mostramos também que o regime estacionário deste modelo possui simetria de Lie SO(2, 1) tipo Lorentz. Esta simetria é análoga à simetria do momento angular, porém com um sinal errado. O invariante desta álgebra define a meia-vida relativa do regime dinâmico do gene. O equivalente do momento angular azimutal é uma medida indireta do nível de atividade do gene. Os operadores levantamento e abaixamento conectam diferentes processos estocásticos de expressão proteínica. As flutuações destes processos estocásticos são classificadas em termos das relações entre os etiquetadores de um elemento da representação da álgebra. No arcabouço da teoria dos grupos, o modelo estocástico para um gene externamente regulado aparece como um caso particular do modelo para um gene auto-regulado. Mostramos, por fim, uma comparação entre estas duas estratégias de regulação. Demonstramos que um gene auto-regulado pode expressar proteínas em regimes sub Poisson, Poisson ou super Poisson. Por seu turno, o gene externamente regulado somente expressa proteínas em regimes Poisson ou super Poisson. Portanto, num processo estocástico, a auto-regulação mostra-se como uma forma de controle mais precisa. Também mostramos que a dinâmica de genes auto-regulados possui meia-vida mais curta que a de genes externamente regulados. Ou seja, a auto-regulação permite respostas mais rápidas à perturbações externas. / In this thesis we show that the stochastic binary model to protein synthesis by na auto-regulated gene is completely solvable. The time-dependent solution is written in terms of the confluent Heun functions. We present an example of probability dynamics to this gene. To get that, we developed a recurrence relation between arbitrary derivatives of the confluent Heun functions. We also show the existence of a Lorentz-like Lie symmetry SO(2, 1). This is an analogous to the angular momentum symmetry but presenting one wrong sign in its preserved form. This invariant defines the relative half-life of the dynamical regime of the gene. The equivalent of the azimuth angular momentum measures indirectly the activity level of the gene. The ladder operators connect distinct stochastic processes of protein synthesis. The fluctuations of these processes are classified in terms of the relation between labeling numbers of a representation of the algebra. In the group theory formalism, the stochastic model to an externally regulated gene is a particular case of the model to an auto-regulated gene. We compare these two gene regulation strategies, and show that the auto-regulated gene can synthesize proteins into the super Poisson, Poisson, and sub Poisson fluctuating regimes. The externally regulated gene only presents the super Poisson and Poisson regimes. Therefore, the auto-regulation is responsible for a more precise control of gene expression. We also show that the dynamics of the auto-regulated genes has a shorter half-life. Thus, the auto-regulation permits faster responses of the system to external perturbation.

A grande diversidade de organismos que hoje encontramos em nosso planeta se deve à adaptação às diferentes condições ambientais de cada nicho ecológico existente e à resposta adaptativa originária das mudanças dessas condições. Pode-se considerar que a etapa inicial do processo de adaptação seja a reprogramação da expressão gênica dum organismo como resposta imediata a uma nova condição ambiental. De fato parte do genoma de todos os organismos é dedicada à codificação de proteínas relacionadas ao controle dos efeitos nocivos criados por diferentes tipos de estresse como choque térmico, ou osmótico, estresse oxidativo, ou aqueles resultantes de altas concentrações de íons de metais pesados. De forma semelhante, a ausência, ou exaustão, de fontes de macronutrientes, como carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre, exige uma reorganização do padrão de expressão gênica para adequação às novas condições nutricionais, também sendo considerada um estresse ambiental. Visto que a maioria dos estudos de análise da expressão gênica em resposta a estresses ambientais realizados em fungos se refere às leveduras unicelulares Saccharomyces cerevisiae e Schizossacharomyces pombe, nos propusemos a estudar tal resposta no fungo filamentoso multicelular Trichoderma reesei. Dessa forma analisamos por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs a expressão gênica de aproximadamente 2.000 transcritos desse organismo em resposta a choque térmico, à alta concentração de íons de cádmio II e à ausência de fonte de carbono, ou nitrogênio, por período de 2 horas. Em geral, as respostas aos estresses se compuseram da regulação negativa da transcrição de genes envolvidos em processos com alta demanda de energia como a síntese protéica, evidenciada pela repressão da expressão de genes de proteínas ribossomais e do anabolismo. Em contrapartida, genes codificando proteínas relacionadas à defesa celular, como chaperonas, tiveram sua expressão induzida. As respostas ao choque térmico e ao tratamento com cádmio II se mostraram bastantes semelhantes, enquanto a ausência de fonte de nitrogênio também induziu a expressão de genes relacionados à degradação de proteínas e nucleotídeos. Genes relacionados à utilização de reservas lipídicas foram induzidos tanto na ausência de fonte de carbono quanto de nitrogênio. Foram identificados reguladores transcricionais e componentes de vias de sinalização celular com expressão diferenciada frente a esses diferentes estresses ambientais. A maior parte dos genes cuja expressão se alterou em função dos diversos estresses ambientais estudados ainda não tem função celular conhecida, sendo essa observação, portanto, uma contribuição importante para sua anotação funcional. Uma vez que o fungo filamentoso Trichoderma reesei vem se tornando um organismo de valor biotecnológico por sua característica de alto poder de síntese e secreção de proteínas, esperamos que os dados apresentados forneçam um maior entendimento dos processos celulares desse organismo e possam subsidiar futuros projetos visando uma melhor adaptação do mesmo a ambientes industriais. / The diversity of organisms found today in our planet is due to their adaptation to different environmental conditions present in each ecological niche, and to the adaptative response originated from changes in those conditions. The first step in the adaptation process is considered to be the reprogramming of gene expression as an immediate response to a new environmental condition. A fraction of the genome from all living organisms is dedicated to encoding proteins related to the control of deleterious effects created by different types of stresses like heat or osmotic shock, oxidative stress, or by the presence of high concentrations of heavy metal ions. Similarly, the absence or exhaustion of macronutrients as carbon, nitrogen, phosphorous or sulphur sources demand new patterns of gene expression in order to the organisms survive in a limited nutritional condition, which is also considered an environmental stress. Once the gene expression analyses in fungi as a response to environmental stresses have been widely studied in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizossacharomyces pombe, we proposed to study such response in the multicellular filamentous fungus Trichoderma reesei. To this purpose, we have utilized the cDNA microarray technique to analyze the gene expression of approximately 2,000 T. reesei transcripts in response to heat shock, to high concentration of cadmium II ions and to a 2-hour absence of carbon or nitrogen source. As a general response to the four studied stresses, we observed on one hand a negative transcriptional regulation of genes involved in processes that demand great amounts of energy, i.e. a negative regulation of protein synthesis, indicated by strong repression of ribosomal protein genes transcription, as well as a negative regulation of anabolism. On the other hand, genes that encode proteins associated with cellular defense, like chaperones, had their expression induced. The responses to heat shock and to cadmium poisoning were quite similar while nitrogen source absence also induced the expression of genes related to protein and nucleotide degradation. Genes implicated in the consumption of lipid reserves were induced in the absence of both carbon and nitrogen sources. We identified some transcription regulators as well as components of signal transduction pathways that have differential patterns of gene expression caused by these different environmental stresses. Most of the genes that had their expression altered in response to the studied environmental stresses has no known function yet. Their expression patterns towards such stresses are therefore an important contribution to their functional annotation. Since the filamentous fungus Trichoderma reesei has become a microorganism of biotechnological value for its high capacity of synthesis and secretion of proteins, we expect that the data presented on this work can provide a better understanding of its cellular processes and may support future projects for a better adaptation of this organism to industrial conditions.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-02-14T12:46:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Danielli Batista Bezerra Cajueiro.pdf: 1520169 bytes, checksum: 01f947c81a685b7a391d5c6dbfcf83bd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T12:46:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Danielli Batista Bezerra Cajueiro.pdf: 1520169 bytes, checksum: 01f947c81a685b7a391d5c6dbfcf83bd (MD5) Previous issue date: 2015-06-12 / CAPES / As fontes de nitrogênio do meio são classificadas como preferenciais e nãopreferenciais, de maneira que as primeiras inibem a expressão dos genes responsáveis pela metabolização das segundas por um mecanismo chamado de Repressão Catabólica do Nitrogênio (Nitrogen Catabolic Repression - NCR). No presente estudo avaliamos o padrão de regulação dos genes do metabolismo central do nitrogênio na levedura Dekkera bruxellensis. Foram definidos quatro grupos de fontes de nitrogênio baseados no crescimento celular. Em seguida, o padrão de expressão dos genes do metabolismo central do nitrogênio mostrou que fenilalanina, embora do grupo quatro, é o maior indutor das permeases Gap1p e Put4p, resultando em sua elevada taxa de consumo. Já a histidina, indutora da permease Put4p, promove maior indução dos genes que codificam as enzimas de assimilação de amônia. Quando o mecanismo NCR é inibido pela presença de metionina sulfoximina no meio, ocorre a desrrepressão dos genes que codificam as permeases. E finalmente, os resultados mostram que nitrato, definido no grupo dois induz o mecanismo de sinalização intracelular de regulação gênica semelhante ao que se observa quando as células estão no estado de privação de nitrogênio no meio. Isto complementa os estudos anteriores nos quais mostramos que a assimilação de nitrato altera o estado fisiológico da célula para respiração mesmo na presença de alta concentração de glicose no meio. / The nitrogen sources in the medium are classified as preferential or non-preferrential, so that the first inhibit expression of genes responsible for metabolism of the latter by a mechanism called Nitrogen Catabolic Repression (NCR). In the present study we evaluated the pattern of gene regulation of the central nitrogen metabolism in yeast Dekkera bruxellensis. It was defined four groups of nitrogen sources based on cell growth. Then, the expression pattern of the central nitrogen metabolism genes showed that phenylalanine, though belonging to group four, is the biggest inducer of genes of permeases Gap1p Put4p, resulting in its high consumption rate. Moreover, histidine induces the gene encoding permease Put4p and promoted the highest induction of the genes encoding the enzymes of ammonia assimilation. When the NCR mechanism was inhibited by the presence of methionine sulfoximine in the medium there was derepression of the genes encoding for permeases. Finally, the results showed that nitrate, defined in the group two, induced the intracellular signaling pathway gene regulation similar to that seen when cells are in a state of nitrogen deprivation in the middle. This complements our previous studies that showed that the nitrate assimilation alter the physiological state of the cell to respiration even in presence of high glucose concentration in medium.

Os gliomas estão entre os mais freqüentes e fatais tumores do sistema nervoso central. Apesar dos grandes avanços da Medicina nas áreas diagnósticas e terapêuticas, o tratamento desses tumores ainda é, na grande maioria dos casos, paliativo, sendo a extirpação cirúrgica do tumor o único recurso com potencial curativo e, ainda assim, apenas para os gliomas de baixo grau. Neste trabalho, foram analisados os perfis de expressão gênica diferencial entre linhagens de glioma de rato com diferentes graus de tumorigenicidade (linhagens ST1 e P7), visando identificar genes com potencial de aplicação na doença humana como marcadores moleculares e/ou novos alvos terapêuticos. Numa primeira abordagem, foi realizado um rastreamento de genes potencialmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7 de glioma de rato através da hibridização de macroarrays de cDNA comerciais. Um conjunto de três membranas comerciais foi hibridizado com alvos radioativos gerados a partir de mRNA obtido destas duas linhagens, totalizando aproximadamente 3.000 genes. Nestes experimentos, foram identificados aproximadamente 200 genes como sendo possivelmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7. Os níveis de expressão relativa de cerca de 40 destes genes foram analisados por Northern blot, sendo que seis deles foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1 enquanto que 4 foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem P7. Num segundo momento, foi realizado um rastreamento de expressão gênica em larga escala, através do uso de microarrays de DNA contendo sondas que permitem a análise de expressão de aproximadamente 24.000 transcritos de rato. Esta análise levou à identificação de uma lista contendo aproximadamente 1.300 genes candidatos a diferencialmente expressos, que apresentaram razões de expressão relativa entre 2 e >3.000. Desta lista, -700 genes foram identificados como provavelmente mais expressos na linhagem ST1, e cerca de 500 genes com expressão maior na linhagem P7. A etapa de subseqüente de validação da expressão diferencial foi realizada através de PCR quantitativo em tempo real (Q-PCR). A expressão de 49 genes foi quantificada em quatro preparações independentes de RNA originárias das linhagens ST1 e P7, sendo que 27 destes genes foram identificados como possivelmente diferencialmente expressos através dos microarrays, 10 dos quais haviam sido previamente confirmados por Northern Blot e 12 genes diversos. Destes genes, 21 foram confirmados por Q-PCR como sendo diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7, além daqueles 10 genes cuja expressão diferencial havia sido anteriormente confirmada por Northern. Ao todo, oito genes foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1, e 23 genes o foram como sendo mais expressos na linhagem P7. Vários dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem ST1 estão, direta ou indiretamente, relacionados a parada de crescimento e supressão de fenótipo tumoral. Em contrapartida, diversos dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem P7 codificam para receptores de fatores de crescimento peptídicos e seus respectivos ligantes. Em particular, foi detectado maior expressão, na linhagem P7, de receptores e Iigantes relacionados ao fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento para fibroblastos (FGFs) e, também, do fatores de crescimento da família de pleiotrofina/midquina (PTN/MDK), e seus respectivos receptores. Sabidamente, vários destes genes estão envolvidos na neoangiogênese e na fechamento de alças autócrinas/parácrinas de estímulo da proliferação tumoral, em particular de gliomas humanos. Além disso, estes achados foram coerentes com o maior potencial tumorigênico (-2,5x) apresentado pela linhagem P7, quando injetadas s.c. no dorso de animais imunocomprometidos (p<O,01). As linhagens ST1 e P7 foram originalmente isoladas como sendo sublinhagens derivadas da linhagem C6, cuja origem é donal. Assim, uma possível interpretação para as diferenças marcantes dos perfis de expressão detectadas entre as linhagens ST1 e P7, é de que estas diferenças sejam, mais provavelmente, a conseqüência de algumas poucas alterações moleculares em genes-chave, e não de alterações extensas do genoma celular, uma vez que as duas linhagens têm, a priorí, o mesmo \"background\" genético. Assim, um número limitado de aberrações genéticas adicionais, particulares de cada linhagem, seria suficiente para uma modificação substancial dos perfis de expressão gênica, se os genes alterados forem capazes de modular a expressão de vários outros genes. Na busca de indícios que fortalecessem esta hipótese, foi quantificado, em seis linhagens humanas de glioma, a expressão dos mesmos genes cuja expressão foi originalmente quantificada nas linhagens ST1 e P7. Em seguida, foram realizados testes de correlação em pares (Teste de Pearson) entre os níveis de expressão relativos destes genes para as seis linhagens, buscando identificar conjuntos de genes que apresentassem expressão coordenada, que, por sua vez, sugeririam a existência de possíveis relações regulatórias entre os mesmos. Foi possível observar expressão significativamente correlacionada de seis genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1 e SCG2), sugerindo uma possível co-regulação recíproca entre diferentes vias de fatores de crescimento e/ou um novo fator remodelador de cromatina (CHD7). Pararelamente, o gene CHD7 foi, por sua vez, identificado como um novo fator remodelador de cromatina putativo, cujo cDNA completo pode ser amplificado, com êxito, através de RT-PCR longo. A expressão destes mesmos seis genes foi quantificada, por Q-PCR, em 64 amostras clínicas de glioma e cérebro humano não-tumoral. Com exceção do gene SCG2, os demais cinco (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN e PTPRZ1) são significativamente mais expressos em todos os graus de glioma, quando comparados com cérebro humano não-tumoral (p<0,05). Foi possível verificar, inclusive, que os níveis de expressão de vários destes genes estão altamente correlacionados nessas amostras. Em particular, observou-se correlação com alta significância entre os genes CHD7xPDGFRA (p=4,7x10-17), FGF1 xPTN (p=1, 1x10-19), do receptor PTPRZ1 contra todos os demais genes (100-6<p<10-9) e, especificamente, contra seu Iigante PTN (p=1,6x10-14). Como os loci dos genes PTN e PTPRZ1 se encontram relativamente próximos (-15 Mb) numa região do cromossomo 7 humano, a qual frequentemente se encontra amplificada em gliomas humanos (7q), é possível que estes dois genes, codificantes para um fator de crescimento e seu respectivo receptor, façam parte de um novo amplicon em gliomas humanos. Além disso, vários genes com maior expressão na linhagem P7 (ALK, FGFR1, RNF130 e ROS01) estão, também, significativamente mais expressos em certos graus de gliomas humanos, quando comparados com tecido cerebral humano não-tumoral. De um modo geral, estes dados indicam que foi possível obter, a partir de linhagens de glioma de rato, incursões aplicáveis para um entendimento mais amplo da biologia que envolve a patogênese da doença humana. Um destes dados extrapoláveis entre diferentes modelos inter-espécies é que a co-expressão de múltiplas vias autócrinas de crescimento parece ser um achado comum tanto em modelos experimentais de glioma em rato quanto em linhagens e amostras clínicas de gliomas humanos, e que estas vias estão, potencialmente, interconectadas ao nível transcricional. Além disso, foi possível verificar que um novo gene codificante para um fator de remodelamento de cromatina (CHD7), apresenta níveis de expressão relativos muito aumentados em amostras clínicas de glioma, quando comparado com cérebro humano não-tumoral. Analisados em conjunto, os resultados obtidos aqui têm o potencial para conduzir ao desenvolvimento racional de novas estratégias terapêuticas e diagnósticas/prognósticas para gliomas humanos. A análise do papel funcional destes genes em glioma, e das vias moduladas por seus produtos, se constituirá de um passo fundamental para o estabelecimento destes genes como potenciais novos alvos terapêuticos e/ou marcadores moleculares. / Gliomas are among the most frequent and fatal tumors of the central nervous system. Despite the recent and important advances in the diagnostic and therapeutic fields, treatment of these tumors still is, in the vast majority of the cases, palliative. Surgical ressection of the tumor remains as the sole potentially curative resource, but only for the low grade gliomas. In the present work, differential gene expression profiles were analyzed between rat glioma cell lines differing in tumorigenic potential (ST1 and P7 cell lines), aimed at identifying genes with potential to become novel molecular markers and therapeutic targets for the human disease. As a first approach, a commercial macroarray-based screening was undertaken in order to identify differentially expressed genes between ST1 and P7 rat glioma cell lines. Three different sets of commercial membranes comprising 3,000 genes were hybridized against radiolabeled targets that were synthesized from mRNA extracted from both cell lines. As a result, near 2,000 genes were identified as being possibly differentially expressed between ST1 and P7 celllines. The relative expression levels of 40 genes from this list were analyzed by Northern blot, and six genes were successfully confirmed as being expressed at higher levels in the ST1 cell line, whereas four genes confirmed heightened expression in P7 cells. As a second approach, a large-scale, Affymetrix microarray-based screening was performed, which allowed measuring the relative expression levels of about 24,000 rat transcripts. This analysis led to the identification of 1,300 candidate differentially expressed genes, for which the differential expression ratios ranged from 2 up to >3,000. From these, -700 genes displayed preferential expression in the ST1 cell line, while around 500 genes were more expressed in P7 cells. The following step, namely, validation of the differential expression, was achieved through Real-Time PCR (Q-PCR). Expression levels of 49 genes were measured in four independent RNA preparations from ST1 and P7 cell lines. About 27 of these genes were identified as putative differentially expressed , 10 of which had previously been confirmed by Northern blot as differentially expressed and 12 additional genes were also included. From this list, 21 genes were confirmed by Q-PCR as being diferentially expressed between the ST1 and P7 cell lines, in addition to those 10 whose differential expression was confirmed by Northern Slol. In total, eight genes were confirmed as being differentially expressed in the ST1 cell line, and 23 genes were confirmed as being expressed at higher leveis in the P7 cells. Many of the genes confirmed as being differentially expressed genes in the ST1 cell line are, directly or indirectly, related to growth arrest and suppression of the malignant phenotype. On the other hand, several of the genes displaying elevated expression in the P7 cell line code for growth factor ligands and receptors related to the PDGFs (platelet-derived growth factors), FGFs (fibroblast growth factors) and PTN/MDK (pleiotrophin/midkine) growth factor families. Many of these genes are already known as being related to neoangiogenesis and to the establishment of autocrine/paracrine loops in human gliomas. In addition, these findings are in keeping with the significantly higher (p<O.01) tumorigenic potential displayed by the P7 cellline (-2,5x), when both cell lines are injected s.c. in the dorsal region of immunodeficient nude mice. Moreover, ST1 and P7 celllines were originally isolated as clonal celllines from the C6 cell line which, in turn, is also acionai cell line. Therefore, a possible interpretation for the remarkably different gene expression profiles between ST1 and P7 cell lines is that those differences are, most Iikely, a consequence of a few molecular defects in key/master genes, rather than extensive aberrations of the cellular genome, given that those celllines have, a priori, similar genetic backgrounds. Thus, a limited number of genetic aberrations, characterisitic of each cell line, would be sufficient for a substantial modification of the gene expression profiles, provided that the altered genes are able to modulate the expression of each other. In an attempt to investigate theis point, the relative expression levels of the same genes were analyzed by Q-PCR, and pairwise correlation tests (Pearson correlation tests) were performed using expression data from the six human glioma cell lines, aimed at identifying gene sets that displayed coordinate expression whichwould suggest the existence of putative regulatory loops among them. It was possible to identify a c1uster of six genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1, SCG2) that displays coregulated expression, thus suggesting a possible reciprocal co-regulation among distinct growth factor pathways and a putative chromatin remodeling factor (CHD7). Furthermore, the CHD7 gene was identified as a novel, putative chromatin remodeling factor, and its full-Iength cDNA could be successfully amplified by means of long RTPCR. The expression levels of the same genes was quantified, by Q-PCR, in 64 clinicai samples, comprising gliomas and non-tumoral human brain tissue samples. Except for the SCG2 gene, the remaining five genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN and PTPRZ1) were expressed at significantly higher levels in glioma samples of all grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples (p<O.05). Likewise, we were able to verify that expression levels for many of these genes are strictly correlated in those samples. A particularly high levei of significance was found for the correlation of expression levels between CHD7xPDGFRA (p=4.7x10-17) and also for the FGF1xPTN gene pair (p=1.1x10-19). A strikingly high level of significance (p=1.6x10-14) was also found for the expression levels between the PTPRZ1 receptor and its PTN ligand. Given that the PTN and PTPRZ1 loei are relatively close to each other (-15 Mb) on the long arm of human chromosome 7, which, in turn, is frequently amplified in human gliomas, the genomic region including these two genes may well constitute a novel amplicon in human gliomas. In addition, several other genes with higher expression in the P7 cell line (ALK, FGFR1, RNF130 and ROB01) are also expressed at significantly higher levels in certain glioma grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Overall, these data indicate that starting from the rat glioma cell lines model, it was possible to obtain, insights applicable to a better understanding of the biology underlying the pathogenesis of human gliomas. Thus, co-expression of multiple autocrine loops seems to be a commonplace in the rat experimental glioma models as well as in the human glioma cell lines and in clinicai samples, where these pathways are potentially interconnected at the transcriptional leveI. Furthermore, we were able to detect increased mRNA expression levels of a novel putative chromatin remodelling factor (CHD7) in human glioma tissue samples, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Taken together, the results obtained in this work may potentially lead to the rational development of novel therapeutic, diagnostic and prognostic strategies for human gliomas. Functional analysis of these genes in glioma, and the pathways modulated by their products, will be a fundamental step for the establishment of these genes as potentially novel therapeutic targets and/or molecular markers.

O iodeto reduz a expressão, cauda poli(A) e taxa de tradução do mRNA da NIS, a partir de 30 min de tratamento. O estudo atual objetivou caracterizar as bases moleculares envolvidas nesses efeitos inibitórios. Células PCCl3 foram tratadas com NaI (10-3M), por diferentes períodos de tempo, e avaliou-se: a meia-vida do mRNA de NIS; o papel das porções 3\'UTR/5\'UTR; o envolvimento de eventos transcricionais; a organização do citoesqueleto de actina; o conteúdo total, meia-vida, degradação, internalização e atividade de NIS; a ativação da via PI3K/Akt. Os resultados evidenciaram que o excesso de iodeto: reduz a meia-vida e interage com a porção 3\'UTR do mRNA de NIS; inibe a atividade do promotor de NIS; desorganiza o citoesqueleto de actina; reduz o conteúdo total, de membrana, a meia-vida e atividade de NIS; aumenta a internalização de NIS por clatrinas, e sua degradação por lissosomos; ativa a via PI3K/Akt. Conclui-se que o iodeto ativa diferentes mecanismos moleculares, transcricionais e pós-transcricionais, para promover o efeito inibitório sobre a expressão de NIS. / Iodide reduces NIS mRNA expression, poly(A) tail length and transcription rate, after 30 min of treatment. The present study aimed to caracterize the molecular basis involved in these inhibitory effects. PCCl3 cells were treated with NaI (10-3M) and assays were performed to evaluate: NIS transcript half-life; the role of NIS mRNA 3\'UTR/5\'UTR; the involvement of transcriptional events; the organization of actin cytoskeleton; the total content, half-life, degradation, internalization and activity of NIS; the activation of PI3K/Akt pathaway. The results indicatred that iodide excess: reduces NIS transcript half-life and interacts with its 3\'UTR portion; inhibits NIS promoter activity; disrupts the actin cytoskeleton; reduces NIS total and membrane content, NIS half-life and NIS activity; induces the internalization of NIS through clathrin and its degradation through lisosomes; activates the PI3K/Akt pathway. In conclusion, iodide activates different molecular mechanisms, transcriptional and post-transcriptional, to promoter the inhibitory effect on NIS expression.

As bactérias usam proteínas intracelulares de estocagem de ferro (ferritinas) que permitem acesso ao metal quando está em baixa quantidade. Neste trabalho, o papel das ferritina Bfr e Dps foi estudado através da análise de fenótipo de linhagens mutantes, e sua regulação foi estudada utilizando o gene repórter lacZ, em ensaios de atividade de <font face=\"Symbol\">b-galactosidase. Os resultados mostraram aumento de expressão de bfr em excesso de ferro, e que este gene é positivamente regulado por Fur. A expressão de dps teve aumento em carência de ferro e na fase estacionária. Ensaios de expressão nas linhagens mutantes <font face=\"Symbol\">DoxyR, <font face=\"Symbol\">DsRNA1 e <font face=\"Symbol\">DsRNA2, mostraram diferenças nos níveis de expressão em comparação aos atingidos na linhagem selvagem. O fator sigma ECF SigJ é importante para níveis máximos de expressão de bfr e o fator SigT para máxima expressão de dps. Foram deletadas as regiões codificadoras de bfr e dps separadamente, ou ambas. Os resultados mostraram que o mutante <font face=\"Symbol\">Ddps e o mutante duplo apresentaram maior sensibilidade a H2O2, tendo a linhagem <font face=\"Symbol\">Dbfr padrão similar à linhagem NA1000. O ensaio de quantificação de ferro mostrou que as ferritinas têm papel equivalente na estocagem de ferro intracelular. / Bacteria utilize intracellular iron storage proteins (ferritins) that allow access to the metal when it is present in low amount. In this study the role of ferritins Bfr and Dps was studied by analyzing the phenotype of mutant strains, and their regulation was studied using the lacZ reporter gene, in <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays. The results showed increased expression of bfr in iron excess, and that this gene is positively regulated by Fur. dps expression was increased under iron deficiency and in the stationary phase. Expression assays in the mutant strains <font face=\"Symbol\">DoxyR, <font face=\"Symbol\">DsRNA1 and <font face=\"Symbol\">DsRNA2 showed differences in expression levels compared to wild type. ECF sigma factor SigJ is important for maximum levels of bfr expression and SigT for maximal dps expression. The coding regions of bfr, dps or both have been deleted. The results showed that the <font face=\"Symbol\">Ddps and double mutant strains showed increased susceptibility to H2O2, and <font face=\"Symbol\">Dbfr showed a similar pattern to the NA1000 strain. The iron concentration determination showed that both ferritins play equivalent roles in intracellular iron storage.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-13T14:30:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T14:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) Previous issue date: 2001-09-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os genes Penicillium região pgg1 e pgg2, griseoroseum, codificadora do que codificam poligalacturonases foram clonados e gene pgg1 possui caracterizados. 1251 pares de em A bases (pb) e é interrompida por íntrons de 55 e 67 pb, posicionados por comparação com a seqüência do cDNA correspondente. Uma proteína de 376 aminoácidos (aas) foi obtida da tradução deste gene com e apresenta massa um molecular potencial e pI sítio estimados de em glicosilação 38,4 KDa (Asn 307 ), e 5,31, respectivamente. O gene pgg2, de 1165 pb, também é interrompido por dois íntrons de 58 pb. Os íntrons de pgg1 e pgg2 apresentam posições conservadas, embora o mesmo não tenha sido verificado com as suas seqüências. A proteína deduzida de pgg2 possui 369 aas, massa molecular 38,3 KDa, pI 8,31 e dois possíveis sítios de (Asn 300 glicosilação Asn 338 ). e A identidade entre as proteínas PGG1 e PGG2 foi de 57,5%. Análise mostrou por que hibridização do genes e os únicas no genoma gênero Penicillium pgg1 do fungo. foram DNA total de pgg2 estão Diferentes investigadas P. griseoroseum presentes espécies quanto em de à cópias fungos do presença de genes de PG em seu genoma. Os resultados revelaram que a essas espécies contêm PGs codificadas por poucos genes, ao contrário do observado possuem em Aspergillus famílias de genes niger de PG e Botrytis constituídas cinerea, por no que mínimo cinco membros. A expressão dos genes pgg1 e pgg2 foi analisada por hibridização do RNA total e pela técnica de RT-PCR. Ambos os genes são transcricionalmente regulados, porém com expressão diferenciada entre si. A expressão do gene pgg1 foi verificada apenas em 76 horas de cultivo do micélio em meio com pectina suplementado com extrato de levedura, enquanto o transcrito do gene pgg2 expressão fontes não foi de de com detectado ambos os carbono, em todos genes como também sacarose extrato de levedura. detectados apenas na presença adição extrato de levedura. pgg2 de os e tempos foi de analisada glicose, de pectina, Contudo, a em pgg1 ou foram independente expressão A outras suplementadas Transcritos de cultivo. do da gene foi reprimida somente em meio contendo glicose. A adição de extrato de levedura ao meio de cultivo contendo glicose teve um efeito positivo sobre a expressão de pgg2, embora um nível maior de expressão tenha sido verificado na presença de sacarose e pectina. As regiões 5’ terminais dos genes pgg1 e pgg2 foram sequenciadas para caracterizar cis-elementos e analisar a interação com proteínas reguladoras. Ensaios de migração retardada em gel foram realizadas para comprovar a funcionalidade de alguns cis-elementos. Extratos a a protéicos nucleares foram diferentes proteína preparados fontes foi reguladora de carbono. visualizada do gene de quando pgg2 micélio A crescido em meio formação de complexos fragmentos de DNA contendo os cis-elementos da com DNA- região CCAAT e TATAATTAA foram utilizados. Um possível elemento de resposta ao cAMP foi localizado na posição -757. A região reguladora do gene pgg1 possui um potencial sítio de ligação para o regulador geral CREA sobreposto ao TATA “box”, o que pode ser uma explicação para a ausência de expressão deste gene na presença de glicose. / The polygalacturonase-encoding Penicillium griseoroseum were genes cloned pgg1 and and pgg2 from characterized. The 1251-bp coding region of the pgg1 gene is interrupted by two introns of 55 and 67 bp deduced by comparison with the cDNA sequence. A potencial glycosilation nucleotide mass polypeptide sequence was 38.4 KDa of with 376 site at pgg1. and consists of 1165 bp introns. The positions amino The with a acids residues with a was predicted from protein estimated molecular Asn 307 pI of and is also of the introns 5.31. The pgg2 gene by two 58-bp interrupted were the conserved in both genes however no conservation was seen in their sequences. The pgg2 encodes a protein of 369 residues with estimated mass and pI of 38.3 glycosilation KDa sites and were 8.31, respectively. identified at Asn 300 Two and putative Asn . 338 Based on the deduced amino acid sequence, PGG1 shows 57.5% identity with PGG2. The genome pgg1 of analysis. and P. The pgg2 genes griseoroseum presence of exist as as single copies in the revealed by total DNA blot corresponding PG genes in otherPenicillium species was investigated and the results show that these enzymes are encoded by few genes. A different pattern is reported for Aspergillus niger and Botrytis cinerea where the PG gene family consists of at least five members. RT-PCR and was employed to investigate the expression of pgg1 pgg2 genes. Both genes are regulated at the transcription level, seen. although The pgg1 cultivation while in pgg2 analyzed. some differences gene was pectin Total RNA detected extracted expression after supplemented was was their expressed medium transcript in 76 with in from hours yeast all were extract, time mycelia of points grown on sucrose or glucose, with or without yeast extract. Pectin was the only condition tested that induced the expression of pgg1, even in the expressed absence under of almost yeast all pgg2-specific mRNA could medium the addition while extract. conditions be The studied. observed on yeast extract of pgg2 gene was However, no glucose-containing abolished this repressive effect. The 5’ regions of the pgg1 and pgg2 genes were sequenced in order to interaction of characterize with regulatory electrophoresis extracts were sources. cis-acting proteins mobility prepared from DNA-protein elements was shift mycelia complexes investigated assays. grown were and on their by means Crude nuclear different carbon visualized when DNA fragments containing CCAAT and TATAATTAA were used. A putative cAMP response element translation initiation pgg1 has gene a was site. potential detected The 5’ at –766 upstream binding site from sequence for the the of the global repressor CREA which overlaps the TATA box. This could explain the repressive effect of glucose on pgg1 expression. Only few cis-acting elements are shared by the and this could justify the pgg1 and pgg2 promoters differential expression of the polygalacturonase-encoding genes from P. griseoroseum.

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria com capacidade de colonizar diversos tipos de ambiente e infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Em humanos, comporta-se como um patógeno oportunista,estando frequentemente relacionada à infecções em indivíduos imunocomprometidos e indivíduos portadores de fibrose cística. Um mecanismo importante para a versatilidade de P. aeruginosa é o sistema de percepção de quórum (QS), onde a bactéria pode vincular expressão gênica à densidade populacional e às características do ambiente. Atualmente, sabe-se que muitos outros reguladores estão interligados com QS, entre eles, a proteína reguladora RsmA e os pequenos RNAs RsmZ e RsmY. Além disso, diversos fatores importantes para a patogenicidade da bactéria são reguladas por QS. Em P. aeruginosa PA14, um fator importante para a patogenicidade em diversos hospedeiros é a proteína KerV, cujo envolvimento com QS foi descrito pela primeira vez neste trabalho. A linhagem D12, que possui uma deleção no gene kerV, mostrou alterações em fenótipos regulados por QS, como a maior produção de piocianina, composto que contribui para virulência e persistência das infecções causada por P. aeruginosa. Por ser facilmente detectável e pela regulação de sua síntese não ter sido completamente explorada em PA14, a expressão dos genes responsáveis pela produção de piocianina é um interessante repórter na investigação do possível envolvimento de KerV com QS. Além de piocianina, D12 apresenta níveis reduzidos de ramnolipídeos. Esses fenótipos somados se assemelham aos fenótipos da mutação de rsmA, sugerindo o envolvimento de KerV com os sistemas QS e Gac-Rsm direta ou indiretamente. Neste trabalho, mostramos que KerV exerce um efeito negativo na regulação dos operons phz1 e phz2, responsáveis pela síntese de piocianina, alterando a expressão desses genes. KerV exerce também um efeito positivo na expressão da proteína RsmA, responsável pela repressão de diversos genes alvos, onde RsmA se liga ao sítio de ligação ao ribossomo no mRNA, impedindo a tradução. Ensaios de gel shift mostraram que a ligação direta de RsmA na sequência líder de phzA1 e phzA2 ocorre, elucidando a maneira pela qual KerV está envolvido na regulação da expressão dos operons phz em P. aeruginosa PA14. Mostramos também que phz2 é ativo e contribui para a síntese de piocianina, pois na ausência de phz1, os níveis do pigmento são maiores do que aqueles detectados em PA14. Isso sugere uma maior expressão de phz2 e uma regulação diferencial dos operons de acordo com as condições ambientais como possível estratégia para manter os níveis desse composto. Uma evidência dessa regulação diferencial é vista no mutante lasR. Na fase inicial de crescimento, esse mutante não produz piocianina, porém quando exposto a tempos mais longos de cultivo, a produção de piocianina é maior quando comparada a PA14. Isso é reflexo da ativação da expressão de phz1 no mutante lasR em fase estacionária tardia, enquanto phz2 permanece não expresso. Isso indica que phz2 é dependente de LasR, ainda que indiretamente. Já phz1, embora tenha sua expressão influenciada por LasR no estágio inicial de crescimento, na fase estacionária é regulado por outros fatores independentes de las. / Pseudomonas aeruginosa is a gammaproteobacterium that colonizes several environments and infects phylogenetically distinct hosts. It behaves as an opportunistic pathogen in humans, often related to infection in immunocompromised individuals and cystic fibrosis patients. An important mechanism for P. aeruginosa versatility is the quorum sensing (QS) network, that allows bacteria to link gene expression to population density and environmental traits. Several additional regulators are interconnected with QS, as the regulatory mRNA binding protein RsmA and the non-coding small RNAs RsmZ and RsmY. Futhermore, key factors for pathogenicity are QS-regulated. In P. aeruginosa PA14, an important pathogenicity-related factor is the KerV protein, described for the first time here as involved in QS. D12 strain, that harbor a deletion in the kerV gene, shows alterations in QS-regulated phenotypes, such as high production of pyocyanin, a compound that contributes to virulence and persistence of P. aeruginosa infections. As the production of pyocyanin is easily detected and all mechanisms involved in its synthesis regulation are not fully described, the expression of genes responsible for production of this pigment is a good reporter to investigate KerV involvement in the QS network. Additionally, D12 also shows lower levels of rhamnolipids, another QS-regulated trait. Taken together, these phenotypes resemble the effects of a rsmA mutation, suggesting KerV involvement with QS and Gac-Rsm systems. In this work, we propose that KerV exerts a negative effect in the regulation of phz1 and phz2 operons, responsible for pyocyanin synthesis, by alterating the expression of these genes. KerV also has a positive effect on rsmA expression, responsible for the repression of several genes by blocking the ribosome binding site preventing the translation. Gel shift assays showed that RsmA binds directly in the leader sequence of phzA1 and phzA2, elucidating the manner in which KerV is involved in the regulation of phz operons expression in P. aeruginosa PA14. We also demonstrate that phz2 is actively expressed and contributes to pyocyanin production in PA14, since in the phz1 mutant the levels of pyocyanin are even higher than in the wild type strain. This suggests a phz2 higher expression and a differential regulation of phz operons according to environmental changes as a mechanism to maintain the levels of pyocyanin synthesis. An evidence for this regulation is the synthesis of pyocyanin by the lasR mutant, which does not make pyocyanin at early growth stages. However, at late stationary phase, pyocyanin production is even higher than in the wild-type strain, reflecting the LasR-independent regulation of phz1 expression, while phz2 operon remains silent.

O presente trabalho tem como objetivo caracterizar três agrupamentos de genes da alfa proteobactéria Caulobacter crescentus envolvidos na resposta a metais e antibióticos. Analisamos o agrupamento composto pelos genes CC1637-CC1640, que contém um sistema BlaR/BlaI de transdução de sinal, e realizamos uma análise comparativa de dois sistemas de efluxo da família RND composto pelos genes CC2720-CC2725 e CC2388-CC2390 que estariam envolvidos na resposta a metais cádmio e zinco. Mutantes simples e duplos com deleção em fase foram obtidos, e o estudo da atividade promotora foi realizado através de ensaio de <font face=\"Symbol\">b-galactosidase utilizando gene repórter lacZ . Ensaios de RT-PCR e atividade <font face=\"Symbol\">b-galactosidase mostraram que o gene CC1638 provavelmente não possui promotor próprio e que os genes CC1637- CC1640 podem consituir um operon. A atividade promotora do gene CC1640 não responde a H2O2, Cd2+ e Zn2+, mas a linhagem <font face=\"Symbol\">DCC1640 apresentou baixa viabilidade na presença de Cd2+. As linhagens <font face=\"Symbol\">DCC1637 e <font face=\"Symbol\">DCC1638 mostraram sensibilidade a t-butil-hidroperóxido. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC1640 mostrou-se sensível aos antibióticos CTX e PPT, e ensaios de <font face=\"Symbol\">b-galactosidase em placa e em meio liquido mostraram indução da expressão pelos antibióticos CTX e CFE. Observamos uma auto-regulação do operon pela proteína codificada pelo gene CC1640 (BlaI), confirmado por ensaios de EMSA. A presença de BlaR inibe a ligação da proteína BlaI ao promotor, sugerindo que ambas BlaI/BlaR regulem em conjunto o promotor do gene CC1640. Análise in silico do consenso TTACGNNCGTAA localizado no promotor de CC1640 identificou esta sequência na região promotora de outros genes. A análise da expressão relativa sugere que os genes CC1568, CC1230 e CC2661 são regulados pela proteína BlaI, sugerindo que BlaI regula a expressão de outros genes possivelmente envolvidos na resposta a antibióticos <font face=\"Symbol\">b-lactâmicos. Ensaios de atividade <font face=\"Symbol\">b-galactosidase da região intergênica CC2720-CC2721 mostraram que esta não possui atividade promotora, e análise por RT-PCR confirmou que os genes CC2720-CC2721 são co-transcritos e que fazem parte do operon CC2720-CC2725. A expressão do operon mostrou indução significativa na presença de Cd2+, moderada indução na presença de Zn2+ e Co2+, e pouca indução na presença de Ni2+. A expressão do operon CC2388-CC2390 é altamente induzida na presença de níquel e cobalto, não é induzida por cádmio e moderadamente induzida por zinco. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC2724 não é sensível a zinco, cobalto ou níquel. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC2390 é sensível a cobalto, pouco sensível a níquel e não sensível a zinco, e ambas as linhagens foram sensíveis a cádmio. A obtenção do duplo mutante, assim como sua complementação, foram realizadas, e os resultados sugerem que se trata de dois sistemas de efluxo com diferentes respostas a metal. / The aim of this work is to characterize three clusters of genes from the alpha proteobacterium Caulobacter crescentus involved in metal and antibiotics response. We analyzed the cluster comprising genes CC1637-CC1640, which contains a BlaR/BlaI signal transduction system, and we performed a comparative analysis with two RND efflux systems consisting on genes CC2720-CC2725 and CC2388-CC2390, which are probably involved in cadmium and zinc response. Mutant strains for one or two of these genes were obtained, and the study of promoter activity was performed by <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays using lacZ as reporter gene. RT-PCR and <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays revealed that the CC1638 gene probably does not possess an exclusive promoter, and that the genes CC1637-CC1640 may constitute an operon. The promoter of CC1640 does not respond to H2O2, Cd2+ and Zn2+, but the <font face=\"Symbol\">DCC1640 strain presented low viability in the presence of Cd2+. The <font face=\"Symbol\">DCC1637 and <font face=\"Symbol\">DCC1638 strains showed sensitivity to t-butyl-hydroperoxide. The <font face=\"Symbol\">DCC1640 strain showed sensitivity to the antibiotics CTX and PPT, and <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays performed both on plates and liquid medium showed induction of the expression by the presence of antibiotics CTX and CFE. We observed auto-regulation of the operon by the protein encoded by the CC1640 gene (BlaI), which was confirmed by EMSA assays. The presence of BlaR inhibits the binding of the BlaI protein to the promoter, suggesting that both BlaI/BlaR regulate the CC1640 gene promoter. In silico analyses for the TTACGNNCGTAA consensus, located on CC1640 promoter, identified this sequence in promoter regions of other genes. Relative expression analyses indicate that the genes CC1568, CC1230 and CC2661 are regulated by the BlaI protein, suggesting that BlaI regulates the expression of other genes, possibly involved in <font face=\"Symbol\">b-lactamic antibiotics response. <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays of the intergenic region CC2720-CC2721 showed that it does not possess promoter activity, and a RT-PCR analysis confirmed that the genes CC2720-CC2721 are co-transcribed and belong to the CC2720-CC2725 operon. The expression of the operon showed significant induction in the presence of Cd2+, moderate induction in the presence of Zn2+ and Co2+, and a slight induction in the presence of Ni2+. The expression of the CC2388-CC2390 operon is highly induced in the presence of nickel and cobalt, not induced by cadmium and moderately induced by zinc. The <font face=\"Symbol\">DCC2724 strain is not sensitive to zinc, cobalt or nickel. The <font face=\"Symbol\">DCC2390 strain is sensitive to cobalt, slightly sensitive to nickel and not sensitive to zinc, and both strains are sensitive to cadmium. A double mutant was constructed, as well as a complemented strain, and results suggest that these are two efflux systems with distinct metal responses.

Atualmente, as cepas de S. cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível no Brasil são leveduras diplóides que metabolizam a sacarose através da sua hidrolise extracelular pela invertase periplasmática, seguida pelo transporte para o interior da célula das moléculas de glicose e frutose formadas, e posterior metabolização pela glicólise. Neste trabalho, utilizando técnicas de engenharia genética e posteriores cruzamentos, foram desenvolvidas cepas diplóides de S. cerevisiae capazes de consumir este açúcar por meio da sua captação direta pelo transportador codificado pelo gene AGT1, e hidrólise intracelular pela invertase citoplasmática codificada por uma versão modificada do gene SUC2. Estas modificações permitiram alcançar um rendimento 10% maior na produção de etanol, além de aumentar a velocidade de consumo da sacarose e diminuir a quantidade de açúcares residuais ao final do processo. Estes resultados abrem novos horizontes para tornar a produção de etanol no Brasil mais eficiente. / Currently, the S. cerevisiae strains used in industrial production of fuel alcohol in Brazil are diploid yeasts that of metabolize sucrose through its extracellular hydrolysis by the periplasmic invertase, followed by the transport of the formed glucose and fructose into the cells, and further metabolism through glycolysis. In this study, utilizing genetic engineering techniques and further crosses, diploid strains of S. cerevisiae were developed that are able to consume this sugar through its direct uptake by the transporter encoded by the AGT1 gene, and intracellular hydrolysis by the cytoplasmic invertase encoded by a modified version of the SUC2 gene. These modifications allowed achieving a 10% higher yield in the production of ethanol, besides increasing the sucrose consumption rate and decreasing the amount of residual sugars at the end of the process. These results open new horizons to turn ethanol production in Brazil more efficient.