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Repressão pelo Metabólito de Nitrogênio em Dekkera bruxellensisCAJUEIRO, Danielli Batista Bezerra 12 June 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-06-12 / CAPES / As fontes de nitrogênio do meio são classificadas como preferenciais e nãopreferenciais,
de maneira que as primeiras inibem a expressão dos genes
responsáveis pela metabolização das segundas por um mecanismo chamado de
Repressão Catabólica do Nitrogênio (Nitrogen Catabolic Repression - NCR). No
presente estudo avaliamos o padrão de regulação dos genes do metabolismo central
do nitrogênio na levedura Dekkera bruxellensis. Foram definidos quatro grupos de
fontes de nitrogênio baseados no crescimento celular. Em seguida, o padrão de
expressão dos genes do metabolismo central do nitrogênio mostrou que fenilalanina,
embora do grupo quatro, é o maior indutor das permeases Gap1p e Put4p,
resultando em sua elevada taxa de consumo. Já a histidina, indutora da permease
Put4p, promove maior indução dos genes que codificam as enzimas de assimilação
de amônia. Quando o mecanismo NCR é inibido pela presença de metionina
sulfoximina no meio, ocorre a desrrepressão dos genes que codificam as
permeases. E finalmente, os resultados mostram que nitrato, definido no grupo dois
induz o mecanismo de sinalização intracelular de regulação gênica semelhante ao
que se observa quando as células estão no estado de privação de nitrogênio no
meio. Isto complementa os estudos anteriores nos quais mostramos que a
assimilação de nitrato altera o estado fisiológico da célula para respiração mesmo na
presença de alta concentração de glicose no meio. / The nitrogen sources in the medium are classified as preferential or non-preferrential,
so that the first inhibit expression of genes responsible for metabolism of the latter by
a mechanism called Nitrogen Catabolic Repression (NCR). In the present study we
evaluated the pattern of gene regulation of the central nitrogen metabolism in yeast
Dekkera bruxellensis. It was defined four groups of nitrogen sources based on cell
growth. Then, the expression pattern of the central nitrogen metabolism genes
showed that phenylalanine, though belonging to group four, is the biggest inducer of
genes of permeases Gap1p Put4p, resulting in its high consumption rate. Moreover,
histidine induces the gene encoding permease Put4p and promoted the highest
induction of the genes encoding the enzymes of ammonia assimilation. When the
NCR mechanism was inhibited by the presence of methionine sulfoximine in the
medium there was derepression of the genes encoding for permeases. Finally, the
results showed that nitrate, defined in the group two, induced the intracellular
signaling pathway gene regulation similar to that seen when cells are in a state of
nitrogen deprivation in the middle. This complements our previous studies that
showed that the nitrate assimilation alter the physiological state of the cell to
respiration even in presence of high glucose concentration in medium.
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Análise de moléculas envolvidas no metabolismo de nitrogênio no fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis / Analysis of molecules involved in nitrogen metabolism of the human pathogenic fungi Paracoccidioides brasiliensisSilva, Lana OHara Souza 22 February 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Paracoccidioides genus is composed of thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic human systemic mycosis in Latin America. These organisms grow as mycelium in temperatures below 28 °C and as yeast form in temperatures above 37 °C. Nitrogen is an important element in this microorganism’s nutrition that participates in the synthesis of proteins, nucleic acids and others biomolecules. In this regard, nitrogen uptake and metabolism are essential to growth and fungal establishment. When nitrogen levels and sources such as glutamine and ammonia concentration are limited, pathogenic fungus use a regulation system called Nitrogen Catabolic Repression that induces the expression of genes encoding permeases and enzymes required for the catabolism of secondary nitrogen sources, such as formamidase, gamma-glutamiltranspeptidase and urease. Gamma-glutamiltranspeptidase is an enzyme that catalyzes the first reaction of glutationa degradation and it has been the target of several studies about nitrogen starvation in various fungi. It has been observed that the expression of the gene encoding this enzyme was induced in limiting conditions of nitrogen and was repressed when the availability of nitrogen was high. Urease is an enzyme that catalyzes the degradation of urea in ammonia and carbonic acid. This enzyme is already known as a virulence factor in fungi such as Cryptococcus. neoformans, and also has been the target of studies about nitrogen starvation. In this study we expressed gamma-GT and urease proteins from Paracoccidioides brasiliensis, isolate Pb18, in Escherichia coli. The gene coding for Ggt and Ure were cloned in pET32a expression vector, and used for E. coli pLysS transformation. The recombinant proteins produced were shown to be catalytically active. Together, data obtained in this work could add knowledge about the role of gamma-GT and urease and can be used as a foundation for complementary experiments regarding nitrogen metabolism regulation, as well as in Paracoccidioides spp pathogenesis. / Resumo:
O gênero Paracoccidioides é composto por fungos termodimórficos que causam a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana endêmica na América Latina. Quando cultivados em temperaturas menores que 28 °C o fungo cresce como micélio e em temperaturas em torno de 37 °C, como levedura. O nitrogênio é um importante nutriente para os micro-organismos, pois participa da síntese de proteínas, ácidos nucléicos e outras biomoléculas. Nesse sentido, a captação e o metabolismo de nitrogênio são essenciais para o crescimento e o estabelecimento do fungo no hospedeiro. Quando os níveis de nitrogênio e fontes como glutamina e amônia estão em concentrações limitantes, os fungos patogênicos utilizam um sistema de regulação chamado Repressão Catabólica de Nitrogênio que induz a expressão de genes que codificam permeases e enzimas necessárias para o catabolismo de fontes secundárias de nitrogênio como a formamidase, a gama-glutamil transpeptidase e a urease. A gama-glutamil transpeptidase é uma enzima que catalisa a primeira reação da degradação da glutationa. Ela tem sido alvo de estudos de privação de nitrogênio em diversos fungos, nos quais foi observada uma alta expressão do gene codificador dessa enzima em condições limitantes de nitrogênio, enquanto que, em alta disponibilidade de nitrogênio a sua expressão era reprimida. A urease é uma enzima que degrada uréia em amônia e ácido carbônico. Ela já é conhecida por ser um fator de virulência em alguns fungos, como Cryptococcus neoformans, e também tem sido alvo de estudos de privação de nitrogênio. Neste estudo nós expressamos as proteínas gama-GT e urease de Paracoccidioides brasiliensis, isolado Pb18, em sistema heterólogo bacteriano de Escherichia coli. O fragmento dos genes codificadores de Ggt e Ure foram clonados em vetor de expressão pET32a e os respectivos clones foram utilizados na transformação de células de E. coli pLySs. As proteínas recombinantes produzidas mostraram estar cataliticamente ativas. Os dados obtidos neste trabalho puderam acrescentar conhecimentos sobre as enzimas gama-GT e urease e podem ser usados como base para experimentos complementares em relação à regulação do metabolismo de nitrogênio bem como na patogênese de Paracoccidioides spp.
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