Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-14T19:03:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lana OHara Souza Silva - 2017.pdf: 3124489 bytes, checksum: 38e1e83b1c39e6954300e0cd3e709f2a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-20T12:27:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lana OHara Souza Silva - 2017.pdf: 3124489 bytes, checksum: 38e1e83b1c39e6954300e0cd3e709f2a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T12:27:41Z (GMT). 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When nitrogen levels and sources such as glutamine and ammonia concentration are limited, pathogenic fungus use a regulation system called Nitrogen Catabolic Repression that induces the expression of genes encoding permeases and enzymes required for the catabolism of secondary nitrogen sources, such as formamidase, gamma-glutamiltranspeptidase and urease. Gamma-glutamiltranspeptidase is an enzyme that catalyzes the first reaction of glutationa degradation and it has been the target of several studies about nitrogen starvation in various fungi. It has been observed that the expression of the gene encoding this enzyme was induced in limiting conditions of nitrogen and was repressed when the availability of nitrogen was high. Urease is an enzyme that catalyzes the degradation of urea in ammonia and carbonic acid. This enzyme is already known as a virulence factor in fungi such as Cryptococcus. neoformans, and also has been the target of studies about nitrogen starvation. In this study we expressed gamma-GT and urease proteins from Paracoccidioides brasiliensis, isolate Pb18, in Escherichia coli. The gene coding for Ggt and Ure were cloned in pET32a expression vector, and used for E. coli pLysS transformation. The recombinant proteins produced were shown to be catalytically active. Together, data obtained in this work could add knowledge about the role of gamma-GT and urease and can be used as a foundation for complementary experiments regarding nitrogen metabolism regulation, as well as in Paracoccidioides spp pathogenesis. / Resumo: O gênero Paracoccidioides é composto por fungos termodimórficos que causam a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana endêmica na América Latina. Quando cultivados em temperaturas menores que 28 °C o fungo cresce como micélio e em temperaturas em torno de 37 °C, como levedura. O nitrogênio é um importante nutriente para os micro-organismos, pois participa da síntese de proteínas, ácidos nucléicos e outras biomoléculas. Nesse sentido, a captação e o metabolismo de nitrogênio são essenciais para o crescimento e o estabelecimento do fungo no hospedeiro. Quando os níveis de nitrogênio e fontes como glutamina e amônia estão em concentrações limitantes, os fungos patogênicos utilizam um sistema de regulação chamado Repressão Catabólica de Nitrogênio que induz a expressão de genes que codificam permeases e enzimas necessárias para o catabolismo de fontes secundárias de nitrogênio como a formamidase, a gama-glutamil transpeptidase e a urease. A gama-glutamil transpeptidase é uma enzima que catalisa a primeira reação da degradação da glutationa. Ela tem sido alvo de estudos de privação de nitrogênio em diversos fungos, nos quais foi observada uma alta expressão do gene codificador dessa enzima em condições limitantes de nitrogênio, enquanto que, em alta disponibilidade de nitrogênio a sua expressão era reprimida. A urease é uma enzima que degrada uréia em amônia e ácido carbônico. Ela já é conhecida por ser um fator de virulência em alguns fungos, como Cryptococcus neoformans, e também tem sido alvo de estudos de privação de nitrogênio. Neste estudo nós expressamos as proteínas gama-GT e urease de Paracoccidioides brasiliensis, isolado Pb18, em sistema heterólogo bacteriano de Escherichia coli. O fragmento dos genes codificadores de Ggt e Ure foram clonados em vetor de expressão pET32a e os respectivos clones foram utilizados na transformação de células de E. coli pLySs. As proteínas recombinantes produzidas mostraram estar cataliticamente ativas. Os dados obtidos neste trabalho puderam acrescentar conhecimentos sobre as enzimas gama-GT e urease e podem ser usados como base para experimentos complementares em relação à regulação do metabolismo de nitrogênio bem como na patogênese de Paracoccidioides spp.