Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T12:38:14Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T12:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) Previous issue date: 2004-03-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A seqüência de nucleotídeos contendo o gene ple1 que codifica pectina liase em Penicillium expansum foi clonada. Esta seqüência contém 874 nucleotídeos da região promotora, 1342 nucleotídeos da região codificadora e 469 nucleotídeos da região terminadora. A região codificadora do gene ple1 é interrompida por dois íntrons, de 101 e 116 nucleotídeos, confirmados pela seqüência do cDNA. Na seqüência da região promotora de ple1 foi observado cis-elementos envolvidos na regulação da expressão desse gene, como TATA box (TATATAA) na posição -91 do códon de início da tradução, sendo esta seqüência precedida por uma região rica em pirimidinas e CAAT box (CCAATT) a -568 do códon de inicio da tradução. A proteína PLE1, deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 resíduos de aminoácidos, com massa molecular estimada de 40,1 KDa e pI calculado de 9,46. Análise por hibridização do DNA total de P. expansum e P. griseoroseum com um fragmento de DNA de 2,1 Kb que corresponde ao gene pelA de A. niger, indicou organização semelhante dos genes de PL no genoma destes fungos. A expressão do gene ple1, avaliada pela hibridização do RNA total com um fragmento de DNA que corresponde à região estrutural do gene ple1 mostrou que o transcrito foi detectado durante todo tempo de cultivo em presença de pectina. No entanto, quando cultivado em presença de sacarose, o transcrito somente foi detectado em 12 e 24 horas de cultivo, com adição de extrato de levedura. A caracterização morfológica de P. expansum e P. griseoroseum mostrou diferenças nítidas tanto no diâmetro quanto na coloração do verso das colônias destes fungos. Diferenças na organização da região subtelomérica dos cromossomos de P. expansum e P. griseoroseum, foram observadas quando o plasmídeo pTEL13 foi utilizado como sonda. A região ITS do rDNA de P. expansum tem 600 pb e de P. griseoroseum 594 pb. As linhagens transformantes obtidas com os plasmídeos pPlg1 e pNPG1, apresentaram aumentos na atividade de PL de no máximo 3 vezes. Análise por hibridização do DNA total dos transformantes indicou a ocorrência de integrações homólogas e heterólogas de pelo menos duas cópias do gene plg1. Foi construído um vetor de expressão, denominado pAN52-Plg1 que continha o gene plg1 sob o controle do promotor forte constitutivo do gene (gpdA) de A. nidulans. A transformação da linhagem mutante PG63 utilizando este vetor e o pNPG1, resultou na obtenção de uma linhagem recombinante (105) com aumento de 58 vezes na atividade de PL, quando cultivada em presença de glicose como fonte de carbono. Seis linhagens recombinantes foram avaliadas por hibridização apresentando integração heteróloga de mais de uma cópia do gene plg1 no genoma. Avaliação das proteínas extracelulares por eletroforese (SDS-PAGE) mostrou a presença de uma banda nítida e forte de aproximadamente 40 KDa presente no sobrenadante de cultivo da linhagem recombinante 105 que corresponde a PLG1. A atividade específica aparente de PL sintetizada por esta linhagem foi 44 e 27 vezes maior do que aquela obtida para linhagem mutante PG63 e de uma preparação comercial de pectinases “Citrus Clear”, respectivamente. O cultivo da linhagem recombinante 105 em meio contendo caldo de cana promoveu uma atividade de PL 132 vezes maior do que a atividade obtida pela linhagem PG63 cultivada nesta mesma fonte de carbono. A atividade de PL da linhagem recombinante 105, cultivada em diferentes volumes de meio, aumentou linearmente com o tempo. Pectina cítrica, quando utilizada como substrato, promoveu maior atividade de PL. A enzima mostrou ser estável em ampla faixa de pH e temperatura de armazenamento. Estes resultados mostram que a linhagem recombinante 105 é promissora para produção de PL em escala industrial, principalmente, para aplicação na indústria de sucos e vinhos, onde o emprego apenas da PL apresenta várias vantagens na qualidade do produto final. / The sequence of the pectin lyase-enconding gene ple1, from Penicillium expansum, was cloned. This sequence consists of 874 nucleotides of the promoter region, 1342 nucleotides of the coding region, and 469 nucleotides of the terminator region. The coding region of ple1 is interrupted by two introns of 101 and 116 nucleotides, confirmed by cDNA sequencing. Two cis-elements, TATA box (TATATAA) and CAAT box (CCAATT), were found at the positions 91 and 568 upstream from the translation start code, respectively. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLE1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N- glycosylation site was found at Asn 112 . Southern blot analysis of genomic DNA from P. expansum and P. griseoroseum with a 2.1 kb-DNA fragment of the gene pelA from A. niger indicated that this gene is similarly organized in the genomes of these fungi. The hibridization of total RNA with a fragment of the coding region of ple1 showed that the transcript was detected diring the whole of cultivation in a medium containing pectin. However, when the fungus was cultivated in the presence of sucrose with addition of yeast extract, the transcript was detected only at 12 and 24 hours of cultivation. The morphologic characterization of P. expansum and P. griseoroseum showed clear differences in the xdiameter and in the coloration of the botton of the colonies. Differences in the organization of the subtelomeric region of chromosomes of P. expansum and P. griseoroseum, were observed when the plasmid pTEL13 was used as a probe. The ITS region of the rDNA of P. expansum has 600 bp and that of P. griseoroseum 594 bp. The transformants obtained with the plasmids pPlg1 and pNPG1 presented increases in the activity of PL of at the least 3 times the active of the wild type. The hibridization profile of the genomic DNA of the transformants showed the occurrence of homologous and heterologous integrations of at least two additional copies of the gene plg1 in the genome. It was not possible to define the exact number of copies and correlate it with PL activity. An expression vector was built, designated pAN52-Plg1 that contained the gene plg1 under the control of the strong constitutive promoter gpdA of A. nidulans. The transformation of the mutant strains PG63 using this vector and the pNPG1 resulted in the isolation of a recombinant strain (105) with a PL activity 58 times higher than that of the wild type, when cultivated in glucose as the sole carbon source. Six recombinants were analised by hybridization that presented heterologous integration of more than one copy of plg1. Evaluation of the extracellular proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) showed the presence of a clear and strong band of approximately 40 KDa in the cultivation filtrate of the recombinant 105. This band corresponded to PLG1. The apparent specific activity of PL synthesized by this strain was 44 and 27 times higher than that obtained for the strain PG63 and for a commercial preparation of pectinolytic enzymes (Citrus Clear), respectively. The cultivation of the recombinant strain 105 in a medium containing sugar cane juice promoted a PL activity that was 132 times higher than that for the strain PG63 cultivated with the carbon source. PL activity of the recombinant strain 105, cultivated in different volumes of medium, increased linearly with time. Citric Pectin, when used as substrate, supported higher PL activity. The enzyme was stable in a wide range of pH and storage temperature.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo correto.pdf: 535635 bytes, checksum: 2ca42e241dd388099a705af6f2c401d0 (MD5) Previous issue date: 2008-10-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Filamentous fungi are recognized as excellent producers of extracellular enzymes and the genetically modified strains have made possible the production of pectinases with greater specificity and purity, better use of raw materials and lower production of waste. The production of pectin lyase (PL) and polygalacturonase (PG) by genetically modified strain Penicillium griseoroseum T20 has been studied. The response surface methodology (RSM) was used to optimize PL and PG production. The parameters sucrose concentration and cultivation time were evaluated. The highest PL production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 87.7 h in sucrose 15.7 g/L and the highest PL estimated activity was 2428 U/ml. The higher PG production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 83.8 hours and the highest PG estimated activity was 9465 U/ml. The sucrose concentration showed no significant influence on the production of this enzyme. The optimization in Erlenmeyer flasks was followed by the scaleup to 10 L bioreactor. The aeration conditions were evaluated and the highest PL and PG activity was observed in 1.0 L of air per minute. Under this condition, the strain showed low protease activity, just in the final period of cultivation, and β-glucosidase activity was not detected. The protein profile of the recombinant strain T20 showed the presence of two distinct bands of with approximately 38 and 36 kDa. These bands corresponded to PL and PG, respectively. The mycelial growth of the strain P. griseoroseum T20 has been studied by RSM, and the maximum mycelial dry weight observed was 8.63 g/L, on 30 g/L sucrose and 120 hours of cultivation. The mycelial morphology suggested a link between the occurrence of free and dispersed hyphae and the production of PL and PG. The kinetic parameters of fermentation were determined and compared between the scales of PL and PG production. The maximum total protein was 9.1 and 9.5 mg/L in cultures of 200 ml and 10 L, respectively. The specific PL (PspePLp) and PG (PspePGp) activities in relation to total protein were 353 and 613 U/g at 200 mL cultivation and 305 and 1106 U/g at 10 L cultivation, respectively. The maximum yield of PL (PdPL) and PG (PdPG) observed were 33.4 and 73.3 U/mL.h at 200 mL cultivation and 24.1 and 289 U/L.mL.h at 10 L. The performance parameters of PL (RPL/S) and PG (RPG/S) were 214 and 352 at 200 ml cultivation and 87.4 and 1049 at 10 L, respectively. The PL and PG production between P. griseoroseum T20 and P. griseoroseum wide type strain was compared. Increases of more than 400 times in the PL production and at least 14 times in the PG production were observed. The results suggest the great potential for industrial application of this strain for the production of PL and PG. / Fungos filamentosos são reconhecidos como excelentes produtores de enzimas extracelulares e as linhagens geneticamente modificadas têm tornado possível a produção de pectinases com maior especificidade e pureza, melhor utilização de matéria-prima e menor produção de resíduos. O processo de produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) pela linhagem geneticamente modificada Penicillium griseoroseum T20 foi estudado. As condições ótimas de cultivo para a produção de PL e PG foram determinadaspor meio da Metodologia de Superfície de Resposta (RSM). A maior produção de PL em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 87,7 h em meio contendo sacarose em concentração inicial de 15,7 g/L, sendo a maior atividade de PL estimada de 2.428 U/mL. A maior produção de PG em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 83,8 h, sendo a maior atividade de PG estimada de 9.465 U/mL. A concentração de sacarose não mostrou influência significativa sobre a produção dessa enzima. Após otimização dos fatores tempo de cultivo e concentração de sacarose em Erlenmeyers, foi feito o escalonamento para biorreator com 10 L de trabalho. A condição de aeração que proporcionou a maior atividade de PL e PG foi de 1,0 L de ar por minuto. Nessa condição, a linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo e não foi detectada atividade de β-glicosidase. O perfil protéico da linhagem recombinante T20 mostrou a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, correspondentes à PG e à PL, respectivamente. O crescimento micelial da linhagem P. griseoroseum T20 foi estudado por meio da RSM, e a massa micelial seca máxima estimada foi de 8,63 g/L, na condição de 30 g/L de sacarose após 120 horas de cultivo. A avaliação da morfologia micelial sugeriu a existência de uma relação entre a ocorrência de hifas livres e dispersas e a produção de PL e PG. Os parâmetros cinéticos da fermentação foram determinados e comparados entre as escalas de produção de PL e PG. A proteína total máxima observada foi de 9,1 e 9,5 mg/L nos cultivos de 200 mL e 10 L, respectivamente. As atividades específicas de PL (PspePLp) e PG (PspePGp) em relação à proteína total foram de 353 e 613 U/μg no cultivo em 200 mL e de 305 e 1.106 U/μg no cultivo em 10 L, respectivamente. As produtividades enzimáticas máximas de PL (PdPL) e PG (PdPG) observadas foram de 33,4 e 73,3 U/mL.h em 200 mL e de 24,1 e 289 U/mL.h em 10 L. Os parâmetros rendimento de PL (RPL/S) e de PG (RPG/S) calculados foram de 214 e 352 no cultivo em 200 mL e de 87,4 e 1.049 no cultivo em 10 L, respectivamente. A produção de PL e PG entre as linhagens P. griseoroseum T20 e P. griseoroseum selvagem foi comparada e aumentos de mais 400 vezes na produção de PL e de pelo menos 14 vezes na produção de PG foram observados. Os resultados sugerem o grande potencial de aplicação industrial dessa linhagem para a produção de PL e PG.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4447.pdf: 11266317 bytes, checksum: 6b1120210ec06b96c9b2a338298384a7 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Microorganisms, known as being relatively simple, have shown a great adaptation power to different nutritional situations by changing their metabolism with lack or supply of nutrients in the culture medium. This feature allows a wide range of the use of microorganisms to produce metabolites with several interests. This study has been named OSMAC (One Strain Many Compounds) approach, which was applied in this study by using two fungi from Penicillium genus. Through culture medium modification with FeCl3 during growth of P. brasilianum, it was able to produce isoquinolinic alkaloid. On the other hand, the addition of CaCl2, another alkaloid belonging to tremogenic class was isolated and analysed by spectroscopic methods. When P. griseoroseum was cultivated with NH4Br, it was observed the production of a halogenated secondary metabolite, which was not reported before (brominated roquefortine C). Analyses by GC/MS led to detect three phenolic compounds with bromine atoms in its structure. The secondary metabolites of P. griseoroseum with no modification in the culuture medium were studied and three metabolites were isolated. Two of them belong to the tetronic acid class and the other one was isolated as a dimer from clavatol. Analyses by LC/ MS-MS were able to identify other tetronic acids in the ethyl acetate extract from P. griseoroseum. / Os microorganismos, por serem de organização relativamente simples, têm um poder de grande adaptação a variadas situações nutricionais, modificando seu metabolismo com a carência ou com o fornecimento de nutrientes ao meio de cultivo. Isso permite uma ampla flexibilidade em sua utilização, podendo-se induzir microorganismos a produzir determinadas substâncias de interesse. Esta abordagem pode levar a uma variedade de novos metabólitos secundários interessantes a partir de uma única cepa de um microorganismo. Este estudo vem sendo denominado de abordagem OSMAC (One Strain Many Compounds), a qual foi utilizada no presente trabalho com dois fungos do gênero Penicillium. Foi verificado que ao modificar o meio de cultura com FeCl3 durante o crescimento de P. brasilianum houve a produção de um alcalóide isoquinolínico, enquanto com a adição de CaCl2 houve a produção de outro alcalóide pertencente à classe dos alcalóides tremogênicos. Com relação ao fungo P. griseoroseum, foi isolado um metabólito halogenado (roquefortina C contendo um átomo de bromo) quando ao meio de cultura foi adicionado NH4Br. As substâncias isoladas foram analisadas por técnicas espectroscópicas. Também foram detectados por GC/MS mais três compostos fenólicos contendo átomos de bromo em sua estrutura. O metabolismo secundário de P. griseoroseum foi analisado e foram isolados policetídeos pertencentes à classe dos ácidos tetrônicos e um dímero do clavatol, inédito na literatura. Análises por LC/MS-MS detectaram outros ácidos tetrônicos presentes no extrato de acetato de etila.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-13T14:30:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T14:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) Previous issue date: 2001-09-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os genes Penicillium região pgg1 e pgg2, griseoroseum, codificadora do que codificam poligalacturonases foram clonados e gene pgg1 possui caracterizados. 1251 pares de em A bases (pb) e é interrompida por íntrons de 55 e 67 pb, posicionados por comparação com a seqüência do cDNA correspondente. Uma proteína de 376 aminoácidos (aas) foi obtida da tradução deste gene com e apresenta massa um molecular potencial e pI sítio estimados de em glicosilação 38,4 KDa (Asn 307 ), e 5,31, respectivamente. O gene pgg2, de 1165 pb, também é interrompido por dois íntrons de 58 pb. Os íntrons de pgg1 e pgg2 apresentam posições conservadas, embora o mesmo não tenha sido verificado com as suas seqüências. A proteína deduzida de pgg2 possui 369 aas, massa molecular 38,3 KDa, pI 8,31 e dois possíveis sítios de (Asn 300 glicosilação Asn 338 ). e A identidade entre as proteínas PGG1 e PGG2 foi de 57,5%. Análise mostrou por que hibridização do genes e os únicas no genoma gênero Penicillium pgg1 do fungo. foram DNA total de pgg2 estão Diferentes investigadas P. griseoroseum presentes espécies quanto em de à cópias fungos do presença de genes de PG em seu genoma. Os resultados revelaram que a essas espécies contêm PGs codificadas por poucos genes, ao contrário do observado possuem em Aspergillus famílias de genes niger de PG e Botrytis constituídas cinerea, por no que mínimo cinco membros. A expressão dos genes pgg1 e pgg2 foi analisada por hibridização do RNA total e pela técnica de RT-PCR. Ambos os genes são transcricionalmente regulados, porém com expressão diferenciada entre si. A expressão do gene pgg1 foi verificada apenas em 76 horas de cultivo do micélio em meio com pectina suplementado com extrato de levedura, enquanto o transcrito do gene pgg2 expressão fontes não foi de de com detectado ambos os carbono, em todos genes como também sacarose extrato de levedura. detectados apenas na presença adição extrato de levedura. pgg2 de os e tempos foi de analisada glicose, de pectina, Contudo, a em pgg1 ou foram independente expressão A outras suplementadas Transcritos de cultivo. do da gene foi reprimida somente em meio contendo glicose. A adição de extrato de levedura ao meio de cultivo contendo glicose teve um efeito positivo sobre a expressão de pgg2, embora um nível maior de expressão tenha sido verificado na presença de sacarose e pectina. As regiões 5’ terminais dos genes pgg1 e pgg2 foram sequenciadas para caracterizar cis-elementos e analisar a interação com proteínas reguladoras. Ensaios de migração retardada em gel foram realizadas para comprovar a funcionalidade de alguns cis-elementos. Extratos a a protéicos nucleares foram diferentes proteína preparados fontes foi reguladora de carbono. visualizada do gene de quando pgg2 micélio A crescido em meio formação de complexos fragmentos de DNA contendo os cis-elementos da com DNA- região CCAAT e TATAATTAA foram utilizados. Um possível elemento de resposta ao cAMP foi localizado na posição -757. A região reguladora do gene pgg1 possui um potencial sítio de ligação para o regulador geral CREA sobreposto ao TATA “box”, o que pode ser uma explicação para a ausência de expressão deste gene na presença de glicose. / The polygalacturonase-encoding Penicillium griseoroseum were genes cloned pgg1 and and pgg2 from characterized. The 1251-bp coding region of the pgg1 gene is interrupted by two introns of 55 and 67 bp deduced by comparison with the cDNA sequence. A potencial glycosilation nucleotide mass polypeptide sequence was 38.4 KDa of with 376 site at pgg1. and consists of 1165 bp introns. The positions amino The with a acids residues with a was predicted from protein estimated molecular Asn 307 pI of and is also of the introns 5.31. The pgg2 gene by two 58-bp interrupted were the conserved in both genes however no conservation was seen in their sequences. The pgg2 encodes a protein of 369 residues with estimated mass and pI of 38.3 glycosilation KDa sites and were 8.31, respectively. identified at Asn 300 Two and putative Asn . 338 Based on the deduced amino acid sequence, PGG1 shows 57.5% identity with PGG2. The genome pgg1 of analysis. and P. The pgg2 genes griseoroseum presence of exist as as single copies in the revealed by total DNA blot corresponding PG genes in otherPenicillium species was investigated and the results show that these enzymes are encoded by few genes. A different pattern is reported for Aspergillus niger and Botrytis cinerea where the PG gene family consists of at least five members. RT-PCR and was employed to investigate the expression of pgg1 pgg2 genes. Both genes are regulated at the transcription level, seen. although The pgg1 cultivation while in pgg2 analyzed. some differences gene was pectin Total RNA detected extracted expression after supplemented was was their expressed medium transcript in 76 with in from hours yeast all were extract, time mycelia of points grown on sucrose or glucose, with or without yeast extract. Pectin was the only condition tested that induced the expression of pgg1, even in the expressed absence under of almost yeast all pgg2-specific mRNA could medium the addition while extract. conditions be The studied. observed on yeast extract of pgg2 gene was However, no glucose-containing abolished this repressive effect. The 5’ regions of the pgg1 and pgg2 genes were sequenced in order to interaction of characterize with regulatory electrophoresis extracts were sources. cis-acting proteins mobility prepared from DNA-protein elements was shift mycelia complexes investigated assays. grown were and on their by means Crude nuclear different carbon visualized when DNA fragments containing CCAAT and TATAATTAA were used. A putative cAMP response element translation initiation pgg1 has gene a was site. potential detected The 5’ at –766 upstream binding site from sequence for the the of the global repressor CREA which overlaps the TATA box. This could explain the repressive effect of glucose on pgg1 expression. Only few cis-acting elements are shared by the and this could justify the pgg1 and pgg2 promoters differential expression of the polygalacturonase-encoding genes from P. griseoroseum.