Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-09-22Bitstream added on 2014-06-13T20:24:23Z : No. of bitstreams: 1 silva_d_dr_rcla.pdf: 1167994 bytes, checksum: eca15b5bfad71b8173fe9d808385fd94 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A poligalacturonase (PG) é uma pectinase que degrada a molécula de pectina atuando internamente , ao acaso, liberando oligossacarídeos (Endo-PG) ou por ataque a partir da extremidade não redutora da cadeia, liberando moléculas de ácido galacturônico (Exo-PG). As pectinases, como várias outras enzimas, têm sido obtidas a partir de microrganismos, em processos fermentativos em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSM). A purificação e caracterização destas enzimas podem possibilitar o estudo das diferenças de suas propriedades funcionais, bem como, permitem avaliar suas possibilidades de aplicação, em diferentes condições, em processos industriais. Este trabalho teve por objetivos estudar a produção, purificação e caracterização da PG produzida por Penicillium viridicatum RFC3 através de FES e FSM. Para FSM foram testados os resíduos agroindustriais (farelo de trigo, bagaço de laranja, uma mistura de ambos) a 3% (p/v) além da água amarela (resíduo do processamento da indústria cítrica) no seu estado bruto e com diluições (2, 4 e 10x). Os pHs iniciais foram corrigidos para 4,5, 5 e 5,5 e a fermentação ocorreu por 24 - 96 h. A ANOVA mostrou que o extrato do bagaço de laranja (pH 5,5 e 96 h) foi o melhor meio para a produção da PG em FSM. A purificação da PG produzida em FSM iniciou-se pela ultrafiltração do extrato bruto (membranas de 50 e 10 kDa, repectivamente) seguida pela aplicação da amostra em uma coluna de filtração em gel Sephadex G75 e posterior aplicação em uma Q Sepharose. A fração isolada e desorvida revelou, após 2 eletroforese (PAGE-SDS) a homogeneidade da banda cuja massa molar foi estimada em 92,24 kDa e pI de 5,4. A enzima mostrou ser uma exopoligalacturonase (Exo-PG) com pH e temperatura ótimos em 5,0 e 50-55ºC. / The polygalacturonase (PG) is a pectinase that degrade pectin acting internally, releasing olygossacharide (Endo-PG) or by atack to a non reducing chain extremity, releasing galacturonic acid (Exo-PG). The pectinases, like many others enzymes, have been obtained from microorganisms by solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF). The purification and characterization of these enzymes besides the study of differences of its functional properties permit its application on industrial process, on different conditions. This work aimed the study of production, purification and characterization of PG from Penicillium viridicatum RFC3 by SSF and SMF. In SMF they were assayed agroindustrial wastes (wheat bran, orange bagasse and a mixture of both) at 3% (w/v 1:1) and citric industry liquid waste (yellow water) in crude state and with dilutions (2, 4 and 10x). It was also evaluated the variation of the initial pH of the medium (4.5, 5.0 nd 5.5) and the time of fermentation (24 96 h). The ANOVA test revealed that the culture medium composed by orange bagasse extract, at pH 5.5 and 96 h, was the best condition for production of PG in SMF. The purification process of PG from SMF was carried out by the ultrafiltration of the crude extract (50 and kDa membranes, respectively) and by gel filtration in Sephadex G75 and Q Sepharose columns. The fraction with PG activity show by eletrophoresis (SDSPAGE), an homogeinity of a band with estimated molar mass of 92.24 KDa and pI 5.4. The enzyme revealed to be an Exo-PG with optimal pH and temperature of 5.0 and 50-55 °C. It also revealed to be Ca2+ dependent, which increased its 4 activity and stability. The Km of the enzyme was 1.30 and 1.16 mg/ml on Ca2+ presence. The Vmax was 1.76 and 2.07 ?mol/min/mg when Ca2+ was added. The better fermentation conditions in SSF was wheat bran mixed with orange bagasse (1:1 w/w) at 80% moisture as an culture medium and 336h of fermentation.

Pectinases são enzimas que atuam sobre a pectina, um polissacarídeo presente na parede celular vegetal. Estas enzimas são amplamente utilizadas em diversos segmentos industriais, como indústria de alimentos, sucos e vinhos, tecidos, papel, café e óleos, entre outras. As pectinases de uma cepa de Penicillium oxalicum isolada de casca de laranja foram estudadas. Investigamos o efeito na atividade de pectinases de diferentes resíduos agroindustriais como fonte de pectina, o melhor pH e temperatura para estimular a produção de poligalacturonases, pectina liases e pectinesterases. Procedemos a caracterização dos preparados enzimáticos otimizados para as três enzimas e suas aplicações para a extração de sucos de frutas. Investigamos ainda a produção das micotoxinas aflatoxina e ocratoxina. A produção máxima de poligalacturonase foi obtida com P. oxalicum cultivado em meio contendo casca de maracujá. Casca de laranja estimulou a atividade de pectinesterase e pectina liase. Demonstramos ainda que os preparados enzimáticos produzidos por P. oxalicum promovem a extração de sucos, de cor e reduzem a turbidez e a viscosidade dos sucos, tendo alto potencial de aplicação industrial. / Pectinases are enzymes that degraded pectin, a polysaccharide present in plant cell wall. These enzymes are used in different industrial applications, as in the production of juices and wines, degumming tissues, paper, coffee and oil. Pectinases from a strain of Penicillium oxalicum isolated from orange peel was studied. The effect of different agroindustrial residues as source of pectin, the best pH and temperature to improve polygalacturonase, pectin lyase and pectinesterase production where analyzed. We also characterized enzymatic extracts for three enzymes and its application for juice extraction. The production of mycotoxins, alflatoxin and ochratoxin from P.oxalicum were also analyzed. The maximum polygalacturonase production was achieved with P. oxalicum growing in a medium containing passion fruit peel; for pectinesterase and pectin lyase orange peel have highest activity. We demonstrate that enzymatic extracts produced by P. oxalicum promote the extraction of juice, color and reduced the turbidity and viscosity of juices, having industrial application potential.

Pectinases são enzimas que atuam sobre a pectina, um polissacarídeo presente na parede celular vegetal. Estas enzimas são amplamente utilizadas em diversos segmentos industriais, como indústria de alimentos, sucos e vinhos, tecidos, papel, café e óleos, entre outras. As pectinases de uma cepa de Penicillium oxalicum isolada de casca de laranja foram estudadas. Investigamos o efeito na atividade de pectinases de diferentes resíduos agroindustriais como fonte de pectina, o melhor pH e temperatura para estimular a produção de poligalacturonases, pectina liases e pectinesterases. Procedemos a caracterização dos preparados enzimáticos otimizados para as três enzimas e suas aplicações para a extração de sucos de frutas. Investigamos ainda a produção das micotoxinas aflatoxina e ocratoxina. A produção máxima de poligalacturonase foi obtida com P. oxalicum cultivado em meio contendo casca de maracujá. Casca de laranja estimulou a atividade de pectinesterase e pectina liase. Demonstramos ainda que os preparados enzimáticos produzidos por P. oxalicum promovem a extração de sucos, de cor e reduzem a turbidez e a viscosidade dos sucos, tendo alto potencial de aplicação industrial. / Pectinases are enzymes that degraded pectin, a polysaccharide present in plant cell wall. These enzymes are used in different industrial applications, as in the production of juices and wines, degumming tissues, paper, coffee and oil. Pectinases from a strain of Penicillium oxalicum isolated from orange peel was studied. The effect of different agroindustrial residues as source of pectin, the best pH and temperature to improve polygalacturonase, pectin lyase and pectinesterase production where analyzed. We also characterized enzymatic extracts for three enzymes and its application for juice extraction. The production of mycotoxins, alflatoxin and ochratoxin from P.oxalicum were also analyzed. The maximum polygalacturonase production was achieved with P. oxalicum growing in a medium containing passion fruit peel; for pectinesterase and pectin lyase orange peel have highest activity. We demonstrate that enzymatic extracts produced by P. oxalicum promote the extraction of juice, color and reduced the turbidity and viscosity of juices, having industrial application potential.

Pectinases são enzimas que atuam sobre a pectina, um polissacarídeo presente na parede celular vegetal. Estas enzimas são amplamente utilizadas em diversos segmentos industriais, como indústria de alimentos, sucos e vinhos, tecidos, papel, café e óleos, entre outras. As pectinases de uma cepa de Penicillium oxalicum isolada de casca de laranja foram estudadas. Investigamos o efeito na atividade de pectinases de diferentes resíduos agroindustriais como fonte de pectina, o melhor pH e temperatura para estimular a produção de poligalacturonases, pectina liases e pectinesterases. Procedemos a caracterização dos preparados enzimáticos otimizados para as três enzimas e suas aplicações para a extração de sucos de frutas. Investigamos ainda a produção das micotoxinas aflatoxina e ocratoxina. A produção máxima de poligalacturonase foi obtida com P. oxalicum cultivado em meio contendo casca de maracujá. Casca de laranja estimulou a atividade de pectinesterase e pectina liase. Demonstramos ainda que os preparados enzimáticos produzidos por P. oxalicum promovem a extração de sucos, de cor e reduzem a turbidez e a viscosidade dos sucos, tendo alto potencial de aplicação industrial. / Pectinases are enzymes that degraded pectin, a polysaccharide present in plant cell wall. These enzymes are used in different industrial applications, as in the production of juices and wines, degumming tissues, paper, coffee and oil. Pectinases from a strain of Penicillium oxalicum isolated from orange peel was studied. The effect of different agroindustrial residues as source of pectin, the best pH and temperature to improve polygalacturonase, pectin lyase and pectinesterase production where analyzed. We also characterized enzymatic extracts for three enzymes and its application for juice extraction. The production of mycotoxins, alflatoxin and ochratoxin from P.oxalicum were also analyzed. The maximum polygalacturonase production was achieved with P. oxalicum growing in a medium containing passion fruit peel; for pectinesterase and pectin lyase orange peel have highest activity. We demonstrate that enzymatic extracts produced by P. oxalicum promote the extraction of juice, color and reduced the turbidity and viscosity of juices, having industrial application potential.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-18T15:55:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Nina Rosa Mello.pdf: 820186 bytes, checksum: 6106e9129dd9ff187daf9d0b5c46f501 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T15:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Nina Rosa Mello.pdf: 820186 bytes, checksum: 6106e9129dd9ff187daf9d0b5c46f501 (MD5) Previous issue date: 2015-05-28 / CAPEs / A palma forrageira é uma cactácea cultivada no semiárido nordestino, capaz de se desenvolver mesmo em solos deficientes em nutrientes e água. Por ser rica em carboidratos, tem um grande potencial para utilização em processos biotecnológicos para produção de diversos bioprodutos. O objetivo deste trabalho foi investigar a utilização da palma forrageira como substrato para a produção de enzimas microbianas de interesse industrial, em particular, para a aplicação na hidrólise de biomassas em biorrefinarias. Cladódios de Opuntia fícusindica, vulgarmente conhecida como palma gigante, foram fornecidos pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) e utilizados em todos os experimentos. Inicialmente, foi realizado um ―screening‖ de microorganismos do gênero Bacillus, pertencentes à Coleção de Microrganismo do Departamento de Antibióticos. O ―screening‖ foi feito com 10 linhagens, em placas de Petri, em meio sólido contendo pó de palma seca como fonte de carbono. Entre as 7 linhagens capazes de crescer no meio sólido, a linhagem com colônia de maior diâmetro foi selecionada para investigação sobre a produção de enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas e pectinolíticas em fermentação submersa. As fermentações submersas foram realizadas com a linhagem selecionada, Bacillussp. UFPEDA 472, e outros 3 micro-organismos: Trichoderma reesei RUT C-30, Aspergillus awamori e Streptomyces rocheiUFPEDA 3414, já reconhecidos como bons produtores de enzimas. A produção de atividades enzimáticas foi investigada em frascos agitados em mesa agitadora (New Brunswick Scientific, C25KC) e em biorreator de bancada instrumentado (New Brunswick Scientific, Bioflo110), utilizando-se o pó e a fração péctica da palma, respectivamente. As condições de aeração e agitação do reator foram: 1 vvm e 500 rpm, respectivamente; a temperatura e o pH foram controlados, respectivamente, em: 30°C e 5,0, para os fungos filamentosos, 30°C e 7,0, para Bacillus sp., e 37°C e 6,0 para S. rochei. Atividades enzimáticas FPase, CMCase, xilanase e pectinase foram determinadas durante as fermentações utilizando-se como substratos: papel de filtro Whatman nº1, carboximetilcelulose 4%, xilana 1% e pectina cítrica 1%, respectivamente. As concentrações de açúcares e ácido galacturônico foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (Agilent, Série 1100). A palma e a sua fração péctica foram capazes de induzir a produção de todas as atividades enzimáticas investigadas em T. reesei, principalmente xilanase (7,75 UI/mL), mas baixas atividades celulolíticas foram observadas para os outros microorganismos. Por outro lado, maiores atividades pectinolíticas foram observadas para S. rochei e A. awamori (2,24 UI/mL e 1,84 UI/mL, respectivamente). Os resultados levaram à conclusão de que a biomassa de cladódios da palma forrageira gigante e a sua fração péctica são substratos potenciais para produção de enzimas – em particular, por Trichoderma reesei RUT C30 – capazes de atuar na hidrólise de biomassas lignocelulósicas em biorrefinarias. / The prickly pear is a cactus cultivated in the semi-arid northeast region of Brazil, able to grow even in soil poor in nutrients and water. Being rich in carbohydrates, it has great potential for use in biotechnological processes for production of various bioproducts. The aim of this study was to investigate the use of prickly pear as a substrate for the production of microbial enzymes of industrial interest, in particular for application in biomass hydrolysis in biorefineries. Cladodes of Opuntia ficus-indica, commonly known as giant palm in Brazil, were provided by the Agronomic Institute of Pernambuco (IPA) and used in all experiments. Initially, a screeningwas carried out with microrganisms of the genus Bacillusfrom the Microbial Collection of the Department of Antibiotics. The screening was performed with 10 strains in Petri dishes on solid medium containing cactus dry powder as a carbon source. Among the 7 strains capable of growing on the solid medium, the strain with the larger colony diameter was selected for investigation on the production of cellulolytic, pectinolytic and hemicellulolytic enzymes in submerged fermentation. The submerged fermentations were carried out with the selected strain, Bacillus sp. UFPEDA 472, and other three microorganisms: Trichoderma reesei RUT C-30, Aspergillus awamori and Streptomyces rocheiUFPEDA 3414, already recognized as good producers of enzymes. The production of enzyme activities was investigated in Erlenmeyer flasks in rotatory shaker (New Brunswick Scientific, C25KC) and instrumented bench bioreactor (New Brunswick Scientific, Bioflo110), using the powder and pectin fraction from the cactus, respectively. The conditions of aeration and agitation of the reactor were: 1 vvm and 500 rpm, respectively; the temperature and pH were controlled respectively at: 30 ° C and 5.0 for filamentous fungi, 30 ° C and 7.0 for Bacillus sp., and 37 ° C and 6.0 for S. rochei. FPase, CMCase, xylanase and pectinase enzymatic activities were determined during the fermentations using Whatman nº1 filter paper, carboxymethylcellulose 4%, xylan 1% and citrus pectin 1%, as substrates, respectively. The concentrations of sugars and galacturonic acid were determined by highperformance liquid chromatography (Agilent Technologies, 1100 Series). The cactus and its pectic fraction were able to induce the production of all enzyme activities investigated in T. reesei, mostly xylanase (7,75 UI/mL), but lower cellulolytic activities were observed for the other microorganisms. On the other hand, higher pectinolytic activities were observed for S. rochei and A. awamori (2,24 UI/mL and 1,84 UI/mL, respectively). It was concluded that the cladodes biomass of giant cactus and its pectin fraction are potential substrates for the production of enzymes - in particular by Trichoderma reesei RUT C30 - able to act in the hydrolysis of lignocellulosic biomass in biorefineries.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T13:11:08Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) Previous issue date: 2003-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os genes plg1 e plg2, que codificam pectina liase em Penicillium griseoroseum, foram isolados e caracterizados. A região estrutural do gene plg1 possui 1341 pares de bases (pb) e é interrompida por 2 íntrons, de 101 e 115 pb, confirmados pela seqüência do cDNA. A proteína deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 aa, com massa molecular estimada em 40,1 KDa, um potencial sítio de glicosilação na posição N 112 e pI calculado de 9,46. O gene plg2 possui 1400 pb, sendo interrompido por quatro íntrons contendo 56, 60, 52 e 39 pb. Estes íntrons estão nas mesmas posições dos íntrons do gene pelD de Aspergillus niger, embora as seqüências de nucleotídeos sejam diferentes. A proteína deduzida possui 383 aa, massa molecular estimada de 40,5 KDa e pI de 5,55. Três possíveis sítios de glicosilação foram encontrados nas posições N 38 , N 128 e N 257 . Análise por hibridização do DNA total de P. griseoroseum e dos respectivos plasmídeos que contêm as seqüências genômicas dos genes plg1 e plg2, revelaram que estes genes estão presentes em cópias únicas no genoma do fungo. Esses resultados sugerem que P. griseoroseum possui somente dois genes que codificam pectina liase. A avaliação da regulação da expressão dos genes plg1 e plg2 foi conduzida por hibridização do RNA total e por RT-PCR. Os genes plg1 e plg2 apresentam diferente regulação em nível de transcrição. A expressão do gene plg1 é induzida por pectina cítrica e sacarose/extrato de levedura, sendo expresso ao longo de 96 horas de crescimento de P. griseoroseum. No entanto, o maior acúmulo do transcrito foi detectado com 24 horas de crescimento. A adição de glicose, frutose, galactose ou xilose no meio de cultura, reprimem a transcrição de plg1 substancialmente. O transcrito do gene plg2 foi detectado somente por RT-PCR, demonstrando que a sua expressão, mesmo induzida, é muito menor do que a de plg1. O gene plg2 foi transcrito em nível muito baixo em pectina cítrica e em pectina de maçã, não sendo transcrito em sacarose/extrato de levedura. As regiões 5' terminal dos genes plg1 e plg2 foram sequenciadas, e potenciais cis-elementos para ligação dos fatores de transcrição CreA e PacC foram identificados. Foram também detectados os cis - elementos CAAT box e TATA box. A presença dos dois primeiros cis-elementos explica a regulação de plg1, considerando que este está sujeito à repressão catabólica (CreA) e à influência do pH do meio (PacC). O gene plg1 é induzido na presença de sacarose/extrato de levedura. Análise por RT-PCR mostrou que este não foi expresso em meio contendo sacarose somente, e quantidades pequenas do transcrito foram detectadas quando o fungo foi crescido apenas em meio contendo extrato de levedura. Os resultados evidenciam que a expressão do gene plg1 depende conjuntamente de sacarose e extrato de levedura. Com o objetivo de verificar se o efeito de sacarose e extrato de levedura na expressão de plg1 depende do envolvimento do AMPc, o fungo foi crescido em meios contendo sacarose e extrato de levedura, acrescidos de substâncias que atuam na cascata de transdução de sinais via AMPc. Foi verificado que há expressão diferencial de plg1 nas diferentes substâncias testadas e nos tempos de crescimento analisados, 18 e 24 horas. A presença de cafeína e extrato de levedura provocou aumento na expressão do gene plg1 em relação ao controle contendo sacarose e extrato de levedura, e a combinação de sacarose/cafeína e extrato de levedura levou a um maior aumento. Somente sacarose e dibutiril-AMPc não promoveram o acúmulo do transcrito do gene plg1, como observado em sacarose e extrato de levedura. Este acúmulo só foi detectado na presença de extrato de levedura, o que nos leva a inferir que somente um aumento do AMPc endógeno não seria capaz de induzir a transcrição do gene plg1. / Two pectin lyase-enconding genes from Penicillium griseoroseum were isolated and characterized. The coding region of the plg1 gene consists of 1341 base pairs (bp) and is interrupted by two introns of 101 and 115 bp, confirmed by cDNA sequencing. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLG1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N-glycosylation site was found at N 112 . The plg2 coding sequence (1400 bp) is interrupted by four small introns which sizes vary from 36 to 60 bp. These introns were found at identical positions of those of the pelD gene from A. niger although a detailed comparison revealed sequence divergence. The calculated pI and predicted molecular mass of PLG2 protein are 5.55 and 40.5 KDa, respectively. Three putative glycosylation sites were detected at N 38 , N 128 , and N 257 . Quantitative Southern blot revealed that the plg1 and plg2 genes exist as single copies in the P. griseoroseum genome. Our results indicate that they are the only members of the pectin lyase gene family in this fungus. Northern hybridization analysis and RT-PCR were conducted to study the regulation of plg1 and plg2 expression. Both genes are regulated at the transcription level although they are controlled in different ways. Citric pectin and sucrose/yeast extract induces plg1 expression when P. griseoroseum is xiicultivated during 96 h. However the highest transcript accumulation was detected at 24 h. Transcription of plg1 is substantially repressed when glucose, fructose, galactose and xylose are added to the medium culture. plg2 transcripts were only detected by RT-PCR demonstrating that this gene is expressed at lower levels when compared to plg1. The plg2 transcription was seen in sucrose/yeast extract while transcript levels were low in citric pectin and apple pectin. The 5’-flanking regions of plg1 and plg2 genes were sequenced and putative CAAT and TATA boxe were identified as well a putative consensus binding sites for CreA and PacC. These cis-elements explain the regulation of these genes since both undergo catabolite repression (CreA) and are influenced by the medium pH (PacC). The plg1 gene is induced by sucrose/yeast extract. RT-PCR analysis showed that sucrose alone doesn’t trigger its expression and low amounts of plg1 transcript were detected when the fungus was cultivated only in yeast extract. These results provide strong evidence that plg1 expression relies on both sucrose and yeast extract. P. griseoroseum was grow on medium containing sucrose and yeast extract in order to analyze if plg1 expression also depends on cAMP. Differential expression was seen when different substances were added and at the time points sampled, 18 and 24 h. Caffeine and yeast extract raised the expression of plg1 gene when compared to the control, sucrose and yeast extract. Even higher expression was seen from combination of sucrose/caffeine and yeast extract. No transcript accumulation was detected when the fungus was cultivated on sucrose and dibutyril-cAMP in opposition to cultivation on sucrose and yeast extract. This accumulation was only observed in the presence of yeast extract and provides evidence that a simple raise in the endogen cAMP level would not be able to induce plg1 transcription.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T12:38:14Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T12:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) Previous issue date: 2004-03-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A seqüência de nucleotídeos contendo o gene ple1 que codifica pectina liase em Penicillium expansum foi clonada. Esta seqüência contém 874 nucleotídeos da região promotora, 1342 nucleotídeos da região codificadora e 469 nucleotídeos da região terminadora. A região codificadora do gene ple1 é interrompida por dois íntrons, de 101 e 116 nucleotídeos, confirmados pela seqüência do cDNA. Na seqüência da região promotora de ple1 foi observado cis-elementos envolvidos na regulação da expressão desse gene, como TATA box (TATATAA) na posição -91 do códon de início da tradução, sendo esta seqüência precedida por uma região rica em pirimidinas e CAAT box (CCAATT) a -568 do códon de inicio da tradução. A proteína PLE1, deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 resíduos de aminoácidos, com massa molecular estimada de 40,1 KDa e pI calculado de 9,46. Análise por hibridização do DNA total de P. expansum e P. griseoroseum com um fragmento de DNA de 2,1 Kb que corresponde ao gene pelA de A. niger, indicou organização semelhante dos genes de PL no genoma destes fungos. A expressão do gene ple1, avaliada pela hibridização do RNA total com um fragmento de DNA que corresponde à região estrutural do gene ple1 mostrou que o transcrito foi detectado durante todo tempo de cultivo em presença de pectina. No entanto, quando cultivado em presença de sacarose, o transcrito somente foi detectado em 12 e 24 horas de cultivo, com adição de extrato de levedura. A caracterização morfológica de P. expansum e P. griseoroseum mostrou diferenças nítidas tanto no diâmetro quanto na coloração do verso das colônias destes fungos. Diferenças na organização da região subtelomérica dos cromossomos de P. expansum e P. griseoroseum, foram observadas quando o plasmídeo pTEL13 foi utilizado como sonda. A região ITS do rDNA de P. expansum tem 600 pb e de P. griseoroseum 594 pb. As linhagens transformantes obtidas com os plasmídeos pPlg1 e pNPG1, apresentaram aumentos na atividade de PL de no máximo 3 vezes. Análise por hibridização do DNA total dos transformantes indicou a ocorrência de integrações homólogas e heterólogas de pelo menos duas cópias do gene plg1. Foi construído um vetor de expressão, denominado pAN52-Plg1 que continha o gene plg1 sob o controle do promotor forte constitutivo do gene (gpdA) de A. nidulans. A transformação da linhagem mutante PG63 utilizando este vetor e o pNPG1, resultou na obtenção de uma linhagem recombinante (105) com aumento de 58 vezes na atividade de PL, quando cultivada em presença de glicose como fonte de carbono. Seis linhagens recombinantes foram avaliadas por hibridização apresentando integração heteróloga de mais de uma cópia do gene plg1 no genoma. Avaliação das proteínas extracelulares por eletroforese (SDS-PAGE) mostrou a presença de uma banda nítida e forte de aproximadamente 40 KDa presente no sobrenadante de cultivo da linhagem recombinante 105 que corresponde a PLG1. A atividade específica aparente de PL sintetizada por esta linhagem foi 44 e 27 vezes maior do que aquela obtida para linhagem mutante PG63 e de uma preparação comercial de pectinases “Citrus Clear”, respectivamente. O cultivo da linhagem recombinante 105 em meio contendo caldo de cana promoveu uma atividade de PL 132 vezes maior do que a atividade obtida pela linhagem PG63 cultivada nesta mesma fonte de carbono. A atividade de PL da linhagem recombinante 105, cultivada em diferentes volumes de meio, aumentou linearmente com o tempo. Pectina cítrica, quando utilizada como substrato, promoveu maior atividade de PL. A enzima mostrou ser estável em ampla faixa de pH e temperatura de armazenamento. Estes resultados mostram que a linhagem recombinante 105 é promissora para produção de PL em escala industrial, principalmente, para aplicação na indústria de sucos e vinhos, onde o emprego apenas da PL apresenta várias vantagens na qualidade do produto final. / The sequence of the pectin lyase-enconding gene ple1, from Penicillium expansum, was cloned. This sequence consists of 874 nucleotides of the promoter region, 1342 nucleotides of the coding region, and 469 nucleotides of the terminator region. The coding region of ple1 is interrupted by two introns of 101 and 116 nucleotides, confirmed by cDNA sequencing. Two cis-elements, TATA box (TATATAA) and CAAT box (CCAATT), were found at the positions 91 and 568 upstream from the translation start code, respectively. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLE1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N- glycosylation site was found at Asn 112 . Southern blot analysis of genomic DNA from P. expansum and P. griseoroseum with a 2.1 kb-DNA fragment of the gene pelA from A. niger indicated that this gene is similarly organized in the genomes of these fungi. The hibridization of total RNA with a fragment of the coding region of ple1 showed that the transcript was detected diring the whole of cultivation in a medium containing pectin. However, when the fungus was cultivated in the presence of sucrose with addition of yeast extract, the transcript was detected only at 12 and 24 hours of cultivation. The morphologic characterization of P. expansum and P. griseoroseum showed clear differences in the xdiameter and in the coloration of the botton of the colonies. Differences in the organization of the subtelomeric region of chromosomes of P. expansum and P. griseoroseum, were observed when the plasmid pTEL13 was used as a probe. The ITS region of the rDNA of P. expansum has 600 bp and that of P. griseoroseum 594 bp. The transformants obtained with the plasmids pPlg1 and pNPG1 presented increases in the activity of PL of at the least 3 times the active of the wild type. The hibridization profile of the genomic DNA of the transformants showed the occurrence of homologous and heterologous integrations of at least two additional copies of the gene plg1 in the genome. It was not possible to define the exact number of copies and correlate it with PL activity. An expression vector was built, designated pAN52-Plg1 that contained the gene plg1 under the control of the strong constitutive promoter gpdA of A. nidulans. The transformation of the mutant strains PG63 using this vector and the pNPG1 resulted in the isolation of a recombinant strain (105) with a PL activity 58 times higher than that of the wild type, when cultivated in glucose as the sole carbon source. Six recombinants were analised by hybridization that presented heterologous integration of more than one copy of plg1. Evaluation of the extracellular proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) showed the presence of a clear and strong band of approximately 40 KDa in the cultivation filtrate of the recombinant 105. This band corresponded to PLG1. The apparent specific activity of PL synthesized by this strain was 44 and 27 times higher than that obtained for the strain PG63 and for a commercial preparation of pectinolytic enzymes (Citrus Clear), respectively. The cultivation of the recombinant strain 105 in a medium containing sugar cane juice promoted a PL activity that was 132 times higher than that for the strain PG63 cultivated with the carbon source. PL activity of the recombinant strain 105, cultivated in different volumes of medium, increased linearly with time. Citric Pectin, when used as substrate, supported higher PL activity. The enzyme was stable in a wide range of pH and storage temperature.

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rubens Monti / Banca: Iracema de Oliveira Moraes / Banca: Márcia Luzia Rizzatto / Resumo: A poligalacturonase (PG) é uma pectinase que degrada a molécula de pectina atuando internamente, ao acaso, liberando oligossacarídeos (Endo-PG) ou por ataque a partir da extremidade não redutora da cadeia, liberando moléculas de ácido galacturônico (Exo-PG). As pectinases, como várias outras enzimas, têm sido obtidas a partir de microrganismos, em processos fermentativos em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSM). A purificação e caracterização destas enzimas podem possibilitar o estudo das diferenças de suas propriedades funcionais, bem como, permitem avaliar suas possibilidades de aplicação, em diferentes condições, em processos industriais. Este trabalho teve por objetivos estudar a produção, purificação e caracterização da PG produzida por Penicillium viridicatum RFC3 através de FES e FSM. Para FSM foram testados os resíduos agroindustriais (farelo de trigo, bagaço de laranja, uma mistura de ambos) a 3% (p/v) além da água amarela (resíduo do processamento da indústria cítrica) no seu estado bruto e com diluições (2, 4 e 10x). Os pHs iniciais foram corrigidos para 4,5, 5 e 5,5 e a fermentação ocorreu por 24 - 96 h. A ANOVA mostrou que o extrato do bagaço de laranja (pH 5,5 e 96 h) foi o melhor meio para a produção da PG em FSM. A purificação da PG produzida em FSM iniciou-se pela ultrafiltração do extrato bruto (membranas de 50 e 10 kDa, repectivamente) seguida pela aplicação da amostra em uma coluna de filtração em gel Sephadex G75 e posterior aplicação em uma Q Sepharose. A fração isolada e desorvida revelou, após 2 eletroforese (PAGE-SDS) a homogeneidade da banda cuja massa molar foi estimada em 92,24 kDa e pI de 5,4. A enzima mostrou ser uma exopoligalacturonase (Exo-PG) com pH e temperatura ótimos em 5,0 e 50-55ºC / Abstract: The polygalacturonase (PG) is a pectinase that degrade pectin acting internally, releasing olygossacharide (Endo-PG) or by atack to a non reducing chain extremity, releasing galacturonic acid (Exo-PG). The pectinases, like many others enzymes, have been obtained from microorganisms by solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF). The purification and characterization of these enzymes besides the study of differences of its functional properties permit its application on industrial process, on different conditions. This work aimed the study of production, purification and characterization of PG from Penicillium viridicatum RFC3 by SSF and SMF. In SMF they were assayed agroindustrial wastes (wheat bran, orange bagasse and a mixture of both) at 3% (w/v 1:1) and citric industry liquid waste (yellow water) in crude state and with dilutions (2, 4 and 10x). It was also evaluated the variation of the initial pH of the medium (4.5, 5.0 nd 5.5) and the time of fermentation (24 96 h). The ANOVA test revealed that the culture medium composed by orange bagasse extract, at pH 5.5 and 96 h, was the best condition for production of PG in SMF. The purification process of PG from SMF was carried out by the ultrafiltration of the crude extract (50 and kDa membranes, respectively) and by gel filtration in Sephadex G75 and Q Sepharose columns. The fraction with PG activity show by eletrophoresis (SDSPAGE), an homogeinity of a band with estimated molar mass of 92.24 KDa and pI 5.4. The enzyme revealed to be an Exo-PG with optimal pH and temperature of 5.0 and 50-55 °C. It also revealed to be Ca2+ dependent, which increased its 4 activity and stability. The Km of the enzyme was 1.30 and 1.16 mg/ml on Ca2+ presence. The Vmax was 1.76 and 2.07 ?mol/min/mg when Ca2+ was added. The better fermentation conditions in SSF was wheat bran mixed with orange bagasse (1:1 w/w) at 80% moisture as an culture medium and 336h of fermentation / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O aÃaà (Euterpe oleracea Mart.) pelo seu inegÃvel potencial como fonte natural de fitoquÃmicos antioxidantes e sua relevante capacidade de aproveitamento industrial, tem atraÃdo um grande interesse nas indÃstrias de processamento de suco de frutas tropicais, passando a ter importÃncia econÃmica em vÃrias regiÃes do Brasil, alÃm da regiÃo AmazÃnica. A aceitaÃÃo de sucos tropicais no mercado internacional requer melhoria nas tÃcnicas de processamento, tais como inclusÃo da etapa de clarificaÃÃo, resultando em matÃria-prima de alta qualidade para execuÃÃo dos processos de concentraÃÃo, para fabricaÃÃo de produtos como âcoolersâ, vinhos, refrigerantes e outros. A tecnologia de clarificaÃÃo do suco tropical de aÃaà atravÃs da remoÃÃo de lipÃdios e sÃlidos insolÃveis à um dos mÃtodos de otimizaÃÃo das propriedades sensoriais e de aceitabilidade mercadolÃgica. Para realizaÃÃo deste estudo, utilizou-se como matÃria-prima polpa de aÃaà tipo C proveniente do comÃrcio local de Fortaleza (CearÃ-Brasil). O objetivo deste trabalho foi a obtenÃÃo do suco clarificado de aÃaÃ, utilizando como agentes clarificantes pectinases e quitosana. A primeira etapa da pesquisa consistiu de estudos sobre a concentraÃÃo ideal de pectinase para a despectinizaÃÃo da polpa. Foram utilizados cinco lotes de 100 mL de polpa com concentraÃÃo da enzima variando de 0,01 a 0,2 % (v/v) mantidos a uma temperatura de 45 + 5ÂC, conservando o pH natural da polpa (em torno d e 4,0). A cada 15 min eram removidas amostras de 10 mL de polpa e efetuada uma inativaÃÃo enzimÃtica (90ÂC/10 min) sendo em seguid a feita a âProva do Ãlcoolâ para detecÃÃo da ausÃncia de pectina. Definidos os parÃmetros de tempo e concentraÃÃo enzimÃtica, procedeu-se à etapa de clarificaÃÃo. Foi preparado um suco com 30 % (v/v) de polpa tratada enzimaticamente sendo em seguida filtrado. Seis lotes de 50 mL de suco despectinizado foram adicionados de concentraÃÃes crescentes de soluÃÃo de quitosana 4 %, variando-se de 100 a 900 mg. A cada 30 min foi realizada uma filtraÃÃo para a definiÃÃo da concentraÃÃo ideal da quitosana baseando-se nas anÃlises da luminosidade, turbidez e no teste de âExcesso e insuficiÃncia de clarificaÃÃoâ. Uma vez definidos os parÃmetros de concentraÃÃo de pectinase e quitosana para obtenÃÃo do suco clarificado, foi realizada uma caracterizaÃÃo fÃsicoquÃmica e quÃmica do suco clarificado obtido, bem como da polpa e do suco tropical para efeitos comparativos. Ocorreu diferenÃa significativa ao nÃvel de 5 % de significÃncia entre as diferentes concentraÃÃes de quitosana e tempo de floculaÃÃo, bem como nas caracterÃsticas fÃsico-quÃmicas e quÃmicas da polpa e suco de aÃaà (tropical e clarificado). A utilizaÃÃo de pectinases como coadjuvantes do processo de clarificaÃÃo associada à quitosana para a remoÃÃo de sÃlidos em suspensÃo do suco tropical de aÃaÃ, mostrou-se satisfatÃria uma vez que ocorreu uma significativa reduÃÃo da turbidez e aumento de luminosidade. / AÃaà (Euterpe oleracea Mart.) for its undeniable potential as natural source of antioxidants and its excellent capacity of industrial exploitation, has attracted a great interest in the industries of tropical fruit juice processing, starting to acquire importance in some regions of Brazil, beyond the Amazon region. The tropical juice acceptance in the international market requires improvement in the processing techniques, such as inclusion of the clarification stage, resulting in a product of high quality for execution of the concentration processes, for manufacture of products as coolers, wines, fresh drinks and others. The technology of clarification of aÃaà tropical juice through the removal of lipids and insoluble solids is one of the methods for improvement of the sensorial properties and marketing acceptability. For accomplishment this study, type C aÃaà pulp from the local market of Fortaleza (CearÃ-Brazil) was used as raw material. The purpose of this work was to obtain the clarified aÃaà tropical fruit juice using as clarified aids pectinases and chitosan. The first stage of this research is to achieve the optimum concentration of pectinase for pulp despectinization. Five batches of 100 mL of aÃaà pulp were treated with 0.01 to 0,2% (v/v) of pectinase, kept to a temperature of 45 + 5ÂC, keeping the natural pH of the pulp (around 4.0). To each 15min was removed samples of 10 mL of pulp and the enzymatic inativation was performed at 90ÂC during 10 min and after that made the âTest of the alcoholâ for detection of the pectin absence. Once established the parameters of time and enzymatic concentration the clarification process was followed. A juice with 30% of treated pulp (v/v) was made and filtered afterwards. Six batches of 50 mL of treated juice were added of increasing concentrations of 4% chitosan solution raging from 100 to 900 mg. Each 30 min was made a filtration and samples were evaluated concerning to optimum chitosan concentration based on luminosity, turbity and the test of âExcess and insufficience of clarificationâ. Once choosed the pectin and chitosan concentrations the clarified aÃaà tropical fruit juice was processed. It was carried out a physico-chemistry and chemical characterization of clarified juice, as well as pulp and the tropical juice for comparative effect. Significant difference at a level of 5% occurred between the different concentrations of chitosan and flocculation time, as well as in the physico-chemistry and chemical characteristics of the pulp, tropical and aÃaà clarified tropical fruit juice. The use of pectinases as aids in clarification process associated to chitosan for suspensed solids removal in aÃaà tropical fruit showed satisfactory once occurred a significant reduction of turbidity and increase of luminosity.

CÉSAR, Leiliane Teles. Obtenção de suco clarificado de açaí (Euterpe oleracea Mart.) com utilização de pectinas e quitosana. 2007. 95 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2007 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-14T14:17:54Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_ltcésar.pdf: 477804 bytes, checksum: 19effd47888531c4cfcda2ae65b6802d (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-14T14:18:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_ltcésar.pdf: 477804 bytes, checksum: 19effd47888531c4cfcda2ae65b6802d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T14:18:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_ltcésar.pdf: 477804 bytes, checksum: 19effd47888531c4cfcda2ae65b6802d (MD5) Previous issue date: 2007 / Açaí (Euterpe oleracea Mart.) for its undeniable potential as natural source of antioxidants and its excellent capacity of industrial exploitation, has attracted a great interest in the industries of tropical fruit juice processing, starting to acquire importance in some regions of Brazil, beyond the Amazon region. The tropical juice acceptance in the international market requires improvement in the processing techniques, such as inclusion of the clarification stage, resulting in a product of high quality for execution of the concentration processes, for manufacture of products as coolers, wines, fresh drinks and others. The technology of clarification of açaí tropical juice through the removal of lipids and insoluble solids is one of the methods for improvement of the sensorial properties and marketing acceptability. For accomplishment this study, type C açaí pulp from the local market of Fortaleza (Ceará-Brazil) was used as raw material. The purpose of this work was to obtain the clarified açaí tropical fruit juice using as clarified aids pectinases and chitosan. The first stage of this research is to achieve the optimum concentration of pectinase for pulp despectinization. Five batches of 100 mL of açaí pulp were treated with 0.01 to 0,2% (v/v) of pectinase, kept to a temperature of 45 + 5°C, keeping the natural pH of the pulp (around 4.0). To each 15min was removed samples of 10 mL of pulp and the enzymatic inativation was performed at 90°C during 10 min and after that made the “Test of the alcohol” for detection of the pectin absence. Once established the parameters of time and enzymatic concentration the clarification process was followed. A juice with 30% of treated pulp (v/v) was made and filtered afterwards. Six batches of 50 mL of treated juice were added of increasing concentrations of 4% chitosan solution raging from 100 to 900 mg. Each 30 min was made a filtration and samples were evaluated concerning to optimum chitosan concentration based on luminosity, turbity and the test of “Excess and insufficience of clarification”. Once choosed the pectin and chitosan concentrations the clarified açaí tropical fruit juice was processed. It was carried out a physico-chemistry and chemical characterization of clarified juice, as well as pulp and the tropical juice for comparative effect. Significant difference at a level of 5% occurred between the different concentrations of chitosan and flocculation time, as well as in the physico-chemistry and chemical characteristics of the pulp, tropical and açaí clarified tropical fruit juice. The use of pectinases as aids in clarification process associated to chitosan for suspensed solids removal in açaí tropical fruit showed satisfactory once occurred a significant reduction of turbidity and increase of luminosity. / O açaí (Euterpe oleracea Mart.) pelo seu inegável potencial como fonte natural de fitoquímicos antioxidantes e sua relevante capacidade de aproveitamento industrial, tem atraído um grande interesse nas indústrias de processamento de suco de frutas tropicais, passando a ter importância econômica em várias regiões do Brasil, além da região Amazônica. A aceitação de sucos tropicais no mercado internacional requer melhoria nas técnicas de processamento, tais como inclusão da etapa de clarificação, resultando em matéria-prima de alta qualidade para execução dos processos de concentração, para fabricação de produtos como “coolers”, vinhos, refrigerantes e outros. A tecnologia de clarificação do suco tropical de açaí através da remoção de lipídios e sólidos insolúveis é um dos métodos de otimização das propriedades sensoriais e de aceitabilidade mercadológica. Para realização deste estudo, utilizou-se como matéria-prima polpa de açaí tipo C proveniente do comércio local de Fortaleza (Ceará-Brasil). O objetivo deste trabalho foi a obtenção do suco clarificado de açaí, utilizando como agentes clarificantes pectinases e quitosana. A primeira etapa da pesquisa consistiu de estudos sobre a concentração ideal de pectinase para a despectinização da polpa. Foram utilizados cinco lotes de 100 mL de polpa com concentração da enzima variando de 0,01 a 0,2 % (v/v) mantidos a uma temperatura de 45 + 5°C, conservando o pH natural da polpa (em torno d e 4,0). A cada 15 min eram removidas amostras de 10 mL de polpa e efetuada uma inativação enzimática (90°C/10 min) sendo em seguid a feita a “Prova do álcool” para detecção da ausência de pectina. Definidos os parâmetros de tempo e concentração enzimática, procedeu-se à etapa de clarificação. Foi preparado um suco com 30 % (v/v) de polpa tratada enzimaticamente sendo em seguida filtrado. Seis lotes de 50 mL de suco despectinizado foram adicionados de concentrações crescentes de solução de quitosana 4 %, variando-se de 100 a 900 mg. A cada 30 min foi realizada uma filtração para a definição da concentração ideal da quitosana baseando-se nas análises da luminosidade, turbidez e no teste de “Excesso e insuficiência de clarificação”. Uma vez definidos os parâmetros de concentração de pectinase e quitosana para obtenção do suco clarificado, foi realizada uma caracterização físicoquímica e química do suco clarificado obtido, bem como da polpa e do suco tropical para efeitos comparativos. Ocorreu diferença significativa ao nível de 5 % de significância entre as diferentes concentrações de quitosana e tempo de floculação, bem como nas características físico-químicas e químicas da polpa e suco de açaí (tropical e clarificado). A utilização de pectinases como coadjuvantes do processo de clarificação associada à quitosana para a remoção de sólidos em suspensão do suco tropical de açaí, mostrou-se satisfatória uma vez que ocorreu uma significativa redução da turbidez e aumento de luminosidade.