Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T13:11:08Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) Previous issue date: 2003-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os genes plg1 e plg2, que codificam pectina liase em Penicillium griseoroseum, foram isolados e caracterizados. A região estrutural do gene plg1 possui 1341 pares de bases (pb) e é interrompida por 2 íntrons, de 101 e 115 pb, confirmados pela seqüência do cDNA. A proteína deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 aa, com massa molecular estimada em 40,1 KDa, um potencial sítio de glicosilação na posição N 112 e pI calculado de 9,46. O gene plg2 possui 1400 pb, sendo interrompido por quatro íntrons contendo 56, 60, 52 e 39 pb. Estes íntrons estão nas mesmas posições dos íntrons do gene pelD de Aspergillus niger, embora as seqüências de nucleotídeos sejam diferentes. A proteína deduzida possui 383 aa, massa molecular estimada de 40,5 KDa e pI de 5,55. Três possíveis sítios de glicosilação foram encontrados nas posições N 38 , N 128 e N 257 . Análise por hibridização do DNA total de P. griseoroseum e dos respectivos plasmídeos que contêm as seqüências genômicas dos genes plg1 e plg2, revelaram que estes genes estão presentes em cópias únicas no genoma do fungo. Esses resultados sugerem que P. griseoroseum possui somente dois genes que codificam pectina liase. A avaliação da regulação da expressão dos genes plg1 e plg2 foi conduzida por hibridização do RNA total e por RT-PCR. Os genes plg1 e plg2 apresentam diferente regulação em nível de transcrição. A expressão do gene plg1 é induzida por pectina cítrica e sacarose/extrato de levedura, sendo expresso ao longo de 96 horas de crescimento de P. griseoroseum. No entanto, o maior acúmulo do transcrito foi detectado com 24 horas de crescimento. A adição de glicose, frutose, galactose ou xilose no meio de cultura, reprimem a transcrição de plg1 substancialmente. O transcrito do gene plg2 foi detectado somente por RT-PCR, demonstrando que a sua expressão, mesmo induzida, é muito menor do que a de plg1. O gene plg2 foi transcrito em nível muito baixo em pectina cítrica e em pectina de maçã, não sendo transcrito em sacarose/extrato de levedura. As regiões 5' terminal dos genes plg1 e plg2 foram sequenciadas, e potenciais cis-elementos para ligação dos fatores de transcrição CreA e PacC foram identificados. Foram também detectados os cis - elementos CAAT box e TATA box. A presença dos dois primeiros cis-elementos explica a regulação de plg1, considerando que este está sujeito à repressão catabólica (CreA) e à influência do pH do meio (PacC). O gene plg1 é induzido na presença de sacarose/extrato de levedura. Análise por RT-PCR mostrou que este não foi expresso em meio contendo sacarose somente, e quantidades pequenas do transcrito foram detectadas quando o fungo foi crescido apenas em meio contendo extrato de levedura. Os resultados evidenciam que a expressão do gene plg1 depende conjuntamente de sacarose e extrato de levedura. Com o objetivo de verificar se o efeito de sacarose e extrato de levedura na expressão de plg1 depende do envolvimento do AMPc, o fungo foi crescido em meios contendo sacarose e extrato de levedura, acrescidos de substâncias que atuam na cascata de transdução de sinais via AMPc. Foi verificado que há expressão diferencial de plg1 nas diferentes substâncias testadas e nos tempos de crescimento analisados, 18 e 24 horas. A presença de cafeína e extrato de levedura provocou aumento na expressão do gene plg1 em relação ao controle contendo sacarose e extrato de levedura, e a combinação de sacarose/cafeína e extrato de levedura levou a um maior aumento. Somente sacarose e dibutiril-AMPc não promoveram o acúmulo do transcrito do gene plg1, como observado em sacarose e extrato de levedura. Este acúmulo só foi detectado na presença de extrato de levedura, o que nos leva a inferir que somente um aumento do AMPc endógeno não seria capaz de induzir a transcrição do gene plg1. / Two pectin lyase-enconding genes from Penicillium griseoroseum were isolated and characterized. The coding region of the plg1 gene consists of 1341 base pairs (bp) and is interrupted by two introns of 101 and 115 bp, confirmed by cDNA sequencing. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLG1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N-glycosylation site was found at N 112 . The plg2 coding sequence (1400 bp) is interrupted by four small introns which sizes vary from 36 to 60 bp. These introns were found at identical positions of those of the pelD gene from A. niger although a detailed comparison revealed sequence divergence. The calculated pI and predicted molecular mass of PLG2 protein are 5.55 and 40.5 KDa, respectively. Three putative glycosylation sites were detected at N 38 , N 128 , and N 257 . Quantitative Southern blot revealed that the plg1 and plg2 genes exist as single copies in the P. griseoroseum genome. Our results indicate that they are the only members of the pectin lyase gene family in this fungus. Northern hybridization analysis and RT-PCR were conducted to study the regulation of plg1 and plg2 expression. Both genes are regulated at the transcription level although they are controlled in different ways. Citric pectin and sucrose/yeast extract induces plg1 expression when P. griseoroseum is xiicultivated during 96 h. However the highest transcript accumulation was detected at 24 h. Transcription of plg1 is substantially repressed when glucose, fructose, galactose and xylose are added to the medium culture. plg2 transcripts were only detected by RT-PCR demonstrating that this gene is expressed at lower levels when compared to plg1. The plg2 transcription was seen in sucrose/yeast extract while transcript levels were low in citric pectin and apple pectin. The 5’-flanking regions of plg1 and plg2 genes were sequenced and putative CAAT and TATA boxe were identified as well a putative consensus binding sites for CreA and PacC. These cis-elements explain the regulation of these genes since both undergo catabolite repression (CreA) and are influenced by the medium pH (PacC). The plg1 gene is induced by sucrose/yeast extract. RT-PCR analysis showed that sucrose alone doesn’t trigger its expression and low amounts of plg1 transcript were detected when the fungus was cultivated only in yeast extract. These results provide strong evidence that plg1 expression relies on both sucrose and yeast extract. P. griseoroseum was grow on medium containing sucrose and yeast extract in order to analyze if plg1 expression also depends on cAMP. Differential expression was seen when different substances were added and at the time points sampled, 18 and 24 h. Caffeine and yeast extract raised the expression of plg1 gene when compared to the control, sucrose and yeast extract. Even higher expression was seen from combination of sucrose/caffeine and yeast extract. No transcript accumulation was detected when the fungus was cultivated on sucrose and dibutyril-cAMP in opposition to cultivation on sucrose and yeast extract. This accumulation was only observed in the presence of yeast extract and provides evidence that a simple raise in the endogen cAMP level would not be able to induce plg1 transcription.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 520006 bytes, checksum: baf36fdbccb290fdbea3be4be8fae1fc (MD5) Previous issue date: 2007-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Penicillium griseoroseum has been described as a promising species for polygalacturonase (PG) and pectin lyase (PL) production. However, the genes encoding these enzymes in this organism require induction by pectin and are repressed by glucose. One strategy to increase the expression of these genes is the replacement of original promoter by a strong constitutive one. Thus, in order to obtain PG and PL overproducing strains with no need of pectin induction, we performed the co-transformation of previously described recombinant T105, a strain that contains additional copies of plg1 gene under the control of gpdA promoter from Aspergillus nidulans, using the plasmids pAN52pgg2 and pAN7.1. The resulting strains showed at least one copy of pAN52pgg2 into the genome. A genetically stable strain, named recombinant R20 was chosen for further characterization because of its high levels of PG and PL activity compared to the other recombinant strains obtained. This strain exhibited elevated production of both enzymes when cultivated in presence of glucose, sucrose or sugar cane juice. Increases of up to 11 times in PG activity and 45 times in PL activity were detected when the recombinant R20 was cultivated in sugar cane juice, in comparison with the wild type strain grown in optimized production conditions. The maximum production of PG, PL, and dry mycelium mass by recombinant strain was observed in the following conditions: inoculum of 106 conidia.mL-1, 1% glucose, 200 mL of culture medium in 500 mL Erlenmeyer flasks, and incubation time of 72 to 96 hours under agitation of 150 RPM at 25oC. Denaturing SDS-PAGE of the recombinant R20 culture filtrate revealed the presence of two protein bands of about 38 and 36 KDa corresponding to PG and PL, respectively. In addition, this strain secreted 18 mg of total protein per liter of culture medium in 120 hours of incubation, being PG and PL the main protein secreted. These results will be valuable for the setting of enzyme production experiments in large scale and ultimately in the application of R20 strain for industrial production of pectinases. / Penicillium griseoroseum foi descrita como uma espécie promissora para a produção de poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL). No entanto, os genes que codificam estas enzimas em P. griseoroseum requerem indução por pectina e sofrem repressão catabólica na presença de glicose. Uma estratégia para aumentar a expressão destes genes é a substituição do promotor endógeno por um promotor forte e constitutivo. Desse modo, para se obter linhagens com alta produção de poligalacturonase e pectina liase, sem a necessidade de indução, foi feita a co-transformação da linhagem recombinante 105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor do gene gpd de A. nidulans, utilizando-se os plasmídeos pAN52pgg2 e pAN7.1. As linhagens recombinantes obtidas apresentaram, pelo menos, uma cópia do pAN52pgg2 integrada no genoma. A linhagem mitoticamente estável, denominada recombinante R20 de P. griseoroseum, foi selecionada por apresentar a maior produção de PG e PL em comparação com as demais linhagens recombinantes obtidas. Esta linhagem apresentou uma elevada produção de poligalacturonase e pectina liase, quando cultivada em presença de glicose, sacarose ou caldo de cana. Aumentos de 11 vezes na atividade de PG e de 45 vezes na atividade de PL ocorreram, quando a linhagem recombinante R20 foi cultivada em caldo de cana, em relação à linhagem selvagem cultivada em condições ótimas de produção. A maior produção de PG, PL e massa micelial seca pela linhagem recombinante R20 foi obtida, quando se utilizou inóculo de 106 conídios/mL, concentração de glicose 1% (p/v), volume de 200 mL de meio de cultivo em Erlenmeyers de 500 mL e tempo de cultivo de 72 a 96 horas, sob agitação de 150 RPM a 25ºC. No perfil protéico da linhagem recombinante R20 evidenciou-se a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, que correspondem a PG e a PL, respectivamente. A linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo, enquanto a atividade celulolítica não foi detectada nas condições avaliadas. Além disso, a linhagem recombinante R20 teve uma secreção de 18 mg de proteína total/L em 120 horas de cultivo, sendo pectina liase e poligalacturonase preferencialmente secretadas. Os resultados são úteis para a condução de experimentos de otimização em larga escala e posterior aplicação da linhagem recombinante R20 na indústria de produção de pectinases.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo correto.pdf: 535635 bytes, checksum: 2ca42e241dd388099a705af6f2c401d0 (MD5) Previous issue date: 2008-10-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Filamentous fungi are recognized as excellent producers of extracellular enzymes and the genetically modified strains have made possible the production of pectinases with greater specificity and purity, better use of raw materials and lower production of waste. The production of pectin lyase (PL) and polygalacturonase (PG) by genetically modified strain Penicillium griseoroseum T20 has been studied. The response surface methodology (RSM) was used to optimize PL and PG production. The parameters sucrose concentration and cultivation time were evaluated. The highest PL production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 87.7 h in sucrose 15.7 g/L and the highest PL estimated activity was 2428 U/ml. The higher PG production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 83.8 hours and the highest PG estimated activity was 9465 U/ml. The sucrose concentration showed no significant influence on the production of this enzyme. The optimization in Erlenmeyer flasks was followed by the scaleup to 10 L bioreactor. The aeration conditions were evaluated and the highest PL and PG activity was observed in 1.0 L of air per minute. Under this condition, the strain showed low protease activity, just in the final period of cultivation, and β-glucosidase activity was not detected. The protein profile of the recombinant strain T20 showed the presence of two distinct bands of with approximately 38 and 36 kDa. These bands corresponded to PL and PG, respectively. The mycelial growth of the strain P. griseoroseum T20 has been studied by RSM, and the maximum mycelial dry weight observed was 8.63 g/L, on 30 g/L sucrose and 120 hours of cultivation. The mycelial morphology suggested a link between the occurrence of free and dispersed hyphae and the production of PL and PG. The kinetic parameters of fermentation were determined and compared between the scales of PL and PG production. The maximum total protein was 9.1 and 9.5 mg/L in cultures of 200 ml and 10 L, respectively. The specific PL (PspePLp) and PG (PspePGp) activities in relation to total protein were 353 and 613 U/g at 200 mL cultivation and 305 and 1106 U/g at 10 L cultivation, respectively. The maximum yield of PL (PdPL) and PG (PdPG) observed were 33.4 and 73.3 U/mL.h at 200 mL cultivation and 24.1 and 289 U/L.mL.h at 10 L. The performance parameters of PL (RPL/S) and PG (RPG/S) were 214 and 352 at 200 ml cultivation and 87.4 and 1049 at 10 L, respectively. The PL and PG production between P. griseoroseum T20 and P. griseoroseum wide type strain was compared. Increases of more than 400 times in the PL production and at least 14 times in the PG production were observed. The results suggest the great potential for industrial application of this strain for the production of PL and PG. / Fungos filamentosos são reconhecidos como excelentes produtores de enzimas extracelulares e as linhagens geneticamente modificadas têm tornado possível a produção de pectinases com maior especificidade e pureza, melhor utilização de matéria-prima e menor produção de resíduos. O processo de produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) pela linhagem geneticamente modificada Penicillium griseoroseum T20 foi estudado. As condições ótimas de cultivo para a produção de PL e PG foram determinadaspor meio da Metodologia de Superfície de Resposta (RSM). A maior produção de PL em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 87,7 h em meio contendo sacarose em concentração inicial de 15,7 g/L, sendo a maior atividade de PL estimada de 2.428 U/mL. A maior produção de PG em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 83,8 h, sendo a maior atividade de PG estimada de 9.465 U/mL. A concentração de sacarose não mostrou influência significativa sobre a produção dessa enzima. Após otimização dos fatores tempo de cultivo e concentração de sacarose em Erlenmeyers, foi feito o escalonamento para biorreator com 10 L de trabalho. A condição de aeração que proporcionou a maior atividade de PL e PG foi de 1,0 L de ar por minuto. Nessa condição, a linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo e não foi detectada atividade de β-glicosidase. O perfil protéico da linhagem recombinante T20 mostrou a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, correspondentes à PG e à PL, respectivamente. O crescimento micelial da linhagem P. griseoroseum T20 foi estudado por meio da RSM, e a massa micelial seca máxima estimada foi de 8,63 g/L, na condição de 30 g/L de sacarose após 120 horas de cultivo. A avaliação da morfologia micelial sugeriu a existência de uma relação entre a ocorrência de hifas livres e dispersas e a produção de PL e PG. Os parâmetros cinéticos da fermentação foram determinados e comparados entre as escalas de produção de PL e PG. A proteína total máxima observada foi de 9,1 e 9,5 mg/L nos cultivos de 200 mL e 10 L, respectivamente. As atividades específicas de PL (PspePLp) e PG (PspePGp) em relação à proteína total foram de 353 e 613 U/μg no cultivo em 200 mL e de 305 e 1.106 U/μg no cultivo em 10 L, respectivamente. As produtividades enzimáticas máximas de PL (PdPL) e PG (PdPG) observadas foram de 33,4 e 73,3 U/mL.h em 200 mL e de 24,1 e 289 U/mL.h em 10 L. Os parâmetros rendimento de PL (RPL/S) e de PG (RPG/S) calculados foram de 214 e 352 no cultivo em 200 mL e de 87,4 e 1.049 no cultivo em 10 L, respectivamente. A produção de PL e PG entre as linhagens P. griseoroseum T20 e P. griseoroseum selvagem foi comparada e aumentos de mais 400 vezes na produção de PL e de pelo menos 14 vezes na produção de PG foram observados. Os resultados sugerem o grande potencial de aplicação industrial dessa linhagem para a produção de PL e PG.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 800491 bytes, checksum: 274cc18672a32ed45926e416e0de5305 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / The homologue recombination in Kluyveromyces lactis is not the preferential way used as repair mechanism of DNA double strand, desirable in proteins expression construction dependent on gene-specific integration. In order to obtain K. lactis strains to recombinant protein expression efficient in homologue recombination way, KU80 gene was interrupted. The perfect running of non-homologue ends junctions (NHEJ) way depends on that gene and is responsible by exogenous DNA random integration in the host genome. KU80 gene deletion was made by Split-Marker. Two fragments were generated by PCR fusion, each one with a flanker sequence of KU80 coding region (5 and 3 ends) and part of geneticin resistance gene (KanMX). Deletion cassette resulting from in vivo recombination of two fragments had KanMX gene flanked by KU80 coding regions end sand was used for KU80 deletion by homologue recombination in the genome in two K. lactis strains, JA6 and HP108. The 3.7 Kb fragment obtained by PCR amplification with external primers to KU80 coding region confirmed deletion cassette integration in the target gene. Integration efficiency with Split-Marker resulting fragments was 100 %. pKLAC1 and pKLAC1/cStp vectors with streptavidin affinity domain by biotin were used to determine homologue recombination efficiency of KU80 (JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80) mutant strains. Pectin lyase coding gene (plg1) from Penicillium griseoroseum was cloned in those vectors to evaluate the capacity of K. lactis strains to produce and secrete the recombinant protein. The transformation efficiency (transformants/μg of DNA) of mutants JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80 with pKLAC1/Plg1 and pKLAC1/cStp-Plg1 vectors was higher than to parental strains JA6 and HP108. Target gene integration efficiency was 100 % in most strains, except to strains JA6/Plg1and HP108ΔKU80/Plg1 that showed an integration efficiency of 80 and 70 %, respectively. Although the high efficiency of specific-gene integration there was no pectin lyase (PL) or cStp-Plg1 secretion as expected for pKLAC1 vector. PL intracellular activity was significant when compared with parental strain HP108/Plg1, that presented specific activity of 9,525 U.mg-1 protein. / A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.