Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 800491 bytes, checksum: 274cc18672a32ed45926e416e0de5305 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / The homologue recombination in Kluyveromyces lactis is not the preferential way used as repair mechanism of DNA double strand, desirable in proteins expression construction dependent on gene-specific integration. In order to obtain K. lactis strains to recombinant protein expression efficient in homologue recombination way, KU80 gene was interrupted. The perfect running of non-homologue ends junctions (NHEJ) way depends on that gene and is responsible by exogenous DNA random integration in the host genome. KU80 gene deletion was made by Split-Marker. Two fragments were generated by PCR fusion, each one with a flanker sequence of KU80 coding region (5 and 3 ends) and part of geneticin resistance gene (KanMX). Deletion cassette resulting from in vivo recombination of two fragments had KanMX gene flanked by KU80 coding regions end sand was used for KU80 deletion by homologue recombination in the genome in two K. lactis strains, JA6 and HP108. The 3.7 Kb fragment obtained by PCR amplification with external primers to KU80 coding region confirmed deletion cassette integration in the target gene. Integration efficiency with Split-Marker resulting fragments was 100 %. pKLAC1 and pKLAC1/cStp vectors with streptavidin affinity domain by biotin were used to determine homologue recombination efficiency of KU80 (JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80) mutant strains. Pectin lyase coding gene (plg1) from Penicillium griseoroseum was cloned in those vectors to evaluate the capacity of K. lactis strains to produce and secrete the recombinant protein. The transformation efficiency (transformants/μg of DNA) of mutants JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80 with pKLAC1/Plg1 and pKLAC1/cStp-Plg1 vectors was higher than to parental strains JA6 and HP108. Target gene integration efficiency was 100 % in most strains, except to strains JA6/Plg1and HP108ΔKU80/Plg1 that showed an integration efficiency of 80 and 70 %, respectively. Although the high efficiency of specific-gene integration there was no pectin lyase (PL) or cStp-Plg1 secretion as expected for pKLAC1 vector. PL intracellular activity was significant when compared with parental strain HP108/Plg1, that presented specific activity of 9,525 U.mg-1 protein. / A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 952076 bytes, checksum: 7fbcb43414ecacd3439620826b6172cd (MD5) Previous issue date: 2012-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean anthracnose. Genes that encode cell wall-degrading enzymes are essential for the development of this disease. The pectinases are characterized as the most important group of cell wall- degrading enzymes produced by phytopathogen fungi. The gene coding for pectate lyase, pecCl1, was previously identified in a suppressive subtractive library of bean infected with C. lindemuthianum. Isolation of the gene pecCl1 made it possible to obtain mutants and to analyze the regulation of this gene during development of anthracnose, determining whether the pectate lyase is a pathogenic factor. Thus, the aim of our study was structurally and functionally characterize the gene encoding pectate lyase in C. lindemuthianum. Initially, was performed the structural analysis of the gene pecCl1. The complete nucleotide sequence of the gene pecCl1 was deposited in Genbank with accession number JX270683. The analysis of the promoter region revealed some putative cis-elements and potential binding motifs of transcription factors involved in the regulation of pectate lyase gene expression. The deduced amino acid sequence of pecCl1 showed sequence identity with the pectate lyase F of Colletotrichum higginsianum and the pectate lyase C of Glomerella graminicola M1.001. Furthermore, it was found putative conserved domain pfam03211 of the pectate lyases superfamily. The gene pecCl1 is represented by a single copy in the C. lindemuthianum genome. However, into the genome of Colletotrichum graminicola, three sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, and into the genome of C. higginsianum seven sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, indicating that the C. lindemuthianum genome can possess other genes encoding pectate lyase. Phylogenetic analysis of pectate lyase amino acid sequences of filamentous fungi exhibited the formation of two distinct groups which are grouped on the basis of members of the pectate lyases multigene family. The Split-Marker technique was effective in C. lindemuthianum pecCl1 gene inactivation, allowing the study of pecCl1 function in a mutant by specific integrations and without ectopic integrations. The pecCl1 gene inactivation did not lead to complete loss of the pectate lyase activity, and consequently only decreased anthracnose symptoms in its host, which is consistent with the presence of other genes coding pectate lyase, allowing greater flexibility in pathogen aggressiveness. The analysis of differential expression of gene pecCl1 by qPCR was performed at different stages of bean infection and were observed expression levels of pecCl1 at all stages of development of the fungus in the plant, but a significant increase was observed five days after infection, in the onset of necrotrophic stage. At this stage, secondary hyphae cause extensive degradation of plant cell wall through the secretion of wide range of depolymerases, among these, the pectate lyase. Thus, the pectate lyase encoded by the gene pecCl1 is important to aggressiveness of C. lindemuthianum. The analysis of pectate lyases in C. lindemuthianum can not only assist in understanding the disease, but may also lead to discovery of one more target for disease control. / Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.

Colleotrichum graminicola is the causal agent of anthracnose stalk rot, and is one of the most common and aggressive pathogens of maize. The goal of my Ph.D. project was to contribute to a better understanding of the biology of the interaction between C. graminicola and its host. C. graminicola produces two type of asexual spores: one is produced on the surface of infected tissues and is thought to be involved in the spread of the disease in the field. The second type of spore, oval in shape, is produced inside the infected plant tissues, and was believed to be involved in the movement of the pathogen inside the plant tissues via the vascular system. I tested this hypothesis with both cytological and molecular approaches. I used strains of C. graminicola expressing green fluorescent proteins (GFP) to inoculate wounded plants, and followed the development of the pathogen over time. This study revealed that C. graminicola is not a vascular pathogen. C. graminicola primarily moved through the rind and vascular fibers. Oval spores were produced in colonized parenchyma cells and remained dormant, and did not appear to be involved in the movement of the pathogen, at least during the early stages of the disease development. I also studied pathogen ingress in the absence of a wound. I inoculated unwounded plants with the GFP expressing strains. C. graminicola efficiently colonized the epidermis and, given enough time, penetrated and colonized the deeper parenchyma tissues, after first moving through the fibers. To further test the role of sporulation in colonization of maize tissues, I used targeted mutagenesis to disrupt a major gene known to regulate sporulation and vegetative growth in several other fungi. The gene Cgg1, orthologue of the A. nidulans fadA, was disrupted using the split marker method. The Cgg1 mutants were less pathogenic than the wildtype to wounded plants. This was associated with an apparent increase in production of spores and primary infection hyphae. This suggests that Cgg1 signaling pathway plays a role in maximizing colonization of host tissues, and that this involves negative regulation of sporulation and primary hyphae production in planta.