Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 609136 bytes, checksum: bfac4beb809c8b3d58b49895dc0cc2d1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The high affinity interaction streptavidin-biotin provides an excellent system for industrial enzyme separation or immobilization involving a fused streptavidin-enzyme and a biotinylated support. In order to produce proteins with affinity to biotin, we have modified the commercial K. lactis system, pKLAC1 (New England Biolabs), a LAC4 promoter-driven integration vector for protein expression, with the gene coding streptavidin. The codifying sequence for biotin binding domain of streptavidin (cStp) was amplified by PCR from pSTP4, purified and subcloned to the pCR2.1TOPO (Invitrogen). The fragment has revealed 100% identity with streptavidin gene according to Gene Bank and it was inserted into Xho I / Bgl II pKLAC1 in frame with mating-α-factor signal peptide. The pKLAC1/cStp cut by Ahd I enzyme was used to transform the strains K. lactis MW 98.8C and CB S2359. The transformants selected in Yeast Carbon Base (YCB) containing 5 mM acetamide and confirmed by PCR were mitotically stable. A high cell biomass (OD 600 = 18), obtained in shake-flask 50 mL YPD medium, was centrifuged and transferred to an induction medium, containing 2% of lactose. The cell free medium was qualitatively analyzed for streptavidin and proteins by SDS PAGE. The samples were collected in each 24 hours during 6 days of bath culture. The biotin binding activity of streptavidin in the culture supernatant was determined by HABA test. The medium YPL and YNB with 0,5% of yeast extract have exhibited the best yields for streptavidin extracellular protein production. / A forte interação da proteína estreptavidina pela molécula de biotina constitui um excelente sistema para a separação e/ou imobilização de proteínas e de enzimas de interesse industrial. Com a intenção de produzir proteínas com propriedades de adsorção biosseletiva, nós temos modificado a seqüência do plasmídeo pKLAC1 pela inserção do domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina. Utilizando a técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR), a seqüência de cerca de 355pb foi amplificada a partir do vetor pSTP4 que contém toda seqüência de nucleotídeos referente à proteína estreptavidina. O Fragmento amplificado apresentou 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos da proteína estreptavidina depositada no Gene Bank. O fragmento foi inserido no vetor pKLAC1 nos sítios Xho I e Bgl II em fase com a seqüência do peptídeo sinal do mating-α-factor. O plasmídeo pKLAC1/cStp foi linearizado com enzima Ahd I e foi utilizado para a transformação das linhagens de K. lactis MW 98.8C e CBS 2359. Os transformantes selecionados em meio YCB (Yeast Carbon Base) contendo 5 mM de acetamida como única fonte de nitrogênio e confirmados por PCR foram mitoticamente estáveis. A alta biomassa celular (DO600 = 18) obtida em erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio YPD foi centrifugada e transferida para meio de indução contendo 2% (p/v) de lactose. O sobrenadante das culturas foi analisado qualitativamente para estreptavidina pela técnica de SDS PAGE. As proteínas totais foram determinadas pelo método de BRADFORD utilizando BSA (Albumina Bovina Sérica) como padrão. As amostras foram coletadas a cada 24 horas durante 6 horas de cultivo sob regime de batelada. A atividade da proteína estreptavidina presente no sobrenadante das culturas recombinantes foi determinada pelo teste do reagente HABA. Os meios YPL e YNB contendo 0,5% de extrato de levedura exibiram os melhores resultados quanto à produção extracelular de estreptavidina ativa e de proteínas totais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 800491 bytes, checksum: 274cc18672a32ed45926e416e0de5305 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / The homologue recombination in Kluyveromyces lactis is not the preferential way used as repair mechanism of DNA double strand, desirable in proteins expression construction dependent on gene-specific integration. In order to obtain K. lactis strains to recombinant protein expression efficient in homologue recombination way, KU80 gene was interrupted. The perfect running of non-homologue ends junctions (NHEJ) way depends on that gene and is responsible by exogenous DNA random integration in the host genome. KU80 gene deletion was made by Split-Marker. Two fragments were generated by PCR fusion, each one with a flanker sequence of KU80 coding region (5 and 3 ends) and part of geneticin resistance gene (KanMX). Deletion cassette resulting from in vivo recombination of two fragments had KanMX gene flanked by KU80 coding regions end sand was used for KU80 deletion by homologue recombination in the genome in two K. lactis strains, JA6 and HP108. The 3.7 Kb fragment obtained by PCR amplification with external primers to KU80 coding region confirmed deletion cassette integration in the target gene. Integration efficiency with Split-Marker resulting fragments was 100 %. pKLAC1 and pKLAC1/cStp vectors with streptavidin affinity domain by biotin were used to determine homologue recombination efficiency of KU80 (JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80) mutant strains. Pectin lyase coding gene (plg1) from Penicillium griseoroseum was cloned in those vectors to evaluate the capacity of K. lactis strains to produce and secrete the recombinant protein. The transformation efficiency (transformants/μg of DNA) of mutants JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80 with pKLAC1/Plg1 and pKLAC1/cStp-Plg1 vectors was higher than to parental strains JA6 and HP108. Target gene integration efficiency was 100 % in most strains, except to strains JA6/Plg1and HP108ΔKU80/Plg1 that showed an integration efficiency of 80 and 70 %, respectively. Although the high efficiency of specific-gene integration there was no pectin lyase (PL) or cStp-Plg1 secretion as expected for pKLAC1 vector. PL intracellular activity was significant when compared with parental strain HP108/Plg1, that presented specific activity of 9,525 U.mg-1 protein. / A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.