Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The project "Metabolic, enzymatic and genetic studies of the endophytic fungus P. brasilianum" resulted in biosynthetic studies of bisphenylpropanoid amides, the brasilimides, confirming the origin of these substances via phenylpropanoid biosynthesis pathway, very unusual in fungi. PAL activity, the first enzyme involved in this biosynthetic route was successfully evaluated and the conditions of PAL production by P. brasilianum were optimized (culture medium and induction of PAL adding Phe to the culture), and the incubation conditions of the enzymatic reaction. The specificity of the PAL enzyme was studied, and the enzyme showed activity toward all substrates tested, including acting as TAL (tyrosine ammonia lyase). In vivo studies throught the addition of different substrates lead to N-acetylation confirmed by spectroscopy data. The genome of the fungus P. brasilianum was sequenced, and extensive studies through bioinformatics lead to the gene encoding PAL enzyme. From molecular biology studies, the enzyme was cloned and expressed as recombinant PAL fused to a SUMO protein and a his-tag at the N- terminus of the protein in pETSUMO vector expressed in E. coli BL21 (DE3) to obtain the best conditions for enzyme overexpression in its soluble form. The purification process of the recombinant enzyme was studied from a single purification step (affinity chromatography) by pH gradient elution, obtaining a high degree of purity confirmed by one-dimensional electrophoresis. The pure recombinant PAL enzyme obtained was characterized by MS and biochemically yielding Km values of 4,8 mM. Recent studies seem to point out that there is a relationship between the production of brasiliamides when the fungus is subjected to stress conditions. The PAL enzyme appears to be involved in defense mechanisms in this fungus, as has been described for plants. / O projeto "Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico P. brasilianum" tratou de investigações biossintéticas das amidas bisfenilpropanoídicas, as brasiliamidas, confirmando a origem fenilpropanoídica destas substâncias, muito incomum em fungos. A atividade da enzima Fenilalanina amônia-liase, primeira da rota biossintética, foi avaliada pela primeira vez no fungo em estudo, e as condições da produção de PAL por P. brasilianum foram otimizadas (meio de cultivo e indução ao adicionar fenilalanina ao cultivo), assim como as condições de incubação da reação enzimática. A especificidade da enzima foi determinada a qual se apresentou altamente promíscua em todos os substratos testados, inclusive atuando como TAL (tirosina amônia-liase). In vivo, a adição de diferentes precursores ao meio de cultivo levou a N-acetilação destes confirmado por dados espectroscópicos. O genoma do fungo P. brasilianum foi sequenciado, e através de extensos estudos de bioinformática pode-se determinar o gene que codifica a enzima PAL. A partir de estudos de biologia molecular foi possível clonar e expressar a enzima PAL recombinante fusionada a uma proteína SUMO e uma cauda polihis no N-terminal da proteína em vetor pETSUMO expresso em E. coli BL21(DE3) obtendo-se, dessa maneira, as melhores condições para superexpressão enzimática na forma solúvel. O processo de purificação da enzima recombinante foi estudado a partir de um único passo de purificação (coluna de afinidade) por gradiente de pH, obtendo alto grau de pureza comprovado através de eletroforese monodimensional. A enzima PAL recombinante pura obtida foi caracterizada por MS e bioquimicamente obtendose valores de Km de 4,8 mM. Estudos parecem deixar claro que exista uma relação entre a produção de brasiliamida A quando o fungo é submetido a situações de estresse, seguindo mesmo comportamento relatado em plantas e, portanto, a enzima PAL parece estar envolvida em mecanismos de defesa neste fungo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4447.pdf: 11266317 bytes, checksum: 6b1120210ec06b96c9b2a338298384a7 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Microorganisms, known as being relatively simple, have shown a great adaptation power to different nutritional situations by changing their metabolism with lack or supply of nutrients in the culture medium. This feature allows a wide range of the use of microorganisms to produce metabolites with several interests. This study has been named OSMAC (One Strain Many Compounds) approach, which was applied in this study by using two fungi from Penicillium genus. Through culture medium modification with FeCl3 during growth of P. brasilianum, it was able to produce isoquinolinic alkaloid. On the other hand, the addition of CaCl2, another alkaloid belonging to tremogenic class was isolated and analysed by spectroscopic methods. When P. griseoroseum was cultivated with NH4Br, it was observed the production of a halogenated secondary metabolite, which was not reported before (brominated roquefortine C). Analyses by GC/MS led to detect three phenolic compounds with bromine atoms in its structure. The secondary metabolites of P. griseoroseum with no modification in the culuture medium were studied and three metabolites were isolated. Two of them belong to the tetronic acid class and the other one was isolated as a dimer from clavatol. Analyses by LC/ MS-MS were able to identify other tetronic acids in the ethyl acetate extract from P. griseoroseum. / Os microorganismos, por serem de organização relativamente simples, têm um poder de grande adaptação a variadas situações nutricionais, modificando seu metabolismo com a carência ou com o fornecimento de nutrientes ao meio de cultivo. Isso permite uma ampla flexibilidade em sua utilização, podendo-se induzir microorganismos a produzir determinadas substâncias de interesse. Esta abordagem pode levar a uma variedade de novos metabólitos secundários interessantes a partir de uma única cepa de um microorganismo. Este estudo vem sendo denominado de abordagem OSMAC (One Strain Many Compounds), a qual foi utilizada no presente trabalho com dois fungos do gênero Penicillium. Foi verificado que ao modificar o meio de cultura com FeCl3 durante o crescimento de P. brasilianum houve a produção de um alcalóide isoquinolínico, enquanto com a adição de CaCl2 houve a produção de outro alcalóide pertencente à classe dos alcalóides tremogênicos. Com relação ao fungo P. griseoroseum, foi isolado um metabólito halogenado (roquefortina C contendo um átomo de bromo) quando ao meio de cultura foi adicionado NH4Br. As substâncias isoladas foram analisadas por técnicas espectroscópicas. Também foram detectados por GC/MS mais três compostos fenólicos contendo átomos de bromo em sua estrutura. O metabolismo secundário de P. griseoroseum foi analisado e foram isolados policetídeos pertencentes à classe dos ácidos tetrônicos e um dímero do clavatol, inédito na literatura. Análises por LC/MS-MS detectaram outros ácidos tetrônicos presentes no extrato de acetato de etila.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6548.pdf: 4383232 bytes, checksum: 8fc19ea524835c26efc13265b5ea37ad (MD5) Previous issue date: 2014-03-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Endophytic microorganisms have a great enzymatic potential to biotransformate substances of natural and synthetic origin due to strategies developed during colonization to coexist with the plant in an initial hostile environment. Microbial transformation of Diels-Alder cycloadducts were trailed by the endophyte P. brasilianum using intact cells and resulted in the production of several products (17). These products were identified as products of chlorination (Q4_F2_15), epoxidation (Q1A_CR_16, Q2A_CR_6, Q3A_CR_5), epoxidation and reduction of conjugated double bond (Q2A_CR_5), reduction of conjugated double bond (Q2A_CR_9, Q3A_CR_7_pico2, Q3A_CR_8, Q4A_CR_23), reduction of isolated double bond (Q1A_CR_26), oxidation of allilic methyl group and reduction of conjugated double bond (Q4A_CR_10), reduction of carbonyl and conjugated double bond (Q4A_CR_20), reduction of carbonyl and ether formation (Q5A_CR_15) and finally, reduction of carbonyl group (Q4A_CR_15 e Q5A_CR_18). The reduction of conjugated double bond can be performed by enzymes called Old Yellow Enzymes (OYE), also known as enoate reductase enzymes. The products of carbonilic or double bond reduction were also synthesized chemically and the enantioselectivity of both in vitro and in vivo process were compared. In all cases, microbiological transformations were more enantioselectivity. / Devido às estratégias usadas para a colonização do hospedeiro e à convivência com a planta em um ambiente inicialmente hostil, os micro-organismos endofíticos possuem um grande potencial enzimático para biotransformar substâncias de origem natural e seus análogos sintéticos. A transformação dos cicloadutos de Diels-Alder feitas pelo endofítico P. brasilianum utilizando-se células intactas resultou na produção de 17 produtos de biotransformação. Esses produtos foram identificados como sendo produtos de halogenação (Q4_F2_15), epoxidação (Q1A_CR_16, Q2A_CR_6, Q3A_CR_5), epoxidação e redução da olefina conjugada (Q2A_CR_5), redução da dupla ligação α, β- insaturada (Q2A_CR_9, Q3A_CR_7_pico2, Q3A_CR_8, Q4A_CR_23), redução da olefina isolada (Q1A_CR_26), oxidação alílica de metila e redução da dupla conjugada (Q4A_CR_10), redução carbonílica e dupla conjugada (Q4A_CR_20), redução carbonílica e formação de éter (Q5A_CR_15) e redução de grupos carbonílicos (Q4A_CR_15 e Q5A_CR_18). As reduções das olefinas pertencentes ao sistema α, β- insaturada podem ter sido catalisadas por enzimas da família Old Yellow Enzymes (OYE), também conhecidas por enoato redutases. Os produtos de redução C=C do sistema α, β- insaturado e redução carbonílica também foram sintetizados quimicamente e a enantiosseletividade de ambos os processos foram comparadas. Em todos os casos, as transformações microbiológicas apresentaram uma maior enantiosseletividade.