Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-10-19T17:15:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896366 bytes, checksum: df17102ca94817fab1eadb2b66218eaa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-19T17:15:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896366 bytes, checksum: df17102ca94817fab1eadb2b66218eaa (MD5) Previous issue date: 2018-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O uso de pesticidas no controle de insetos praga e patógenos leva a uma série de consequências que prejudicam o meio ambiente e a saúde humana. Em busca de controles alternativos de pragas, este estudo avaliou o potencial de extratos brutos e substâncias isoladas da espécie vegetal Cabralea canjerana spp. canjerana sob a praga da soja, Anticarsia gemmatalis, e de inibidores de proteases sob a praga do citros, Diaphorina citri. Os extratos etanólicos de folhas, galhos, sementes, frutos, e triterpenos isolados de C. canjerana foram avaliados com base nos parâmetros biológicos, índices nutricionais e atividades das principais enzimas digestivas de A. gemmatalis. Os parâmetros biológicos mais afetados pelos extratos foram mortalidade e oviposição. Vale ressaltar que o tratamento extrato galhos 1000 ppm ocasionou uma mortalidade de 80% dos insetos. Os triterpenos não afetaram negativamente os parâmetros analisados. Em relação a D. citri, foi avaliado o efeito de diferentes inibidores de proteases sobre o ciclo de vida e realizada a caracterização bioquímico-cinética de cisteíno protease. Os resultados mostraram que todos os inibidores testados aumentaram a mortalidade de ninfas, no entanto, o inibidor E64 apresentou também efeitos adversos na emergência, oviposição e viabilidade dos ovos. A caracterização de cisteíno proteases de D. citri mostrou que o pH e temperatura de maior atividade foi 6,0 e 25°C. Ao analisar o efeito dos inibidores na atividade verificou-se que a enzima foi insensível a aprotinina e berenil, no entanto E64 (50 μM) reduziu significativamente a atividade. Os valores de V max app e K M app foram de 31,15 nM s -1 e 0,028 mM, respectivamente. Esses resultados sugerem que os psilídeos utilizam cisteíno proteases para a digestão de proteínas. Nossos experimentos demonstraram eficiência dos extratos etanólicos de C. canjerana em A. gemmatalis, e alterações danosas a D. citri pelo inibidor de cisteíno protease E64, o que os tornam candidatos ao desenvolvimento de um potencial inseticida. / The use of pesticides in the control of insect pests and pathogens leads to a number of consequences that harm the environment and human health. In search of alternative pest control, this study evaluated the potential of raw extracts and isolated substances of the Cabralea canjerana spp. canjerana under the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, and protease inhibitors under the citrus pest, Diaphorina citri. The ethanolic extracts of leaves, stems, seeds, fruits, and triterpenes isolated from C. canjeranawere evaluated based on the biological parameters, nutritional indexes and activities of the main digestive enzymes of A. gemmatalis. The biological parameters most affected by the extracts were mortality and oviposition. It is noteworthy that, the treatment extract stems 1000 ppm caused a mortality of 80% of the insects. The triterpenes did not negatively affect the analyzed parameters. In relation to D. citri, the effect of different protease inhibitors on the life cycle and the biochemical-kinetic characterization of cysteine protease were evaluated. The results showed that all inhibitors tested increased nymph mortality, however, the E64 inhibitor also had adverse effects on emergence, oviposition and egg viability. The characterization of cysteine proteases from D. citri showed that the pH and temperature of highest activity was 6.0 and 25°C. In analyzing the effect of the inhibitors on the activity, it was verified that the enzyme was insensitive to aprotinin and berenil, however E64 (50 μM) significantly reduced the activity. The values of V max app and K M app were 31.15 nM s -1 and 0.028 mM, respectively. These results suggest that the psyllids use cysteine proteases for the digestion of proteins. Our experiments demonstrated the efficiency of the C. canjerana extracts in A. gemmatalis, and damage to D. citri by the cysteine protease inhibitor E64, which makes them candidates for the development of a potential insecticide.

Apesar de o Brasil ser um dos principais produtores de laranja no mundo e o maior exportador de suco concentrado, atualmente a cultura vem sofrendo perdas em razão do ataque de diversas pragas e doenças, sendo a principal o Huanglongbing (HLB), ou Greening, que foi relatada pela primeira vez em 2004 no estado de São Paulo. Essa doença está associada às bactérias do gênero \"Candidatus Liberibacter sp.\", sendo que no Brasil ocorrem as bactérias \"Ca. Liberibacter asiaticus\" e \"Ca. Liberibacter americanus\", tendo como seus vetores o psilídeo Diaphorina citri, praga importante devido a sua distribuição geográfica e características biológicas. Existe registro de cerca de 50 espécies da família Rutaceae, que incluem as espécies do gênero Citrus (laranjas, limões, limas, etc.), que podem hospedar esse inseto, além da murta (Murraya paniculata). Na natureza, D. citri é controlado por uma série de fatores, podendo ser outros insetos, fungos ou até condições climáticas desfavoráveis para seu desenvolvimento. Porém, os resultados de pesquisas indicam que ectoparasitoide Tamarixia radiata é eficiente no controle de D. citri. Entretanto, levantamentos realizados nos últimos anos verificaram que o parasitismo natural vem sendo reduzido consideravelmente, devido, principalmente, à aplicação intensiva de agroquímicos. Dessa forma, a utilização de produtos seletivos, ou seja, que atue contra o psilídeo D. citri e tenha o menor impacto possível sobre o parasitoide T. radiata é imprescindível para o sucesso do manejo integrado de pragas em que se utiliza o controle químico juntamente com a liberação do parasitoide. Assim, objetivou-se com esse trabalho: 1) Estudar o efeito direto e a persistência de inseticidas sobre o parasitoide T. radiata; 2) Estudar o efeito de inseticidas sobre a fase pupal do parasitoide; 3) Determinar a interferência dos inseticidas na capacidade de parasitismo; 4) Avaliar a toxicidade diferencial dos inseticidas para o parasitoide T. radiata e para o psilídeo D. citri. Dos 25 inseticidas testados no efeito direto, 20% foram considerados inócuos (classe 1); 12% levemente nocivo (classe 2); 12% moderadamente nocivo (classe 3); e 56% como nocivo (classe 4). Apesar de vários serem nocivos para adultos do parasitoide, apenas Lorsban® 480 BR e Perfekthion® afetaram a emergência do parasitoide quando pulverizados sobre a sua fase de pupa, sendo que os demais permitiram a emergência e não afetaram a duração, razão sexual e longevidade. No teste de persistência, 25% dos inseticidas testados foram considerados de vida curta (classe 1); 37,5% como levemente persistentes (classe 2); 29,2% moderadamente persistentes (classe 3); e apenas 8,3% persistentes (classe 4). Portanto, para a escolha de um inseticida para controle de pragas dos citros, deve-se levar em consideração seu efeito no adulto, fase imatura e sua persistência biológica na planta. / Although Brazil is one of the major orange producers and largest exporter of juice concentrate in the world, currently the citrus culture suffers losses due to the attack of several pests and diseases. Huanglongbing (HLB), or Greening, is the main disease and it was first reported in 2004 in the State of São Paulo, Brazil. This disease is associated with bacteria of the genus \"Candidatus Liberibacter sp.\", and in Brazil the bacteria \"Ca. Liberibacter asiaticus\" and \"Ca. Liberibacter americanus\" occur, and the psyllid Diaphorina citri is its main vector, an important pest insect because of its geographical distribution and biological characteristics. There is record of about 50 species of the family Rutaceae, including the species of the genus Citrus (oranges, lemons, limes, etc.) that can host this insect, in addition to orange jasmine (Murraya paniculata). In nature, a number of factors control D. citri, namely other insects, fungi or even adverse weather conditions for their development. However, studies show that the ectoparasitoid Tamarixia radiata is efficient in the control of D. citri. However, recent studies indicate that natural parasitism has been reduced considerably, mainly due to the intensive application of pesticides. Thus, the use of selective products, i.e., which act against the psyllid D. citri with the lowest possible impact on the parasitoids T. radiata is indispensable for the success of the integrated pest management that uses chemical control along with the release of parasitoids. Thus, the objectives of this work were: 1) to study the direct effect and the persistence of insecticides on the parasitoid T. radiata; 2) to investigate the effect of insecticides on the pupal stage of the parasitoids; 3) to determine the effect of insecticides on parasitism capacity; 4) to assess the differential toxicity of insecticides to the parasitoid T. radiata and psyllid D. citri. Of the 25 insecticides tested in terms of direct effect, 20% was considered harmless (class 1); 12% slightly harmful (class 2); 12% moderately harmful (class 3); and 56% as harmful (class 4). Although several are harmful to adult of the parasitoid, only Lorsban® 480 BR and Perfekthion® affected the emergence of the parasitoid when sprayed in the pupal stage, and the others allowed the emergence and did not affect the duration, sex ratio and life span. In the test of persistence, 25% of the insecticides were considered short life (class 1); 37.5% slightly persistent (class 2); 29.2% moderately persistent (class 3); and only 8.3% persistent (class 4). Therefore, choosing an insecticide for control of pests of citrus requires consideration of its effect on adults, immature phase and their biological persistence in the plant.

Atualmente o Brasil ocupa lugar de destaque entre os produtores de citros sendo o maior produtor de laranja doce do mundo. Entretanto, essa produção vem sendo gravemente afetada, por doenças como o huanglongbing (HLB), que tem causado perdas significativas para toda cadeia citrícola. O HLB está associado a bactérias Gram-negativas, restritas ao floema das plantas, denominadas Candidatus Liberibacter spp., que além de reduzir a produção de frutos, podem, em casos mais severos da doença, ocasionar a morte da planta. Uma importante estratégia para controle desta doença é a produção de plantas transgênicas expressando genes, especificamente no local de colonização do patógeno. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de Citrus sinensis cvs. \'Pera\' e \'Natal\', contendo o gene atacina A (attA) que codifica um peptídeo antibacteriano, dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema: AtSuc2 (transportador de sacarose) ou AtPP2 (proteína de floema 2), clonados de Arabidopsis thaliana, ou CsPP2 (proteína de floema 2) clonado de Citrus sinensis. A identificação de 65 plantas transgênicas foi realizada, por meio da análise de PCR. Foi verificado um número menor de eventos transgênicos, utilizando-se a construção gênica pCAtSuc2/attA em relação ao número de eventos transgênicos obtidos com as construções gênicas pCCsPP2/attA e pCAtPP2/attA. Plantas identificadas como transgênicas pela análise de PCR, foram aclimatizadas e transferidas para casa-devegetação certificada para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de Southern blot foram realizadas em plantas aclimatizadas que apresentaram desenvolvimento suficiente, confirmando-se a integração do gene attA. A expressão do gene attA foi confirmada pela análise de RT-qPCR. As plantas transgênicas obtidas neste trabalho, contendo o gene attA dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema, serão avaliadas em uma etapa futura para resistência a Candidatus Liberibacter spp. / Currently, Brazil is a major citrus producer and the world\'s largest producer of sweet oranges. However, diseases, such as huanglongbing (HLB) have seriously affected this production, causing significant losses in citrus production chain. HLB is associated with Gram-negative bacterias, restricted to the phloem of plants, called Candidatus Liberibacter spp., which besides reducing fruit production, can lead to plant death. An important strategy to control this disease is the production of transgenic plants expressing genes, specifically at the region of pathogen colonization. The aim of this study was to obtain transgenic plants of Citrus sinensis cv. \'Natal\' and \'Pera\', containing the gene attacin A (attA) that encodes an antibacterial peptide, driven by preferentially expressed in phloem promoters: AtSuc2 (sucrose transporter) or AtPP2 (phloem protein 2), cloned from Arabidopsis thaliana, or CsPP2 (phloem protein 2) cloned from Citrus sinensis. The identification of 65 transgenic plants was performed by PCR analysis. A lower number of transgenic events were verified using the gene construct pCAtSuc2/attA in relation events obtained with the gene constructs pCCsPP2/attA and pCAtPP2/attA. Plants identified as transgenic by PCR analysis were acclimatized and transferred to a greenhouse certified for growing transgenic plants. The Southern blot analyses were performed in acclimatized plants, which had sufficiently developed, confirming the integration of attA gene. The expression of attA gene was confirmed by RT-qPCR analysis. The transgenic plants obtained in this work, containing the gene attA directed by preferentially expressed in phloem promoters, will be further evaluated for resistance to Candidatus Liberibacter spp.

Apesar de o Brasil ser um dos principais produtores de laranja no mundo e o maior exportador de suco concentrado, atualmente a cultura vem sofrendo perdas em razão do ataque de diversas pragas e doenças, sendo a principal o Huanglongbing (HLB), ou Greening, que foi relatada pela primeira vez em 2004 no estado de São Paulo. Essa doença está associada às bactérias do gênero \"Candidatus Liberibacter sp.\", sendo que no Brasil ocorrem as bactérias \"Ca. Liberibacter asiaticus\" e \"Ca. Liberibacter americanus\", tendo como seus vetores o psilídeo Diaphorina citri, praga importante devido a sua distribuição geográfica e características biológicas. Existe registro de cerca de 50 espécies da família Rutaceae, que incluem as espécies do gênero Citrus (laranjas, limões, limas, etc.), que podem hospedar esse inseto, além da murta (Murraya paniculata). Na natureza, D. citri é controlado por uma série de fatores, podendo ser outros insetos, fungos ou até condições climáticas desfavoráveis para seu desenvolvimento. Porém, os resultados de pesquisas indicam que ectoparasitoide Tamarixia radiata é eficiente no controle de D. citri. Entretanto, levantamentos realizados nos últimos anos verificaram que o parasitismo natural vem sendo reduzido consideravelmente, devido, principalmente, à aplicação intensiva de agroquímicos. Dessa forma, a utilização de produtos seletivos, ou seja, que atue contra o psilídeo D. citri e tenha o menor impacto possível sobre o parasitoide T. radiata é imprescindível para o sucesso do manejo integrado de pragas em que se utiliza o controle químico juntamente com a liberação do parasitoide. Assim, objetivou-se com esse trabalho: 1) Estudar o efeito direto e a persistência de inseticidas sobre o parasitoide T. radiata; 2) Estudar o efeito de inseticidas sobre a fase pupal do parasitoide; 3) Determinar a interferência dos inseticidas na capacidade de parasitismo; 4) Avaliar a toxicidade diferencial dos inseticidas para o parasitoide T. radiata e para o psilídeo D. citri. Dos 25 inseticidas testados no efeito direto, 20% foram considerados inócuos (classe 1); 12% levemente nocivo (classe 2); 12% moderadamente nocivo (classe 3); e 56% como nocivo (classe 4). Apesar de vários serem nocivos para adultos do parasitoide, apenas Lorsban® 480 BR e Perfekthion® afetaram a emergência do parasitoide quando pulverizados sobre a sua fase de pupa, sendo que os demais permitiram a emergência e não afetaram a duração, razão sexual e longevidade. No teste de persistência, 25% dos inseticidas testados foram considerados de vida curta (classe 1); 37,5% como levemente persistentes (classe 2); 29,2% moderadamente persistentes (classe 3); e apenas 8,3% persistentes (classe 4). Portanto, para a escolha de um inseticida para controle de pragas dos citros, deve-se levar em consideração seu efeito no adulto, fase imatura e sua persistência biológica na planta. / Although Brazil is one of the major orange producers and largest exporter of juice concentrate in the world, currently the citrus culture suffers losses due to the attack of several pests and diseases. Huanglongbing (HLB), or Greening, is the main disease and it was first reported in 2004 in the State of São Paulo, Brazil. This disease is associated with bacteria of the genus \"Candidatus Liberibacter sp.\", and in Brazil the bacteria \"Ca. Liberibacter asiaticus\" and \"Ca. Liberibacter americanus\" occur, and the psyllid Diaphorina citri is its main vector, an important pest insect because of its geographical distribution and biological characteristics. There is record of about 50 species of the family Rutaceae, including the species of the genus Citrus (oranges, lemons, limes, etc.) that can host this insect, in addition to orange jasmine (Murraya paniculata). In nature, a number of factors control D. citri, namely other insects, fungi or even adverse weather conditions for their development. However, studies show that the ectoparasitoid Tamarixia radiata is efficient in the control of D. citri. However, recent studies indicate that natural parasitism has been reduced considerably, mainly due to the intensive application of pesticides. Thus, the use of selective products, i.e., which act against the psyllid D. citri with the lowest possible impact on the parasitoids T. radiata is indispensable for the success of the integrated pest management that uses chemical control along with the release of parasitoids. Thus, the objectives of this work were: 1) to study the direct effect and the persistence of insecticides on the parasitoid T. radiata; 2) to investigate the effect of insecticides on the pupal stage of the parasitoids; 3) to determine the effect of insecticides on parasitism capacity; 4) to assess the differential toxicity of insecticides to the parasitoid T. radiata and psyllid D. citri. Of the 25 insecticides tested in terms of direct effect, 20% was considered harmless (class 1); 12% slightly harmful (class 2); 12% moderately harmful (class 3); and 56% as harmful (class 4). Although several are harmful to adult of the parasitoid, only Lorsban® 480 BR and Perfekthion® affected the emergence of the parasitoid when sprayed in the pupal stage, and the others allowed the emergence and did not affect the duration, sex ratio and life span. In the test of persistence, 25% of the insecticides were considered short life (class 1); 37.5% slightly persistent (class 2); 29.2% moderately persistent (class 3); and only 8.3% persistent (class 4). Therefore, choosing an insecticide for control of pests of citrus requires consideration of its effect on adults, immature phase and their biological persistence in the plant.

Atualmente o Brasil ocupa lugar de destaque entre os produtores de citros sendo o maior produtor de laranja doce do mundo. Entretanto, essa produção vem sendo gravemente afetada, por doenças como o huanglongbing (HLB), que tem causado perdas significativas para toda cadeia citrícola. O HLB está associado a bactérias Gram-negativas, restritas ao floema das plantas, denominadas Candidatus Liberibacter spp., que além de reduzir a produção de frutos, podem, em casos mais severos da doença, ocasionar a morte da planta. Uma importante estratégia para controle desta doença é a produção de plantas transgênicas expressando genes, especificamente no local de colonização do patógeno. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de Citrus sinensis cvs. \'Pera\' e \'Natal\', contendo o gene atacina A (attA) que codifica um peptídeo antibacteriano, dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema: AtSuc2 (transportador de sacarose) ou AtPP2 (proteína de floema 2), clonados de Arabidopsis thaliana, ou CsPP2 (proteína de floema 2) clonado de Citrus sinensis. A identificação de 65 plantas transgênicas foi realizada, por meio da análise de PCR. Foi verificado um número menor de eventos transgênicos, utilizando-se a construção gênica pCAtSuc2/attA em relação ao número de eventos transgênicos obtidos com as construções gênicas pCCsPP2/attA e pCAtPP2/attA. Plantas identificadas como transgênicas pela análise de PCR, foram aclimatizadas e transferidas para casa-devegetação certificada para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de Southern blot foram realizadas em plantas aclimatizadas que apresentaram desenvolvimento suficiente, confirmando-se a integração do gene attA. A expressão do gene attA foi confirmada pela análise de RT-qPCR. As plantas transgênicas obtidas neste trabalho, contendo o gene attA dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema, serão avaliadas em uma etapa futura para resistência a Candidatus Liberibacter spp. / Currently, Brazil is a major citrus producer and the world\'s largest producer of sweet oranges. However, diseases, such as huanglongbing (HLB) have seriously affected this production, causing significant losses in citrus production chain. HLB is associated with Gram-negative bacterias, restricted to the phloem of plants, called Candidatus Liberibacter spp., which besides reducing fruit production, can lead to plant death. An important strategy to control this disease is the production of transgenic plants expressing genes, specifically at the region of pathogen colonization. The aim of this study was to obtain transgenic plants of Citrus sinensis cv. \'Natal\' and \'Pera\', containing the gene attacin A (attA) that encodes an antibacterial peptide, driven by preferentially expressed in phloem promoters: AtSuc2 (sucrose transporter) or AtPP2 (phloem protein 2), cloned from Arabidopsis thaliana, or CsPP2 (phloem protein 2) cloned from Citrus sinensis. The identification of 65 transgenic plants was performed by PCR analysis. A lower number of transgenic events were verified using the gene construct pCAtSuc2/attA in relation events obtained with the gene constructs pCCsPP2/attA and pCAtPP2/attA. Plants identified as transgenic by PCR analysis were acclimatized and transferred to a greenhouse certified for growing transgenic plants. The Southern blot analyses were performed in acclimatized plants, which had sufficiently developed, confirming the integration of attA gene. The expression of attA gene was confirmed by RT-qPCR analysis. The transgenic plants obtained in this work, containing the gene attA directed by preferentially expressed in phloem promoters, will be further evaluated for resistance to Candidatus Liberibacter spp.

O Huanglongbing (HLB) é a doença mais limitante para a produção de citros no mundo na atualidade. A alta capacidade de disseminação das bactérias associadas ao HLB pode estar associada com a movimentação do psilídeo vetor, Diaphorina citri, não apenas entre pomares vizinhos, mas também a longas distâncias. A análise de comportamento de dispersão em populações de D. citri e outras espécies de Psylloidea foi abordada mediante o monitoramento espaço-temporal de populações de psilídeos em diferentes alturas e em planta. O monitoramento foi realizado em dois contextos da disseminação primária do HLB, sendo áreas circunvizinhas de pomares comerciais de citros com manejo convencional no Estado de São Paulo. O monitoramento em alturas foi realizado por meio de armadilhas adesivas amarelas alocadas em duas alturas (2,5 e 7,5 m) e armadilha de sucção estacionária. Nos pontos monitorados foram selecionadas plantas hospedeiras de D. citri, amostradas quinzenalmente por meio de rede de varredura e armadilha de sucção portátil. Nos dois contextos foi encontrada correlação positiva entre abundância das espécies de psilídeos em relação às alturas e as épocas de monitoramento. No contexto de \"plantas de fundo de quintal\" coletaram-se 48.8% de psilídeos a 2,5 m e 51.2% a 7,5 m. No contexto de \"pomares com manejo deficiente\" foi encontrado 48.4% dos indivíduos a 2,5 m e 51.6% a 7,5 m. Foram coletados 148.802 espécimes de psilídeos por meio de armadilhas adesivas amarelas, pertencentes a 6 famílias e 24 gêneros, sendo que as espécies mais frequentes e constantes foram Heteropsylla sp., Isogonoceraia divergipennis, Mitrapsylla spp., Glycaspis brimblecombei e Trioza sp. No contexto de \"plantas de fundo de quintal\" a frequência de D. citri em alturas foi 1.5% e em planta foi 70.3%. No contexto de pomares com manejo deficiente, a frequência de D. citri em alturas foi 0.11% e em planta foi 81.8%. A maior densidade de psilídeos (incluindo D. citri) ocorreu do final do inverno até o começo do verão, sendo particularmente concentrada na primavera em ambos os contextos tanto nas áreas circunvizinhas como na borda dos pomares comerciais de citros. CLas foi detectada em 40% dos indivíduos de D. citri encontrados a 7,5 m e em 63.3% dos indivíduos coletados em plantas cítricas. A detecção de CLas foi negativa para as outras espécies de Psylloidea coletadas em altura e em plantas hospedeiras de D. citri. A correlação positiva entre psilídeos coletados a 2,5 m e 7,5 m evidencia possíveis movimentos de ascensão vertical nas camadas atmosféricas. A coleta de psilídeos a alturas superiores à da copa de plantas cítricas (como 7,5 m) evidencia possíveis movimentos de longa distância, sugerindo que os insetos estejam sendo transportados pelo vento. A análise da ocorrência espaço-temporal de Psylloidea em armadilhas adesivas pode auxiliar na previsão de movimentos a curta e longa distância de D. citri. / Huanglongbing (HLB) is the most limiting disease for the production of Citrus in the world today. The high dissemination capacity of the HLB-associated bacteria may be associated with the movement of the psyllid vector, Diaphorina citri, not only between neighboring groves, but also at long distances. The dispersion behavior analysis in populations of D. citri and other species of Psylloidea was approached through the spatio-temporal analysis of psyllid populations at different heights and plants. The monitoring was carried out in two contexts of the primary spread of HLB, in areas surrounding commercially managed groves in the State of São Paulo. Monitoring at heights was performed using yellow sticky traps allocated at two heights (2.5 and 7.5 m) and a stationery suction-trap. At the monitored points, host plants of D. citri were sampled biweekly by means of a sweep net and a portable suction device. In both contexts a positive correlation was found between the abundance of the species of psyllids in relation to the heights and the seasons of monitoring. In the context of backyard plants, 48.8% of the psyllids were collected at 2.5 m and 51.2% at 7.5m. In the context of poor management groves, 48.4% of the individuals were found at 2.5 m and 51.6% at 7.5 m. A total of 148,802 specimens of psyllids were collected using yellow sticky traps belonging to 6 families and 24 genera. The most frequent and constant species were Heteropsylla sp., Isogonoceraia divergipennis, Mitrapsylla spp., Glycaspis brimblecombei and Trioza sp. In the context of backyard plants the frequency of D. citri at the two sampling heights was 1.5% and on plants was 70.3%. In the context of poor management groves, the frequency of D. citri at the two heights was 0.11% and in plant was 81.8%. The highest density of psyllids occurred from late winter to early summer, but particularly concentrated in the spring in both contexts. Similarly, D. citri showed a population peak in the spring, both in the surrounding areas and on the edge of commercially managed Citrus groves. CLas was detected in 40% of the D. citri individuals found at 7.5 m and in 63.3% of the individuals collected on Citrus plants. The detection of CLas was negative for the other species of Psylloidea collected by yellow sticky traps and on host plants of D. citri. The positive correlation between psyllids collected at 2.5 m and 7.5 m shows possible vertical ascending movements in the atmospheric layers. The collection of psyllids at heights higher than the canopy of Citrus plants (e.g. 7.5 m) shows possible long distance movements, suggesting that the insects are being carried by the wind. The spatio-temporal analysis of Psylloidea in yellow sticky traps may aid in the prediction of short and long distance movements of D. citri.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

Atualmente, o controle da doença Huanglongbing (HLB) ou greening é baseado, principalmente, no controle químico do inseto vetor Diaphorina citri, realizado por meio de aplicações intensivas de produtos químicos, o que vem causando surtos de pragas secundárias, ressurgência de pragas, seleção de população resistente e eliminação dos inimigos naturais. Com esse trabalho, objetivou-se avaliar a possibilidade da utilização da planta de curry (Murraya koenigii) como planta-isca para o manejo do psilídeo D. citri. Para isso, foram realizados os seguintes testes: i) teste de transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' para determinar se a planta de curry não é hospedeira da bactéria; ii) teste de comportamento de escolha, para verificar a preferência hospedeira de D. citri em plantas de curry em relação a citros; iii) teste de comportamento alimentar do psilídeo por meio da técnica de Electrical Penetration Graphs (EPG) em plantas de curry, visando entender a alimentação do inseto nessa planta; iv) seleção de inseticidas sistêmicos para uso em plantas de curry, determinando o período residual e eficiência; e v) teste com plantio-isca em um talhão de citros, no qual foram instaladas plantas de curry em frente as plantas de citros e o psilídeo foi monitorado com o uso de armadilhas adesivas amarelas. Como resultado, observouse que a planta de curry não é hospedeira da bactéria \'Ca. L. asiaticus\' por meio da inoculação pelo psilídeo D. citri, e, em teste de livre escolha e de olfatômetro, é mais atrativa para o psilídeo do que a planta de citros, em condições laboratoriais. O comportamento alimentar do psilídeo em plantas de curry é diferente do que em citros e murta, sendo que o consumo da seiva do xilema em plantas de curry é maior. Além disso, inseticidas aplicados via \'drench\', como thiamethoxam e imidacloprid, nessa planta, são eficientes contra D. citri, pois controlam o psilídeo adulto por mais de 70 dias após a aplicação e, no campo, a captura de espécimes nas parcelas com a planta de curry foi maior, podendo concluir, portanto, que a planta de curry M. koenigii apresenta potencial para ser utilizada como plantio isca para manejo do psilídeo D. citri e, consequentemente, da doença HLB. / Currently, the control of the disease Huanglongbing (HLB) or greening is based mainly on the chemical control of the insect vector Diaphorina citri, through intensive applications of insecticides, which has been causing secondary pest outbreaks, pest resurgence, selection of population resistant and elimination of natural enemies. The goal of this work was to evaluate the possibility of using the curry leaf (Murraya koenigii) as a trap crop for the management of the D. citri. For this, the following tests have been performed: i) Transmission test of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' to determine if the curry leaf is not a host for the bacterium; ii) test of choice behavior, to verify the host preference of D. citri to curry leaves in relation to citrus plants; iii) test of probing behavior in curry leaf using the Electrical Penetration Graphs (EPG) technique, in order to understand the feeding of the insect on this plant; iv) selection of systemic insecticides for use in curry leaf, determining the residual period and efficiency; and v) test with trap crop in a citrus orchard, in which curry plants were installed in front of the citrus plants and the psyllid was monitored with the yellow stick traps. As a result, it has been observed that the curry leaf is not a host to \'Ca. L. asiaticus\' by the D. citri inoculation and, in a free choice and olfactometer test, is more attractive to the psyllid than the citrus plant under laboratory conditions. The probing behavior of the psyllid in curry leaf is different from citrus and orange jasmine, being the ingestion of xylem sap in curry leaf higher. In addition, the insecticides applied by \'drench\' such as thiamethoxam and imidacloprid in these plants are efficient against D. citri for more than 70 days after application and, in the field, the capture of psyllids in the plots with the curry leaf was higher and could therefore conclude that, the curry leaf M. koenigii is a potencial plant to be used as a trap crop for the management of D. citri and consequently, the disease HLB.

A citricultura brasileira é a maior produtora e exportadora de citros e tem sido afetada por doenças que causam sérios prejuízos a produção e a qualidade dos frutos. No entanto, a cultura apresenta grandes problemas, entre eles, os fatores fitossanitários, que vem dizimando milhares de plantas e afetando a produtividade e a competitividade do setor. Atualmente, o huanglongbing (HLB), associado às bactérias de floema Candidatus Liberibacter spp., é considerado uma das mais destrutivas doenças de citros. A inexistência de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de citros uma ferramenta importante no controle desta doença. Para se defender do ataque de pragas e patógenos as plantas desenvolveram, durante o processo evolutivo, uma série de mecanismos de defesa, no qual pode-se incluir a produção de peptídeos com atividade antimicrobiana. As defensinas vegetais são peptídeos pequenos relacionadas à patogênese (PR), que possuem atividade antimicrobiana associada aos mecanismos de defesa das plantas. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis L.) cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' e \'Pera\', via Agrobacterium tumefaciens, superexpressando o gene codificador de defensina (def), isolado de Citrus sinensis cv. \'Valência\', dirigido pelo promotor com expressão preferencial no floema AtSUC2 (transportador de sacarose, clonado de Arabidopsis thaliana) ou pelo promotor constitutivo CaMV 35S (clonado do vírus do mosaico da couve-flor). Os explantes utilizados na transformação genética foram segmentos de epicótilo obtidos de plantas germinadas in vitro. A identificação das plantas transgênicas foi realizada por meio da análise da PCR, utilizando-se primers para a detecção do fragmento do gene de seleção nptII. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A análise de Southern blot confirmou a integração do transgene em 36 plantas. Foram obtidas 7 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 9 da cultivar \'Natal\', 1 da cultivar \'Pera\' e 9 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pC35S/def, e 3 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Natal\' e 1 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pcAtSUC2/def. Os resultados obtidos neste trabalho serão importantes para futura avaliação e estudo visando o controle de Candidatus Liberibacter spp.. / The Brazilian citrus industry is the world\'s largest producer and exporter of citrus, however, it has been affected by diseases that cause serious production losses and damages to fruit quality. However, the culture faces problems, namely phytosanitary issues that have been damaging thousands of plants, affecting yield and competitiveness of the sector. Currently, Huanglongbing (HLB), associated with phloem bacteria Candidatus Liberibacter spp., is considered one of the most destructive citrus diseases. The lack of sweet orange cultivars resistant to HLB makes genetic transformation an important tool in the disease control. To defend from pest and pathogen attack, plants developed a series of defense mechanisms during the evolutionary process, which may include the production of peptides with antimicrobial activity. Plant defensins are small peptides related to pathogenesis (PR) which have antimicrobial activities, associated with plant defense mechanisms . The objective of this study was to obtain transgenic plants of sweet orange (Citrus sinensis L.) cultivars \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' and \'Pera\' with Agrobacterium tumefaciens overexpressing the defensin gene (def), isolated from Citrus sinensis cv. \'Valência\', controlled by the promoter with preferential expression in the phloem AtSUC2, (sucrose transporter, cloned from Arabidopsis thaliana) or by the constitutive promoter CaMV 35S (cloned from the mosaic virus of cauliflower). The explants used in genetic transformation were epicotyl segments obtained from germinated plants in vitro. The identification of transgenic plants was accomplished by PCR analysis using primers for the detection of nptII gene fragment. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to greenhouse. The analysis of Southern blot confirmed the transgene integration in 36 plants. Seven transgenic plants were obtained for the cultivar \'Hamlin\', nine for \'Natal\', one for \'Pera\' and nine for \'Valência\' containing the gene construct pC35S/def and three transgenic plants for \'Hamlin\', six for \'Natal\' and one for \'Valência\' containing the gene construct pcAtSUC2/def. The results obtained in this work are important for future evaluation of the plants for resistance to Candidatus Liberibacter spp..

Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.