Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T19:54:22Z No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-30T22:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-30T22:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Sclerotinia sclerotiorum é um fungo necrotrófico, que causa uma doença devastadora denominada mofo branco, responsável por infectar mais de 450 espécies de plantas por todo o mundo. Sendo muito difícil seu controle por fungicidas. Desta forma, o uso de plantas hospedeiras com níveis adequados de resistência é a melhor alternativa para o manejo da doença. Entretanto, devido à natureza da doença, programas de melhoramento tem tido sucesso limitado. Uma alternativa para o desenvolvimento de resistência a um fungo necrotrófico é o uso da estratégia de HIGS (Silenciamento Gênico Induzido pelo Hospedeiro), que envolve a expressão de construções no hospedeiro, gerando dsRNA dirigidos para silenciar genes do patógeno. O alvo escolhido foi o gene que codifica para quitina sintase (chs), que determina a síntese de quitina, um polissacarídeo que é componente estrutural crucial na parede celular de diversos fungos. Plantas de fumo foram transformadas com uma construção do tipo intron-hairpin para silenciamento do gene chs do fungo. Cinco linhagens de plantas transformadas demonstraram uma redução na severidade da doença 72 horas após a inoculação, variando de 55,5% a 86,7% quando comparadas a linhagens não transgênicas. A área da lesão não mostrou extensivo progresso com o passar do tempo (até 120h) em linhagens transgênicas. Resistência à doença e silenciamento do gene chs do fungo teve uma correlação positiva com a presença de siRNAs detectáveis em linhagens transgênicas. Demonstrou-se que genes endógenos do fungo necrotrófico muito agressivo, S. sclerotiorum pode ser silenciado induzido pelo hospedeiro. HIGS do gene da síntese de quitina de fungo pode gerar plantas tolerantes à mofo branco. Do ponto de vista biotecnológico, nossos resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes a fungos necrotróficos patogênicos. / Sclerotinia sclerotiorum is a necrotrophic fungus, which causes a devastating disease called white mold, infecting more than 450 plant species worldwide. Its control with fungicides is difficult. Thus, the use of adequate levels of host-plant resistance is the best alternative for disease management. However, due to the nature of the disease, breeding programs have had limited success. A potential alternative to developing necrotrophic fungal resistance is the use of the host-induced gene silencing (HIGS) methods, which involves host expression of dsRNAgenerating constructs directed against genes in the pathogen. We chose as a target the gene coding for chitin synthase (chs) that is involved in the synthesis of chitin, the polysaccharide that is a crucial structural component of the cell walls of many fungi. Tobacco plants were transformed with an interfering intron-hairpin construct for silencing the chs fungal gene. Five transgenic lines showed a reduction in disease severity 72 h after inoculation ranging from 55.5% to 86.7% compared with the non-transgenic lines. The lesion area did not show extensive progress over this time (up to 120h). Disease resistance and silencing of the chs fungal gene was positively correlated with the presence of detectable siRNA in the transgenic lines. It was demonstrated that endogenous genes from the very aggressive necrotrophic fungus S. sclerotiorum can be silenced induced by the host. HIGS of the fungal chitin synthase gene can generate white mold-tolerant plants. From a biotechnological perspective, our results open new prospects for the development of transgenic plants resistant to necrotrophic fungal pathogens.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T15:47:56Z No. of bitstreams: 1 2014_IsabelaTristanLourenco.pdf: 2883653 bytes, checksum: 35a2b51e36c41ba42ef4670be0ea96c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-22T15:24:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_IsabelaTristanLourenco.pdf: 2883653 bytes, checksum: 35a2b51e36c41ba42ef4670be0ea96c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T15:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_IsabelaTristanLourenco.pdf: 2883653 bytes, checksum: 35a2b51e36c41ba42ef4670be0ea96c3 (MD5) / O fitonematoide Meloidogyne incognita é considerado um dos patógenos de plantas mais relevantes devido a sua distribuição mundial e os danos severos causados a várias culturas importantes agronomicamente. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o metabolismo e desenvolvimento do nematoide. No presente trabalho foram selecionados dois genes-alvo homólogos a genes essenciais do nematoide modelo Caenorhabditis elegans para silenciamento gênico de M. incognita in planta: Isocitrato liase e hsp90. Visando a validação desses genes, para o controle deste fitonematoide, os fragmentos gênicos foram isolados e clonados em um vetor binário para expressão de dsRNA in planta. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo as construções de RNAi foram obtidas através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas expressando dsRNA de hsp90 apresentaram uma atraso na formação de galhas e menor número de células gigantes, observado aos 14 DAI. Os bioensaios com as plantas de tabaco GM nas gerações T1 e T2 mostraram os efeitos do silenciamento dos genes-alvo na reprodução do nematoide. Os testes de resistência mostraram, 45 DAI, uma redução média de 65% nos ovos por grama de raiz nas plantas expressando dsRNA de Isocitrato liase e redução média de 30% nas plantas expressando dsRNA de hsp90. A análise do silenciamento de hsp90 em ovos coletados das plantas expressando dsRNA foi confirmada por qRT-PCR. Em conclusão, genes-alvo com efeitos essenciais foram encontrados, exercendo papel importante no desenvolvimento e reprodução do nematoide. Portanto, essa metodologia pode ser utilizada como uma ferramenta biotecnológica para indução de resistência ao fitonematoide M. incognita em grandes culturas de interesse comercial. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The phytonematode Meloidogyne incognita is considered the most important plant pathogen, because its worldwide distribution and the severe damage caused to a large variety of agronomically important crops. The phytopathogen has a life cycle that is divided in six developmental stages (Egg, Juvenile 1-4, Female) that can persist for 6 to 8 weeks. The Juvenile 2 enters the root using mechanical force and enzymatic degradation to establish the plant-pathogen interaction that finally differentiates in female that deposit 2,000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, we selected target genes for silencing homologues lethal genes of the model nematode Caenorhabditis elegans. Aiming validation of these target genes, the fragments were isolated, cloned in RNAi binary vector for tobacco transformation via Agrobacterium tumefaciens. After this, tobacco seeds were collected and genotyped to select the transformed ones. Bioassays on GM tobacco showed the effects of silencing in the nematode reproduction. The resistance tests conducted with GM tobacco at 45 DAI showed a reduction of 65% in eggs per root gram in transgenic lines of Isocitrate lyase and 30% in transgenic lines of hsp90. In conclusion, we found new target genes that showed deleterious phenotype in nematodes. Therefore, this methodology can be used as a promising biotechnological tool to induce nematode resistance in GM crops.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-11T14:41:32Z No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) Previous issue date: 2008-10 / Fitonematóides são responsáveis por grandes perdas econômicas na agricultura mundial estimadas em US$ 125 bilhões anuais. Esses fitopatógenos têm seu ciclo de vida dividido em seis estádios de desenvolvimento (ovo, juvenil 1-4 e adulto), durando em torno de 28 dias. O juvenil 2 penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para estabelecer a interação planta-patógeno e se diferenciar em fêmea adulta apomítica, depositando em torno de 2000 ovos. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o parasitismo. A metodologia de RNA interferente tem revolucionado a pesquisa experimental e muitas aplicações biotecnológicas estão sendo desenvolvidas. A abordagem planejada é a transformação genética de icotiana tabacum com construções plasmidiais para expressão de RNA dupla fita, tendo como propósito o silenciamento dos genes-alvo Isocitrato Liase, Arginina Quinase, Proteína 14-3-3 e Proteína de choque térmico 90 de Meloidogyne incognita. Desses genes-alvo, quatro fragmentos gênicos foram selecionados, isolados, subclonados em vetor para RNAi e estão em fase de transformação de planta, para futura realização de bioensaios avaliação de resistência a fitonematóides. Adicionalmente, foi realizada uma análise da expressão dos quatro genes-alvo, normalizados com os genes constitutivos de β- actina e 18S rRNA, por PCR quantitativo em tempo real. Observou-se que alguns genes-alvo são diferencialmente expressos quando comparados as fases de ovo, juvenil 2 e fêmea. A maior diferença de expressão foi do gene codificador de Isocitrato Liase, que é 100 vezes mais expresso em ovo e fêmeas, comparado com J2. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant parasitic nematodes are responsible for huge economic losses in world agriculture that reaches US$ 125 billion yearly. The most important of these phytopatogens, Meloidogyne incognita, has six developmental stages during the life cycle (egg, four juveniles and female). The juvenile 2 enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation to establish the host-pathogen interaction and differentiate in apomitic adult female, which deposits 2000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, it was chosen to transform icotiana tabacum using plasmidial constructions for double strand RNA expression, aiming silencing target genes Isocitrate Lyase, Arginine Kinase, 14-3-3 Protein and Heat Shock Protein 90 of Meloidogyne incognita. Four regions of target genes were selected, isolated, subcloned in RNAi vector and are being used for plant transformation. In addition, it was done an expression analysis of the four target genes, normalized with housekeeping genes β- actin e 18S rRNA, using quantitative real time PCR. This experiment showed that these genes are differentially expressed when compared during egg, J2 and female phases. The major expression difference observed was the Isocitrate Lyase gene, which is a hundred times more expressed in egg or female when compared with J2.

LIMA, A.B.de. Respostas Oxidativas em Plantas de Arroz Duplamente Silenciadas em APX Citosólica Submetidas a Estresses Abióticos. 117 f. 2011. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T18:54:07Z No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) Previous issue date: 2011 / O H2O2 é tido como molécula sinalizadora de vários eventos celulares e seu nível endógeno é controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estão distribuídas na célula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosólicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas são as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinação de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulação positiva da atividade de APX associada com menor acúmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosólica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condições controle. Em condições estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatório mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosólica e cloroplástica juntamente com antioxidantes não enzimáticos. Além disso, as APx1/2s submetidas a inibição irreversível de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintético e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosólica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatórios foram ativados para mitigar os possíveis efeitos negativos do acúmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosólicas de APX não são as enzimas mais importantes no controle dos níveis de H2O2, visto que plantas com ausência destas isoformas completam o ciclo de vida e são capazes de enfrentar situações de estresse. Além disso, é possível afirmar que a ação coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsáveis pela manutenção do equilíbrio redox celular em condições estressantes em plantas de arroz, diferente do que é noticiado para a planta-modelo Arabdopsis.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T18:35:05Z No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T18:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus da hepatite A (HAV) possui genoma RNA de fita simples de 7,5 Kb e polaridade positiva. Este vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Hepatovirus, com propriedades biológicas únicas, em particular, o crescimento lento em cultura celular com ausência de efeito citopático. O HAV causa uma infecção autolimitada normalmente com pouco ou nenhum sintoma em pacientes jovens (abaixo de 5 anos). Já em pacientes adultos, sintomas graves podem aparecer com 1% dos casos podendo evoluir para uma hepatite fulminante. A inibição da replicação viral pode retardar a infecção pelo vírus prevenindo uma hepatite fulminante. Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que agem com base na degradação seqüência-específica do genoma, pode constituir uma nova estratégia para a inibição específica de vários tipos de vírus. A interferência por siRNA é um processo onde fitas duplas de RNA (dsRNA) são capazes de silenciar as funções específicas de um gene alvo. A via de siRNA pode ser induzida em células por transfecção de oligômeros sintéticos de 21-23 nucleotídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento produzido por três seqüências específicas de siRNAs, uma para região 2C (helicase), e duas para 3D (protease) do genoma do HAV. Vinte e quatro horas antes da transfecção, células FRHK-4 foram cultivadas em placas de 24 poços, com meio 199 e densidade de 10 5 células por poço. Em seguida, as células foram transfectadas por 4 horas com cada siRNA e suas combinações. Após isto, as células foram infectadas com o HAV (10 5 cópias/ml) e cultivadas por cinco dias consecutivos à 37°C. Seqüências não-específicas foram utilizadas como controle negativo. O RNA total foi extraído e a análise foi realizada por RT-PCR, sendo o silenciamento confirmado por imunofluorescência. Todas as seqüências mostraram-se com capacidade inibitória. A melhor taxa de silenciamento ocorreu no segundo dia com as três sequências em conjunto, atingindo 85% de inibição da replicação viral. Tal resultado foi confirmado pela diminuição da intensidade da fluorescência para o HAV. As combinações foram mais eficazes do que cada sequência utilizada isoladamente. Os siRNAs foram eficazes na diminuição da expressão da helicase e protease do HAV / Hepatitis A virus (HAV) has a single-stranded RNA genome of 7.5 kb with positive polarity.This virus belongs the Picornaviridae family, genus Hepatovirus with unique biological properties, in particular, slow growth in cell culture without cytopathic effect. HAV causes a self-limiting liver infection with usually mild or no symptoms in young patients. Whereas adult patients might suffer from severe symptoms and 1% of cases can evolue to fulminant hepatitis. Inhibition of viral replication can improve viral infection and thus prevent fulminant failure. Small interference RNA (siRNA) based on specific sequence may present a novel and specific approach strategy for inhibit of various types of virus. RNA interference is a process by double-stranded (dsRNA) is able to silence specific gene functions. The siRNA pathway can be induced in mammalian cells by transfection of short synthetic sequence-specific oligomers with 21-23 nucleotides. The aim of this study was to evaluate the silencing produced by three specific sequences of siRNAs, one for region 2C (helicase), and two for 3D (protease) of the HAV. Twenty-four hours before transfection, FRHK-4 cells were cultivated in 24-well plate in 199 medium with density of 10 5 cells per well. After that, cells were transfected for 4 hours with each siRNA and its combinations following by infection with HAV (10 5 cópies/ml) and grown for five consecutive days. Non-specific sequences were used as negative control. The total RNA was extracted (with commercial kit) and analysis was performed by RT-PCR and silencing was confirmed by immunofluorescence. All sequences showed inhibitory capacity. The best silencing occurred in the second day using the three sequences together reaching 85% of inhibition viral replication. This result was confirmed with the decrease in fluorescence intensity for HAV. The combination of the sequences was more effective than the sequences used alone. The siRNAs could knockdown the expression of helicase and protease of HAV

Orientador: Jayme Augusto de Souza Neto / Resumo: Aedes aegypti é a espécie de mosquito emergente em áreas urbanas com maior impacto na saúde pública, sendo o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya. Por esse motivo, se faz indispensável a compreensão de mecanismos moleculares associados a processos fisiológicos em A. aegypti, como resposta imune, comportamento e homeostase intestinal. Conforme observado em outros organismos, a via PI3K/AKT tem papéis importantes no metabolismo, na reprodução, na tolerância ao estresse e na imunidade. A quinase AKT atua como um regulador negativo da via PI3K/AKT, fosforilando o fator de transcrição FOXO e impedindo sua translocação nuclear. Nosso objetivo foi avaliar o perfil transcricional em A. aegypti com o gene akt silenciado e avaliar as consequências deste silenciamento sobre a microbiota bacteriana. Além disso, investigamos uma provável ativação mitocondrial quando do silenciamento de akt. Mostramos que o silenciamento de akt resultou na ativação de genes essenciais para a manutenção da homeostase intestinal do mosquito, como peptídeos antimicrobianos (AMPs) e genes codificadores de enzimas associadas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Notavelmente, observou-se uma forte repressão de 11 profenoloxidases (PPOs), além de uma potente indução de genes codificadores de subunidades da enzima NADH desidrogenase, em comparação com o respectivo grupo controle, sugerindo que tal indução esteja associada a um provável aumento da atividade mitocondrial. No context... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aedes aegypti is the emerging mosquito species in urban areas with the greatest impact on public health, being the main vector of arboviruses dengue, Zika and chikungunya. For this reason, it is essential to understand the molecular mechanisms associated with physiological processes in A. aegypti, such as immune response, behavior and intestinal homeostasis. As observed in other organisms, the PI3K / AKT pathway has important roles in metabolism, reproduction, stress tolerance and immunity. AKT kinase acts as a negative regulator of the PI3K / AKT pathway, phosphorylating the FOXO transcription factor and preventing its nuclear translocation. Our objective was to evaluate the transcriptional profile in A. aegypti with the silenced akt gene and to evaluate the consequences of this silencing on the bacterial microbiota. In addition, we investigated a possible mitochondrial activation during the akt silencing. We have shown that akt silencing resulted in the activation of essential genes for the maintenance of mosquito intestinal homeostasis, such as antimicrobial peptides (AMPs) and genes encoding enzymes associated with the production of reactive oxygen species (ROS). Notably, a strong repression of 11 profenoloxidases (PPOs) was observed, as well as a potent induction of genes encoding subunits of the NADH dehydrogenase enzyme, in comparison with the respective control group, suggesting that such induction is associated with a possible increase in mitochondrial activity. In t... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: capítulos I, II e III. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T16:49:59Z No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-20T12:06:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T12:06:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / O algodão é uma das principais commodities da economia brasileira, alavancando o País ao posto de quinto maior produtor mundial. Entre as diferentes pragas da cotonicultura, o bicudo-do-algodoeiro é o inseto-praga mais destrutivo. Pela biotecnologia, um dos métodos alternativos de controle de insetos-praga é o silenciamento gênico, por meio do RNA interferente. Contudo, em insetos, absorção do RNA fita dupla (dsRNA) produzidos por plantas é dificultada, principalmente em decorrência da clivagem do dsRNA na planta e da ação de nucleases presentes no intestino dos insetos. Assim, os objetivos do presente estudo foram estudar o papel de nucleases intestinais de Anthonomus grandis na degradação do dsRNA e aumentar a estabilidade das moléculas de dsRNA. Primeiramente, a atividade nucleásica ácida foi detectada no homogenato intestinal de A. grandis. Por meio da busca no transcritoma de A. grandis foram encontradas três contigs codificadores de nucleases, denominados AgNuc1, AgNuc2 e AgNuc3, cujas sequências foram caracterizadas e validadas por RNAi. As três sequências apresentaram similaridade acima de 50 % em relação às outras nucleases de insetos. A análise por qPCR demonstrou que AgNuc2 e AgNuc3 foram altamente expressas no intestino de A. grandis. O silenciamento específico de AgNuc2 culminou na redução da degradação do dsRNA; demonstrando ser a principal nuclease associada à degradação de dsRNA no lúmen intestinal de A. grandis. Além disso, visando aumentar a estabilidade do dsRNA, foram desenhados dsRNAs, baseados na arquitetura de viróide, que são resistentes à ação de nucleases. A análise do movimento de dsRNA-viróide marcado com Cy3 no sistema vascular de Arabidopsis thaliana demonstrou uma localização celular específica para a estrutura do dsRNA. O dsRNA baseado na arquitetura da família Pospiviroidae, foi localizado no núcleo das células, enquanto que o dsRNA, baseado na arquitetura da família Avsunviroidae, foi localizado nos cloroplastos das células. Os dsRNAs estabilizados mostraram uma capacidade de silenciamento gênico 8 vezes superior, quando comparado ao dsRNA linear não estruturado Os dados aqui gerados contribuem para o conhecimento do mecanismo de RNAi em insetos e demonstram que as moléculas de dsRNA estabilizados apresentam grande potencial para a aplicabilidade da tecnologia do RNAi visando o controle de insetos-praga. / Cotton is one of the most important Brazilian commodities and Brazil is the fifth largest world producer. Nonetheless, productivity is constantly crippled by a variety of agricultural pests. Among the different cotton insect pests, cotton boll weevil is the most destructive. By using biotechnology strategies, one of the alternative methods for controlling crop pests is gene silencing through RNA interference. However, in insects, the absorption of double stranded RNA produced by plants is hampered due to dsRNA cleavage in plants tissues and due to the presence of insect gut nucleases. In this context, the objects of this study were to investigate the dsRNA degradation by Anthonomus grandis gut nucleases and improve the stability of dsRNA. Nucleasic activity was detected in A. grandis intestinal homogenate. After searching in A. grandis transcriptome, three contigs codifying nucleases were found, called AgNuc1, AgNuc2 and AgNuc3, whose sequences were characterized and validated by RNAi. The three sequences showed similarity above 50% when compared to other insect nucleases. qPCR analysis showed that AgNuc2 and AgNuc3 are highly expressed in A. grandis midgut. AgNuc2 gene silencing resulted on reduction of dsRNA degradation; thereby, we concluded that AgNuc2 is the main nuclease associated with dsRNA degradation in A. grandis gut lumen. Additionally, in order to increase dsRNA stability, dsRNA with viroid architecture were designed, wich are resistant to plant nucleases. Viroid-dsRNA were marked with Cy3 and analysed regarding their movement in A. thaliana vascular system, wich showed that they are adressed to a specif cellular localization. dsRNA based on Pospiviroidae family architecture was located on cell nuclei while dsRNA based on Avsunviroidae family was located in chloroplasts. Moreover, these stabilized dsRNAs showed high gene silencing activity, eight times higher than linear dsRNA. The data here generated contribute to our understandings of RNAi mechanisms in insects and show that stabilized dsRNAs exhibit great pontential in RNAi applicability aiming crop insect pest control.

Submitted by BRUNO TINOCO NUNES (croookes@gmail.com) on 2018-09-25T16:26:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_Bruno_Tinoco_25_09_2018.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Outra / Aedes aegypti é a espécie de mosquito emergente em áreas urbanas com maior impacto na saúde pública, sendo o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya. Por esse motivo, se faz indispensável a compreensão de mecanismos moleculares associados a processos fisiológicos em A. aegypti, como resposta imune, comportamento e homeostase intestinal. Conforme observado em outros organismos, a via PI3K/AKT tem papéis importantes no metabolismo, na reprodução, na tolerância ao estresse e na imunidade. A quinase AKT atua como um regulador negativo da via PI3K/AKT, fosforilando o fator de transcrição FOXO e impedindo sua translocação nuclear. Nosso objetivo foi avaliar o perfil transcricional em A. aegypti com o gene akt silenciado e avaliar as consequências deste silenciamento sobre a microbiota bacteriana. Além disso, investigamos uma provável ativação mitocondrial quando do silenciamento de akt. Mostramos que o silenciamento de akt resultou na ativação de genes essenciais para a manutenção da homeostase intestinal do mosquito, como peptídeos antimicrobianos (AMPs) e genes codificadores de enzimas associadas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Notavelmente, observou-se uma forte repressão de 11 profenoloxidases (PPOs), além de uma potente indução de genes codificadores de subunidades da enzima NADH desidrogenase, em comparação com o respectivo grupo controle, sugerindo que tal indução esteja associada a um provável aumento da atividade mitocondrial. No contexto comportamental, o transcriptoma de A. aegypti com o gene akt silenciado revelou a modulação de 5 odorant binding proteins (OBPs), das quais todas foram reprimidas no quarto dia após o silenciamento de akt. Além das OBPs, identificamos duas long wavelengh sensitive opsins, ambas reprimidas após dois e quatro dias. Interessantemente, observamos que, dos 345 genes modulados, a grande maioria foi regulada negativamente. O silenciamento de akt, além de modular a carga da microbiota bacteriana de A. aegypti, também modulou táxons específicos após quatro dias de silenciamento, como as Classes Gammaproteobacteria e Betaproteobacteria. Nosso conjunto de dados coloca a via PI3K/AKT no cerce de importantes processos fisiológicos, contribuindo para elucidar mecanismos moleculares até então pouco compreendidos do mosquito. / Aedes aegypti is the emerging mosquito species in urban areas with the greatest impact on public health, being the main vector of arboviruses dengue, Zika and chikungunya. For this reason, it is essential to understand the molecular mechanisms associated with physiological processes in A. aegypti, such as immune response, behavior and intestinal homeostasis. As observed in other organisms, the PI3K / AKT pathway has important roles in metabolism, reproduction, stress tolerance and immunity. AKT kinase acts as a negative regulator of the PI3K / AKT pathway, phosphorylating the FOXO transcription factor and preventing its nuclear translocation. Our objective was to evaluate the transcriptional profile in A. aegypti with the silenced akt gene and to evaluate the consequences of this silencing on the bacterial microbiota. In addition, we investigated a possible mitochondrial activation during the akt silencing. We have shown that akt silencing resulted in the activation of essential genes for the maintenance of mosquito intestinal homeostasis, such as antimicrobial peptides (AMPs) and genes encoding enzymes associated with the production of reactive oxygen species (ROS). Notably, a strong repression of 11 profenoloxidases (PPOs) was observed, as well as a potent induction of genes encoding subunits of the NADH dehydrogenase enzyme, in comparison with the respective control group, suggesting that such induction is associated with a possible increase in mitochondrial activity. In the behavioral context, the A. aegypti transcriptome with the mutated akt gene revealed the modulation of 5 odorant binding proteins (OBPs), all of which were repressed on the fourth day after akt silencing. In addition to the OBPs, we identified two long wavelengh sensitive opsins, both repressed after two and four days. Interestingly, we observed that of the 345 modulated genes, most were down-regulated. The silencing of akt, besides modulating the bacterial microbiota load of A. aegypti, also modulated specific taxa after four days of silencing, such as the Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria classes. Our data set puts the PI3K / AKT pathway in the vicinity of important physiological processes, contributing to elucidate the mosquito's poorly understood molecular mechanisms.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-06-13T18:57:55Z No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Transcritos de RNA auto complementar formam um RNA dupla fita (dsRNA) que aciona uma degradação de uma seqüência específica de RNA mensageiro (mRNA), em um processo conhecido como RNA (RNAi) interferente levando ao silenciamento gênico. Em plantas vasculares, o tráfico de moléculas de RNAi ocorre entre células e sistemicamente por toda a planta. Sinais de RNAi pode espalhar sistematicamente ao longo de uma planta, mesmo em enxertos transgênicos sobre cavalos não-transgênicos. Há também um grande interesse na aplicação do RNAi para fungos patogênicos. A inibição específica da expressão gênica por RNAi tem se mostrado adequado para uma grande variedade de fungos filamentosos fitopatogênicos, no entanto, o silenciamento por dsRNA / siRNA não foi observado in vivo. Este estudo demonstra pela primeira vez o fenômeno de interferência in vivo no fungo patogênico Fusarium verticillioides, em que a expressão de um transgene foi especificamente silenciado pela inoculação de células do micélio em plantas transgênicas de fumo transformadas geneticamente para expressar pequenos RNAs de interferência (siRNA) a partir de um dsRNA correspondente ao transgene. Estas resultados fornecem uma poderosa ferramenta para estudos sobre a interação molecular plantapatógenos, e interações simbióticas. Do ponto de vista biotecnológico, silenciamento de genes de fungos por geração de siRNAs no hospedeiro fornece uma nova ferrameta para o desenvolvimento de estratégias de resistência de fungos nas plantas e outros organismos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Self-complementary RNA transcripts form a double-stranded RNA (dsRNA) that triggers a sequence-specific mRNA degradation, in a process known as RNAinterference (RNAi), leading to gene silencing. In vascular plants, RNAi molecules trafficking occur between cells and systemically throughout the plant. RNAi signals can spread systemically throughout a plant, even across graft junctions from transgenic to non-transgenic stocks. There is also a great interest in applying RNAi to pathogenic fungi. Specific inhibition of gene expression by RNAi has been shown to be suitable for a multitude of phytopathogenic filamentous fungi; however, dsRNA/siRNA silencing effect has not been observed in vivo. This study demonstrates for the first time the in vivo interference phenomenon in the pathogenic fungus Fusarium verticillioides, in which expression of an individual fungal transgene was specifically abolished by inoculating mycelial cells in transgenic tobacco plants engineered to express small interfering RNAs (siRNA) from a dsRNA corresponding to the particular transgene. The results provide a powerful tool for further studies on molecular plant-microbe and symbiotic interactions. From a biotechnological perspective, silencing of fungal genes by generating siRNAs in the host provides a novel strategy for the development of broad fungi-resistance strategies in plants and other organisms.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.